Name: Linealización del ensayo de proteínas Bradford (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Aprende a linealizar el ensayo de Bradford para cuantificación proteica precisa usando absorbancia a 590 nm y 450 nm. Este método mejora la sensibilidad 10 veces y reduce interferencias de detergentes en muestras biológicas.

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Este trabajo está dedicado a la memoria del fallecido Dr. Zvi Selinger, que fue sede de la investigación original se describe aquí.

Linealización de la curva de calibración Bradford Proteínas: El Coomassie brillante ensayo de la proteína azul, conocido comúnmente como el ensayo de Bradford 1, se utiliza ampliamente debido a su protocolo rápido y conveniente, así como de su sensibilidad relativa. Desafortunadamente, no existe un alto grado de curvatura en un amplio rango de concentraciones de proteína (Fig. 1). Por lo tanto, sólo una estrecha gama de concentraciones de proteína relativamente alto, 10.2 mg / ml de BSA, se utiliza para la curva de calibración, la cual se ajusta mejor a la regresión lineal (Fig. 1, color verde). Sin embargo, la no linealidad requiere la concentración de proteínas de las muestras desconocidas a caer dentro de la gama limitada de la curva de calibración con el fin de evitar un gran error, y también reduce la precisión en el alcance limitado. La no linealidad se presenta un problema serio, en particular, cuando las cantidades de microgramos de proteína no están disponibles, y con frecuencia requiere múltiples diluciones de las muestras desconocidas. Como se señaló en el documento original de Bradford, "la fuente de la no linealidad es el reactivo en sí mismo, ya hay un solapamiento en el espectro de las dos formas de diferente color de la tintura." 1. De hecho, las tres formas del colorante azul brillante de Coomassie se encuentran en equilibrio ácido-base en el pH ácido normal de la prueba 2. Las formas de color rojo, azul y verde han absorbancia máxima a 470, 590 y 650 nm, respectivamente (Fig. 2). El azul es la forma que se une a la proteína, formando un complejo que absorbe la luz intensa a 594 nm 3, 4 (Fig. 2). Bradford también señaló que "el valor de fondo para el reactivo disminuye constantemente a medida que más colorante se une a proteínas" 1 (Fig. 3). Por lo tanto, tratamos de calcular la reducción del fondo de 590 nm como el aumento de cantidades de la proteína se agregan, midiendo el cambio de absorbancia a 450 nm, donde el complejo proteína-colorante no absorbe. Hemos encontrado que la disminución parcial de fondo, pero no totalmente, da cuenta de la no linealidad (Fig. 4). A continuación, la hipótesis de que la disminución de la concentración de colorante libre produce otra distorsión de la respuesta lineal, porque a medida que la proteína de fijación de colorantes está en equilibrio 5, la formación de complejos no sólo depende de la concentración de la proteína libre, sino también en el de la tintura libre (Fig. 5). Teniendo en cuenta tanto cuestiones relacionadas con la concentración variable del colorante libre, se desarrolló una ecuación matemática que describe una relación lineal entre la concentración de proteínas y la relación de medidas de absorbancia, 590 nm más de 450 nm (Fig. 6). Una descripción detallada del estudio teórico y experimental se puede encontrar en nuestra publicación en 1996 de Analytical Biochemistry 6. La ecuación matemática que fue probado experimentalmente y se encontró que el rendimiento de una curva de calibración lineal en la proteína de toda la gama de concentraciones (Fig. 7). Por otra parte, la ecuación también fue validado por una determinación independiente de la correcta depende del pH valor de la intersección del eje 6. Protocolo detallado para el ensayo de proteína mejorada Bradford, utilizando un lector de microplacas Absorbancia: <ol><li> Preparar un 0,1 mg / ml solución madre de la norma, la albúmina sérica bovina. Cualquier otra norma puede ser elegido, pero tenga en cuenta que la misma norma debe ser utilizado en todos los experimentos. </li><li> Diluir las muestras desconocidas en agua destilada. Objetivo de 50 a 50 mg / ml. Sin embargo, mayor o menor concentración de proteínas son aceptables, ya que no existe un límite claro para el rango lineal del ensayo. Sin embargo, la medición debe estar dentro del rango lineal del lector de absorbancia. </li><li> Diluir el reactivo de Bradford (Bio-Rad) de 2,5 veces en agua destilada. </li><li> Añadir 0 y 10 a 50 l de solución stock de BSA para tres pozos (la creación de un 0-5 mg curva de calibración BSA). Complementar con agua destilada para llegar a 100 l / pocillo. </li><li> En diferentes pozos, añadir 100 ml de la muestra problema por triplicado. Varias concentraciones de la muestra desconocida puede ser utilizado para aumentar la precisión. </li><li> Añadir 100 ml de los gases de reactivo de Bradford a todos los pocillos. El volumen total es de 200 l / pocillo. </li><li> Espere por lo menos 5 minutos, pero no más de 60 minutos para que el color. </li><li> El blanco debe ser de 200 l de agua destilada (y no el tinte de proteínas y cero). </li><li> Medir la absorbancia a 590 nm y 450 nm. </li><li> Preparar una curva de calibración dividiendo los valores de absorbancia neta a 590 nm y 450 nm. Tenga en cuenta que la proteína cero (tinte solamente) el valor debe ser incluido como un punto de datos (Fig. 8). </li><li> Calcular la concentración de la muestra problema sobre la base de la ecuación lineal de la curva de calibración (Fig. 9). </li></ol> Los resultados representativos: A diferencia de la absorbancia a una longitud de onda de 590 nm, la proporción de valores de absorción, 590 nm más de 450 nm, es lineal wconcentración de proteína i (Fig. 10). La concentración de proteína de la muestra desconocida puede ser simplemente calculó mediante la ecuación lineal de la curva de calibración (Fig. 10, la ecuación). Sin embargo, una mayor precisión se obtiene mediante la medición de varias diluciones de la muestra desconocida. Con este fin, preparar dos gráficas. La primera es una curva de calibración para el estándar de proteínas g en el eje X (Fig. 11, derecha). El segundo gráfico es que la muestra desconocida, con l de la muestra original sin diluir en el eje X (Fig. 11, izquierda). El único valor medio de contraste debe ser incluido en ambos gráficos (Fig. 11). La concentración de proteína de la muestra desconocida se obtiene dividiendo las laderas de la muestra desconocida y el estándar (Fig. 11, la ecuación). <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig2.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Gráfica convencional de calibración de Bradford. El rango lineal es representada por símbolos de color verde. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig1.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Espectros del complejo proteína-colorante y el colorante solo. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Proteína-colorante equilibrio. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Reducción de los antecedentes correctos calculado disminuye parcialmente la no linealidad. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Proteína-colorante equilibrio. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Base matemática para la linealización de la proteína de ensayo Bradford. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig7.jpg" alt="Figura 7" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 7"> Figura 7. Linealización de la curva de calibración Bradford. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig8.jpg" alt="Figura 8" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 8"> Figura 8. Cálculo de los valores de absorbancia relación. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig9.jpg" alt="Figura 9" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 9"> Figura 9. Un gráfico lineal Bradford calibración. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig10.jpg" alt="Figura 10" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 10"> Figura 10. Linealización de la curva de calibración Bradford. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig11.jpg" alt="Figura 11" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 11"> Figura 11. Desconocido muestra la concentración de cálculo.

<ol><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spectral+study+of+the+charge+forms+of+Coomassie+blue+G%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A spectral study of the charge forms of Coomassie blue G.</a> Anal Biochem. 209, 258-266 (1993).</li>
<li>Chial, H. J., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+binding+of+Coomassie+brilliant+blue+to+proteins+at+low+and+neutral+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A comparison of the binding of Coomassie brilliant blue to proteins at low and neutral pH.</a> Anal Biochem. 213, 362-369 (1993).</li>
<li>Compton, S. J., Jones, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+dye+response+and+interference+in+the+Bradford+protein+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay.</a> Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).</li>
<li>Congdon, R. W., Muth, G. W., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+binding+interaction+of+Coomassie+blue+with+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">The binding interaction of Coomassie blue with proteins.</a> Anal Biochem. 213, 407-413 (1993).</li>
<li>Zor, T., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linearization+of+the+Bradford+protein+assay+increases+its+sensitivity%3A+theoretical+and+experimental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies.</a> Anal Biochem. 236, 302-308 (1996).</li>
</ol>

El ensayo de proteínas Bradford es muy popular debido a su facilidad de realización y la sensibilidad relativa. La linealización sobre las concentraciones de proteína completa gama que se obtenga el protocolo que aquí se presenta simplifica aún más el ensayo, ya que las muestras desconocidas no tiene que estar dentro del rango de la curva de calibración. Es importante destacar que el protocolo mejorado aún ofrece las siguientes ventajas sobre el protocolo original de Bradford: <ol><li> M...

<table><tbody><tr><td>Reactivo de Bradford</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Amersco</td><td>0332</td><td></td></tr><tr><td>Lector de absorbancia multiplaca</td><td>BioTek</td><td>Synergy2</td><td></td></tr></tbody></table>

linealización del ensayo de proteínas bradford

Linearization of the Bradford Protein Assay

Determinación de las cantidades de microgramos de proteína en el ensayo de Bradford azul brillante de Coomassie se lleva a cabo mediante la medición de la absorbancia a 590 nm. Este ensayo más común permite la cuantificación de proteínas rápida y sencilla en lisados ​​de células, las fracciones celulares, o muestras de proteínas recombinantes, con el propósito de la normalización de las mediciones bioquímicas. Sin embargo, una no-linealidad intrínseca compromete la sensibilidad y la precisión de este método. Se demuestra que bajo condiciones de ensayo estándar, la proporción de las mediciones de absorbancia a 590 nm y 450 nm es estrictamente lineal con la concentración de proteínas. Este sencillo procedimiento aumenta la precisión y mejora la sensibilidad de la prueba unas 10 veces, permitiendo la cuantificación de hasta 50 ng de albúmina sérica bovina. Además, la interferencia común introducido por los detergentes que se utilizan para crear los lisados ​​celulares se reduce considerablemente por el nuevo protocolo. Una ecuación lineal desarrollado sobre la base de la acción de masas y la ley de Beer se adapta perfectamente a los datos experimentales.

La precisión y la sensibilidad de la determinación de proteínas mediante el ensayo de Bradford rápida y conveniente se ve comprometida por la no linealidad intrínseca. Se muestra un procedimiento de linealización simple que aumenta en gran medida la precisión, mejora la sensibilidad de la prueba unas 10 veces, y reduce significativamente la interferencia de los detergentes.

Linealización del ensayo de proteínas Bradford

La determinación de cantidades de microgramos de proteína en el ensayo de Bradford con Coomassie brilliant blue se lleva a cabo mediante la medición de la absorbancia a 590 nm.

El ensayo de proteínas de Bradford comienza con la adición de una estándar de BSA en cantidades crecientes y diluciones de una muestra desconocida a una placa de 96 pocillos; se agrega agua desionizada para completar el volumen variable. Luego se añade el reactivo de Bradford a todos los pocillos excepto al blanco, que debe contener solo agua después de cinco minutos. La absorbancia se mide a 590 nanómetros para la detección del complejo de colorante-proteína y a 450 nanómetros.Para la linealización de la gráfica, la relación entre los valores de absorbancia a 590 nanómetros y a 450 nanómetros es estrictamente lineal con la cantidad de proteína. Hola, soy del Departamento de Bioquímica de la Universidad de Tel Aviv, Israel, soy o T del laboratorio. Hoy les mostraremos un procedimiento para determinar la concentración de proteína utilizando un protocolo de Bradford mejorado y linealizado.Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para normalizar la cantidad de proteína en SZaS, por ejemplo, antes de cargar geles. Comencemos. En el ensayo de Bradford, tres formas del colorante azul brillante de Kumasi se encuentran en equilibrio ácido-base a pH ácido habitual del ensayo.Las formas roja, azul y verde tienen máximos de absorción a cuatrocientos setenta, quinientos noventa y 650 nanómetros, respectivamente. La forma azul es la que se une a la proteína formando un complejo que absorbe intensamente la luz a 594 nanómetros. Este ensayo ampliamente utilizado presenta un alto grado de curvatura en un amplio rango de concentraciones de proteína.Por lo tanto, solo se utiliza un rango estrecho de concentraciones de proteína relativamente altas para la gráfica de calibración, lo que permite un mejor ajuste a la regresión lineal. Una causa de la no linealidad es la absorbancia a 590 nanómetros del colorante libre, que disminuye a medida que se añaden cantidades crecientes de proteína. La no linealidad se reduce parcialmente midiendo el cambio de absorbancia a 450 nanómetros, donde el colorante por sí solo, pero no el complejo proteína-colorante, absorbe.Y al reducir el blanco calculado correcto, la disminución en la concentración de colorante libre produce otra distorsión de la respuesta lineal, porque, dado que la unión del colorante a la proteína está en equilibrio, la formación del complejo depende no solo de la concentración de proteína libre, sino también de la de colorante libre. Teniendo en cuenta ambos aspectos relacionados con la concentración variable de colorante libre, se desarrolló una ecuación matemática que describe una relación lineal entre la concentración de proteína y la relación de las mediciones de absorbancia a 590 nanómetros sobre 450 nanómetros.La ecuación matemática fue probada experimentalmente y se encontró que produce una curva de calibración lineal en todo el rango de concentración de proteína. Para comenzar, prepare una solución de tallo de albúmina sérica bovina a 0,1 miligramo por mililitro. Puede elegirse cualquier otro estándar, pero tenga en cuenta que debe utilizarse el mismo estándar en todos los experimentos.Diluya las muestras desconocidas en agua desionizada. Apunte a entre cinco y 50 microgramos por mililitro, aunque se aceptan concentraciones de proteína más altas o más bajas, ya que no existe un límite aparente para el rango lineal del ensayo. Tenga en cuenta, sin embargo, que la medición debe estar dentro del rango lineal del lector de absorbancia.Además, diluya el reactivo de Bradford 2,5 veces en agua desionizada. A continuación, agregue cero y de cinco a 50 microlitros de la solución stock de BSA a pocillos triplicados de una placa de 96 pocillos para crear una curva de calibración de BSA de cero a cinco microgramos, completando con agua desionizada hasta alcanzar 100 microlitros por pocillo en diferentes pocillos. Con 100 microlitros de muestra desconocida en triplicado, se pueden usar varias concentraciones de la muestra desconocida para aumentar la precisión.Finalmente, añada 100 microlitros del reactivo de Bradford diluido a todas las pocilas. El volumen total es de 200 microlitros por pocila. Prepare también un blanco para medir la absorbancia.Esto debe ser 200 microlitros de agua desionizada y no el colorante sin proteína. Deje reposar durante al menos cinco minutos, pero no más de 60 minutos, para el desarrollo del color.Proceda a medir la absorbancia a 590 nanómetros y a 450 nanómetros. Recuerde utilizar agua para la medición del blanco. Prepare un gráfico de calibración dividiendo los valores de absorbancia neta a 590 nanómetros y a 450 nanómetros.Tenga en cuenta que el valor cero de proteína debe incluirse como un punto de datos. Calcule la concentración de la muestra desconocida basándose en la ecuación lineal de la curva de calibración. A diferencia de la absorbancia a una sola longitud de onda de 590 nanómetros, la relación entre los valores de absorbancia a 590 nanómetros y 450 nanómetros es lineal con la concentración de proteína.La concentración de proteína de la muestra desconocida puede calcularse simplemente utilizando la ecuación lineal de la curva de calibración. Sin embargo, se obtiene una mayor precisión al medir varias diluciones de la muestra desconocida. Con este fin, prepare dos gráficos.El primero es un gráfico de calibración para el estándar con microgramos de proteína en el eje x. El segundo gráfico es para la muestra desconocida con microlitros de la muestra original sin diluir en el eje x. El valor solo del colorante debe incluirse en ambos gráficos.La concentración de proteína de la muestra desconocida se obtiene dividiendo las pendientes de la muestra desconocida y del estándar. Acabamos de mostrarle cómo medir la concentración de proteína utilizando un protocolo de Bradford linealizado mejorado. El uso de este procedimiento aumenta considerablemente la precisión del ensayo, mejora la sensibilidad aproximadamente 10 veces y reduce significativamente la interferencia por detergentes al realizar este procedimiento.Es importante recordar el uso del blanco apropiado, que es agua en lugar de la muestra de colorante sin proteína. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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