Microscopía óptica de dispersión basado en dos dimensiones filtros Gabor

En este vídeo, se utiliza la microscopía óptica de dispersión para cuantificar la fragmentación mitocondrial durante la apoptosis. Aunque la microscopía óptica de dispersión normalmente no requiere fluorescencia en este protocolo, se adquirirán imágenes fluorescentes con fines de validación. Después de la configuración del sistema de imágenes, las células se marcan con MIT tracker green y se tratan con esporina stor para inducir la apoptosis.

Se adquieren datos ópticos para detectar cambios en la orientación de los orgánulos celulares en dos horas. El inicio de la fragmentación mitocondrial se puede medir utilizando los datos ópticos dispersos, que muestran una disminución en el grado de orientación de las partículas subcelulares. A continuación, los datos se validan correlacionando los datos ópticos dispersos con las regiones fluorescentes que contienen mitocondrias.

Hola, soy Nada Bustani, del Laboratorio de Bioóptica del Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Rutgers. Soy Rob Pak del Bio Optics Lab, y también soy Deen de Bio Lab. Hoy te mostraremos un procedimiento para cuantificar la dinámica morfológica subcelular utilizando un método que no se basa en colorantes fluorescentes.

Utilizamos esta técnica en nuestro laboratorio para estudiar los cambios dinámicos en la estructura subcelular durante la apoptosis o la muerte celular programada. Así que comencemos. Comience este procedimiento esterilizando las manos enguantadas con etanol al 70%.

A continuación, coloque una solución madre preparada de 100 nano molares de medio de cultivo celular BAEC tracker verde y precalentado en la campana con la luz apagada y esterilice todas las superficies. A continuación, coloque un plato de cultivo de seis pocillos con células colocadas en un vidrio de cubierta debajo del capó. Usando una pipeta de pasta conectada a una línea de vacío.

Retire el medio celular de los pocillos. A continuación, añada inmediatamente dos mililitros del medio marcado a cada pocillo para marcar las células. Mitocondria. Cubra la placa de cultivo de tejidos para evitar la exposición a la luz directa de la habitación y vuelva a colocar rápidamente las células en la incubadora.

Incubar durante 45 minutos a 37 grados centígrados mientras se incuban las células. Prepare la configuración óptica primero, encienda la abrazadera de arco de mercurio. Luego encienda las cámaras de microscopio de la computadora y el enchufe láser en el dispositivo de micro espejo digital o DMD en el difusor giratorio.

A continuación, mire a través del ocular del microscopio para ver si el lanzamiento óptico está alineado. El campo de visión debe estar brillantemente iluminado por luz láser. Para cargar la muestra, coloque una o dos gotas pequeñas de aceite de inmersión sobre un objetivo de inmersión de aceite de 63 x mientras está completamente abajo.

Luego, en el escenario, monta una corredera que consiste en una cuadrícula de líneas a intervalos regulares de 10 micrómetros llamada gradi, y eleva el objetivo para que el aceite lo capte. A continuación, enfoque el borde hexagonal del campo del condensador. Deténgase para que quede alineado con la iluminación central de Kohler.

El borde hexagonal debe estar centrado en el ocular y enfocado nítidamente. Luego, usando las perillas de posición de parada del campo del condensador en el centro, el campo del condensador, se detiene sobre el campo de visión. Inicie el laboratorio de IP e ingrese la configuración para operar la cámara.

Confirme que la cámara está configurada en el modo de transferencia de fotogramas. Ejecute el comando adquirir foco para iniciar la vista previa en vivo. A continuación, establezca el prefijo de índice y la ubicación del archivo en el que se guardarán las imágenes.

A continuación, inicie la imagen RS. Designe los ajustes para operar la cámara de instantánea fría. El modo de temporización debe establecerse en normal.

Inicie el software DMD. Coloque el iris de campo oscuro en el menú de script. A continuación, haga clic en cargar y restablecer.

Para ejecutar el script manualmente, establezca la barra de óptica del microscopio en la ventana gráfica en LSM. Esto enviará la imagen a través del DMD en la óptica alineada. Proyección de la imagen de campo oscuro en el CCD de la cámara Cascade five 12.

La imagen de campo oscuro debería aparecer en la vista previa en vivo en IP lab. Si es necesario, enfoque la imagen en la vista previa en vivo. Ajuste el tiempo de exposición lo suficientemente alto como para garantizar al menos 10.000 recuentos de señal en la imagen.

A continuación, tome una instantánea del campo de visión utilizando el comando único adquirir después de la adquisición. Utilice el comando guardar como indexado para guardar la imagen en el disco. La imagen del GTI mide el tamaño del campo de visión.

Ahora mueva la muestra GTI para que esté más allá del campo de visión y solo se vea el fondo. Capture una imagen de fondo del campo con un tiempo de exposición suficiente para adquirir al menos 5.000 recuentos. Esta imagen ayudará en la sustracción de fondo de las imágenes sin filtrar.

Ahora, para adquirir imágenes filtradas de Gabor del fondo, cargue el script del banco de filtros de Gabor en el software de control DMD. Ejecute todo el script para almacenar en búfer los filtros en la memoria integrada del DMD. Esto puede tardar unos minutos una vez que todo el script se almacena en búfer.

Utilice los marcadores de inicio y parada dentro del software DMD para asegurarse de que solo se cargue un conjunto de filtros correspondientes a un filtro Gabor Like a la vez. Ejecute el script para adquirir imágenes filtradas del fondo. La vista previa de la imagen en vivo debe cambiar de campo oscuro a la imagen filtrada.

Para ese filtro, abra el script de adquisición en IP lab desde el disco. Ajuste el tiempo de exposición para asegurarse de que se adquieren al menos 2000 recuentos. A medida que se ejecuta el script DMD, cancele la vista previa en vivo en IP lab y ejecute el script de adquisición.

Esto adquirirá automáticamente el índice y guardará la imagen filtrada en el disco. Una vez adquirida la primera imagen, detenga la ejecución del script en DMD. Elimine los comandos utilizados del script.

A continuación, sustituya los marcadores de inicio y parada al principio y al final del siguiente conjunto de filtros. Repita la adquisición en IP lab hasta que se haya utilizado todo el banco de filtros y se hayan adquirido y guardado todas las imágenes filtradas. Prepárese para revestir las celdas enchufando un soldador en la mesa de laboratorio y calentando el medio L 15 a 37 grados centígrados.

Haga una estación de trabajo con una toalla de papel y una toallita Kim para absorber cualquier medio derramado y mantener el área limpia. Prepare varias mechas rasgando y girando toallitas de kimm. Las mechas se utilizarán para extraer el fluido a través de la placa de la celda.

A continuación, utilice el portamuestras metálico para crear un sándwich de celdas. Use una jeringa para aplicar una gota delgada de grasa de vacío alrededor de la periferia superior del orificio en la placa de metal mecanizada, extendiéndose aproximadamente hasta la mitad de los extremos de las ranuras a cada lado. Pase suavemente un deslizamiento limpio de la cubierta número uno sobre la grasa.

Dale la vuelta a la placa y aplica la grasa alrededor del agujero. Apague las luces de la habitación con guantes de examen de prueba de NI esterilizados con etanol. Recupera las células de la incubadora.

Retire el cubreobjetos que se utilizará para el experimento de la placa de seis pocillos. Seque con cuidado el cubreobjetos. A continuación, presione la tapa con el lado de la celda deslizante hacia abajo en la placa metálica engrasada sobre el orificio de visualización.

Intercalando las celdas dentro de la placa. Asegúrese de que no queden espacios de aire y de que la grasa haya formado un sello hermético para que se pueda cargar el medio. Ahora voltee la placa pipeteando 200 microlitros a la vez.

Agregue el medio precaliente L 15 en el sándwich a través de la ranura entre el cubreobjetos superior y la placa de metal hasta que el líquido casi llegue a la ranura del otro lado. A continuación, lave las celdas sosteniendo una mecha en la ranura opuesta y pipeteando 200 microlitros adicionales de medio en el sándwich. El medio fluirá de un lado a otro a medida que la mecha elimine el medio viejo.

Tenga cuidado de evitar que se formen burbujas dentro del líquido durante este paso. Repita este proceso dos o tres veces usando una mecha nueva para cada enjuague. Ahora invierta la placa una vez más, sosteniendo la placa desde los bordes para atrapar el líquido en el depósito de la celda.

Sumerja el soldador en el vaso de precipitados para derretir rápidamente parte de la veta, que luego se adherirá a la punta del soldador. Con la punta del soldador, aplique con cuidado la veta de muda alrededor de los bordes del cubreobjetos inferior. Continúe sumergiendo y aplicando todo el perímetro del cubreobjetos, sellándolo a la placa de metal.

Esto crea un buen sello mecánico para que el cubreobjetos no se desprenda de la placa mientras se mira. Limpie cualquier residuo de la parte inferior. Cubra la superficie deslizante levantando una toallita kim y limpiando la cubierta.

Deslízalo con un solo movimiento deslizante para asegurarte de que el cubreobjetos esté más limpio en el centro donde se verá. Regrese la placa de seis paredes a la incubadora. Lleve las células chapadas al laboratorio de óptica y móntelas en el objetivo.

Al igual que antes, encuentre un campo de células que parezcan sanas y adquiera una imagen de campo oscuro del campo de visión. A continuación, alinee el microscopio en DIC y asegúrese de que los tiempos de exposición son los adecuados. Adquiera una imagen DIC con una cámara en cascada.

En esta configuración, las imágenes fluorescentes se adquieren utilizando la cámara SNAP fría mientras el microscopio aún está alineado en DIC. Ajuste el VAR del microscopio a una x y la ventana gráfica al 100% binocular y desvíe la imagen del ocular a la cámara. Coloque un LED azul sobre el condensador para iluminar el campo.

A continuación, obtenga una vista previa del campo de visión en la imagen RSS y ajuste el enfoque fino. Si es necesario, adquiera una imagen DIC y guárdela en el disco. Observe cómo el campo de visión es diferente del que se obtiene de la cámara en cascada.

Estas imágenes deberán ser registradas durante la fase de análisis del experimento. A continuación, mueva el cubo de filtro fluorescente a su posición y adquiera una imagen de fluorescencia activando brevemente la excitación de fluorescencia con el obturador del microscopio y, a continuación, apáguelo tan pronto como se complete la adquisición. Para minimizar el fotoblanqueo, guarde la imagen de fluorescencia en el disco.

Para adquirir imágenes filtradas, restablezca el microscopio al campo y envíe la luz a través del puerto LSM. Como antes, ejecute todo el script del banco de filtros Gabor como antes para completar la adquisición de datos para un punto de tiempo mientras las celdas aún están en el escenario y sin perturbar el campo de visión. Utilice el método de absorción para cambiar el medio L 15 regular por el mismo que contenga una solución micromolar de STS.

Durante el transcurso del experimento, agregue medio adicional para evitar que se seque pipeteando el medio en la ranura de la placa celular sin quitarlo de la etapa ni perturbar el campo de visión. Ahora, repita estos pasos para los siguientes puntos de tiempo hasta que se complete el experimento. Los datos recopilados incluirán un gran número de imágenes filtradas que deben procesarse para extraer los datos estructurales subcelulares.

Aquí se muestran dos ejemplos de experimentos. Esta figura muestra imágenes secuenciales de una muestra de algas marinas de diatomeas. Las características orientadas son claramente visibles.

En imágenes de campo oscuro. Las imágenes filtradas ópticamente etiquetadas como cinco iguales a cero grados y cinco iguales a 160 grados se muestran junto a la imagen sin filtrar de la muestra. A modo de comparación, el conjunto de nueve imágenes filtradas de Gabor de la diatomea se procesaron píxel por píxel para la orientación del objeto.

En cada píxel, la señal máxima se dividió por la señal promedio en función de la orientación del filtro para dar un valor de relación de aspecto. Aquí, una relación de aspecto cercana a la indicada por el azul está presente en áreas en las que no hay un ángulo de respuesta preferido. Los valores más altos indicados en rojo indican áreas en las que está presente una respuesta de ángulo preferido más alta.

El brillo y la significación del código de la respuesta total del filtro GABOR, la orientación del filtro, que proporciona la señal máxima en cada píxel corresponde a la dirección perpendicular a la orientación del objeto subyacente. La orientación de las partículas de la subestructura se codifica en un diagrama de carcaj en el que cada línea coincide estrechamente con la orientación del objeto local subyacente visible en el campo oscuro sin filtrar. El diagrama de carcaj muestra la orientación de los objetos con intensidades de respuesta superiores al 10% del máximo.

Estas imágenes de campo oscuro y filtradas ópticamente de un campo que contenía células endoteliales bovinas vivas, las imágenes filtradas se adquirieron posteriormente cada 20 minutos durante un período de tres horas después del tratamiento con el inductor de apoptosis stor sporin. Aquí, el mapa de relación de aspecto en el panel superior y las imágenes de fluorescencia de las mitocondrias en el panel inferior se muestran en función del tiempo. El tono de color representa el grado de orientación, ya que antes de estos gráficos de tiempo comparan la disminución en el grado de orientación de la relación de aspecto de las partículas en células endoteliales tratadas con s thoro sporin, las trazas individuales representan gráficos de tiempo dentro de células individuales.

La orientación drop-in se limita a las regiones de las células que se registran con regiones fluorescentes. Ahora, se ha logrado la validación contra la fluorescencia. Se convierte en archivo.

Por lo tanto, en los próximos experimentos, las mediciones mitocondriales se pueden realizar omitiendo los pasos de imágenes de fluorescencia y utilizando directamente el método de dispersión óptica. Acabamos de mostrarte cómo monitorizar la fragmentación mitocondrial durante la apoptosis utilizando firmas de dispersión de luz basadas en filtros de Gabor. Al realizar este procedimiento, es importante tener una buena preparación para el estilo de vida y asegurarse de que la configuración óptica esté bien alineada y calibrada.

Así que vamos a tener sentido para ver y CoLab con experimentos de interfaz de usuario.