Name: El trasplante de las buenas prácticas agrarias-que expresa Blastómeros de imágenes en vivo del desarrollo de la retina y el cerebro en embriones de pez cebra quiméricos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprende a generar embriones quiméricos de pez cebra mediante el trasplante de blastómeros marcados con GFP para imagen en vivo. Este método permite estudiar el desarrollo de retina y cerebro con imágenes microscópicas.

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Este estudio fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) Core Grant (5P30EY008098) y los siguientes fondos de XW: Subvenciones del NIH R01EY016099 e Investigación para Prevenir la Ceguera Premio al Desarrollo Profesional. Damos las gracias a Kira Lathrop de asistencia en la imagen confocal.

Día 1. Preparación 1. Establecer cruces de pescado Establecer cruces de pares de pez cebra en la noche. Para evitar el apareamiento al azar antes de la hora que desee, utilice separadores para separar los peces de ambos sexos en los cassettes de apareamiento. Que expresan GFP peces transgénicos se utilizan como fuente de blastómeros de los donantes. La línea pt104 transgénicos (Zou et al., 2008), se utiliza aquí, expresa GFP doquier bajo el control del promotor EF1. La expresión de GFP permite la visualización de las células del donante de imágenes en vivo. Otras líneas de peces transgénicos que expresan proteínas fluorescentes adecuados pueden ser utilizados para necesidades específicas. 2. Preparar en forma de cuña de agarosa pozos para la celebración de embriones Vierta derretida 1% de agarosa, preparados de huevo en el agua E3 (Westerfield, 2007), en una placa de Petri. Flotar un molde de plástico que tiene forma de cuña, protuberancias en la solución de agarosa y dejar que la solución de agarosa completamente solidifique. Retire el molde con cuidado y sumerja la cama de agarosa con agua E3. 3. Prepare las agujas del trasplante Utilice un extractor de aguja vertical (David Kopf Instruments) en ajuste de potencia de 11,5 a fabricar agujas tirando pipetas capilares de vidrio (Instrumento Mundial de Precisión). Buenos consejos aguja cónica con ejes largos. Moler las puntas de aguja en un ángulo de 45 grados con una amoladora Micro (Marishige) hasta las aberturas biselado de 40 45μm de diámetro interior se obtiene (Fig. 1A). Para limpiar las puntas de aguja, conectar una manguera a la parte roma de la aguja, conectar la manguera a una jeringa, y luego extraerla, y liberar una solución al 10% de ácido fluorhídrico hasta que toda la suciedad visible desaparezca. Después, lave la punta con agua destilada, seguido de etanol al 100%. Seque al aire las agujas hasta que se evapore el etanol. Es importante asegurarse de que las puntas estén completamente secas: el etanol residual va a arruinar las agujas durante la etapa de pulido de alta temperatura. Para suavizar y pulir las asperezas de las puntas de aguja, cocinar las puntas de aguja con el calor generado por el filamento de un falsificador Micro (Marishige). No permita que las puntas de la aguja toca el filamento durante el pulido. La cantidad de electricidad que pasa a pesar de que el filamento y la distancia entre el filamento y la punta de la aguja puede ser ajustada para alcanzar las condiciones deseadas de calefacción. La temperatura no debe ser demasiado alto: esta se derrite y se deforman las puntas de aguja. Después de las aristas son alisadas, cuidadosamente tocar el filamento se calienta con la punta de la aguja y tire suavemente el filamento de la aguja para generar un extremo en punta (Fig. 1B). Una aguja, suave y limpia es fundamental para obtener blastómeras intactas de los donantes y para no dañar a los embriones de acogida. 4. Prepare una investigación de embriones de posicionamiento Tire de una pipeta de vidrio sobre una llama de gas para obtener una sonda fina de vidrio con un extremo alisado. Esta sonda se utiliza para colocar los embriones en la orientación correcta antes del trasplante. Día 2. Blastómero trasplante 1. Recoger y embriones dechorionate Al día siguiente, quitar los separadores de los cartuchos de cruz para que los peces a su compañero. Colocar los embriones en una placa Petri con agua E3. Luego, los embriones dechorionate manualmente arrancando el corion de los embriones con un par de pinzas finas. Use una pipeta de vidrio con eje doblado cuidadosamente para transferir los embriones dechorionated en agarosa pozos. Evitar cualquier contacto de los embriones con el aire, lo que causa que los embriones a punto de estallar. Deje que los embriones se desarrollan a 28,5 ° C en los pozos de agarosa hasta 3 horas después de la fecundación, o HPF. 2. Establecer un aparato de trasplante Mientras que los embriones se desarrollan, crear un aparato de trasplante mediante la conexión de la aguja del trasplante a la llena de aceite mineral micro-sistema de bombeo. Asegúrese de que el sistema no se escapa y no hay burbujas de aire atrapadas en el sistema. Volver llenar la aguja trasplante completo con aceite mineral, con excepción de los 0,5 a 1 l de espacio en la apertura de la punta. 3. El trasplante de blastómeros Para trasplante de blastómeros, el uso de una sonda de vidrio para orientar el posicionamiento del lado blastómeros de los embriones 3-4-HPF hacia arriba. A continuación, insertar suavemente la aguja del trasplante en un embrión de donante y poco a poco aspirar 05.20 blastómeras en la aguja. Insertar la aguja blastómero lleno en un embrión de acogida y liberación de los blastómeros lentamente. El sitio en el que los blastómeros son liberados influirá en su progenie localizar en las etapas posteriores del desarrollo. Para analizar el desarrollo de la retina y el cerebro, las células liberan en el polo animal. Durante el trasplante, asegúrese de que la punta de la aguja no contacto con el aire. Para reducir al mínimo los daños mecánicos, los embriones de acogida se queda en los pozos de agarosa a 28,5 ° C hasta el día siguiente. Entonces, tTRANSFERENCIA los embriones mosaico de placas de 24 pocillos previamente recubierto con 0,5 ml de agarosa al 1%, con un embrión en cada pozo. 1 ml de agua de huevo E3 se añade a cada pocillo. Para prevenir las infecciones bacterianas, añadir 10 l de 100 veces la penicilina y estreptomicina para el agua de huevo E3. Día 3. Incorporación de imágenes en vivo y de los embriones mosaico 1. Incorporación de embriones Prepare un 1,5% de agarosa de bajo punto de fusión (LMP) en agua de huevo E3 y mantener la solución en un baño de 30 ° C el agua. La transferencia de un embrión de mosaico a un plato de cultivo de tejidos FluoroDish con fondo de cristal de 0,17 mm de espesor (Instrumentos del Mundo de Precisión). Eliminar el agua E3 exceso de salir del embrión apenas cubierta por una cantidad mínima de E3. Añadir 30-50 l LMP fundido 1,5% para el embrión. Rápidamente la posición del ojo o el cerebro lo más cerca del fondo de cristal como sea posible antes de que la solución de agarosa solidifica. Después de que la solución se enfríe, añadir más solución de agarosa para asegurar aún más los embriones en su lugar. Luego, sumerja la agarosa solidificada bloque con 3.2 ml de agua de huevo E3. 2. Microscopía confocal Por microscopía confocal, un objetivo de inmersión en agua invertido (Olympus, PlanApo, 40 X/0.90 WLSM, Japón) con una profundidad de foco grande se utiliza. Una gota de agua se agrega en el objetivo y luego colocar un plato de cultivo de tejidos FluoroDish en el objetivo. Para el desarrollo de la imagen, realizar time-lapse de imágenes de la toma de fotografías de los embriones cada 5 minutos. Dependiendo de la naturaleza de los experimentos, los intervalos de tiempo entre las tomas deben ser ajustados. Los resultados representativos La figura 2 muestra una representación de 24 HPF pez cebra mosaico. La expresión de GFP se destacan las células del donante en verde. Las células neuroepiteliales retina abarcan todo el espesor de la pared de la retina. La película muestra los movimientos de las células del donante en el cerebro de acogida en 24 HPF. Células aviso morfologías cambiar con el tiempo. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Las formas de las puntas de aguja trasplante. A. La apertura biselada de la punta de una aguja estaba libre de escombros después de lavados con ácido fluorhídrico. B. Una punta se generó en la punta de la aguja. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Visualización de las buenas prácticas agrarias-que expresan las células del donante en un quimérico embriones de pez cebra en 24 HPF. El panel izquierdo muestra las señales de las buenas prácticas agrarias en el cerebro y la retina. El panel central es una imagen de campo claro del embrión. El panel derecho muestra la imagen fusionada. Movie 1. Imágenes en vivo de las células GFP donante positivo demostrado los grandes cambios en la morfología de las células cerebrales neuroepiteliales durante el desarrollo. Los cuadros individuales de la película fueron recogidos cada 5 minutos entre las 24 y 25 HPF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1924/1924_Wei_Movie1.wmv">Haga clic aquí para ver la película</a> .

<ol><li>Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+RPE+maintained+by+Nok+is+essential+for+retinal+epithelial+polarity+and+cellular+patterning+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish.</a> Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).</li>
<li>Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22THE+ZEBRAFISH+BOOK%22">THE ZEBRAFISH BOOK</a>. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).</li>
<li>Ho, R. K., Kane, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+action+of+zebrafish+spt-1+mutation+in+specific+mesodermal+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors.</a> Nature. 348, 728-730 (1990).</li>
<li>Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+dou+yan+Mutation+Causes+Patterning+Defects+and+Extensive+Cell+Death+in+the+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina.</a> Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).</li>
</ol>

En este vídeo, se demuestra un método para el trasplante de blastómeros para analizar el desarrollo de la retina y el cerebro en el pez cebra. Este protocolo también se puede utilizar para analizar el desarrollo de otros tejidos y órganos, simplemente la liberación de los blastómeros de los donantes a los lugares correspondientes en los embriones de acogida. El etiquetado con las moléculas de las buenas prácticas agrarias se obtiene un fondo más limpio que el etiquetado con tinte fluorescente dextrano conjugado (Ho y Ka...

E3 agua de huevo: <ul><li> 5 mM NaCl </li><li> 0,17 mM KCl </li><li> 0,33 mM CaCl 2 </li><li> 0,33 mM MgSO 4 </li><li> 0,1% de azul de metileno </li></ul>

el trasplante de las buenas prácticas agrarias-que expresa blastómeros de imágenes en vivo del desarrollo de la retina y el cerebro en embriones de pez cebra quiméricos

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Las células cambian mucho en su ubicación y la propiedad durante la embriogénesis. Estos cambios están regulados por las interacciones entre las células y su medio ambiente. Embriones quiméricos, que se componen de células de los antecedentes genéticos diferentes, son una gran herramienta para estudiar las interacciones célula-célula mediada por los genes de interés. La transparencia de embriones de pez cebra en las primeras etapas de desarrollo permite la visualización directa de la morfogénesis de los tejidos y órganos a nivel celular. Este sentido, demuestran un protocolo para generar quimérico retinas y cerebros de embriones de pez cebra y para realizar las imágenes en vivo de las células del donante. El protocolo contempla la preparación de las agujas del trasplante, el trasplante de las buenas prácticas agrarias-que expresa blastómeras donantes para GFP-negativos los ejércitos, y el examen de comportamiento de los donantes de células en la microscopía confocal en vivo. Con ligeras modificaciones, este protocolo también se puede utilizar para estudiar el desarrollo embrionario de otros tejidos y órganos en el pez cebra. Las ventajas de utilizar la GFP a las células de los donantes etiqueta también se discuten.

Demostramos un protocolo para generar embriones quiméricos de pez cebra para vivir el comportamiento de imagen celular durante la embriogénesis.

El trasplante de las buenas prácticas agrarias-que expresa Blastómeros de imágenes en vivo del desarrollo de la retina y el cerebro en embriones de pez cebra quiméricos

Las células cambian extensamente su ubicación y propiedades durante la embriogénesis. Estos cambios están regulados por las interacciones entre las células y su...

Los blasmodios son las células embrionarias formadas durante la etapa de segmentación del desarrollo. Aquí, blasmodios marcados con GFP se transfieren de un embrión de pez cebra a otro mediante una aguja de trasplante. Este método permite seguir, mediante imágenes microscópicas en vivo, el comportamiento y el destino de blasmodios con fondos genéticos alterados en un embrión de lo contrario normal, o viceversa.Hola, soy el Dr. Zoran, del laboratorio del Dr. Shawe en el Departamento de Oftalmología de la Universidad de Pittsburgh. Hoy les mostraremos un procedimiento para la trasplantación de células musculares mamarias en embriones de pez cebra. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar el desarrollo de la retina y del cerebro.Así que comencemos. Por la tarde, prepare cruces por parejas de pez cebra para evitar el apareamiento aleatorio. Antes de la hora deseada, use divisores para separar los peces hembra y macho. Aquí.Los peces transgénicos que expresan GFP se utilizan como fuente de blastómeros donantes. La línea transgénica PT 1 0 4 expresa GFP de manera ubicua bajo el control del promotor EF one para preparar los pozos de agarosa. Vierta agarosa al 1% fundida preparada en agua de huevo E tres en una placa de Petri. Coloque flotando un molde de plástico con protrusiones en forma de cuña sobre la solución de agarosa.Luego, déjelo enfriar. Para solidificar con cuidado, retire el molde e introduzca el lecho de agros en agua E tres. A continuación, prepare las agujas de trasplante.Utilice un extractor de agujas vertical en el ajuste de potencia 11,5 para tirar de las pipetas capilares de vidrio. Las puntas de aguja adecuadas deben tener una forma cónica con vástagos largos. Afile las puntas de las agujas en un ángulo de 45 grados con un microlijador hasta obtener aberturas biseladas de 30 a 40 micrómetros de diámetro interno.Para limpiar las puntas de las agujas, coloque una manguera en el extremo romo, conecte la manguera a una jeringa y luego aspire y libere una solución de ácido fluorhídrico al 10%. Repita hasta eliminar todos los residuos visibles. Lave las puntas con agua destilada.Luego, con etanol al 100 %, seque las agujas al aire hasta que todo el etanol se evapore. Es importante asegurarse de que las puntas estén completamente secas. El etanol residual estropeará las agujas durante el pulido a alta temperatura.Paso dos, para suavizar y pulir los bordes ásperos de las puntas de la aguja, sométalas a cocción con el calor generado por el filamento de un microforjador. No permita que las puntas de la aguja toquen el filamento mientras se pulen, ajustando la cantidad de electricidad que pasa a través del filamento y la distancia entre el filamento y la aguja. Las puntas pueden ajustarse para alcanzar las condiciones de calentamiento deseadas.La temperatura no debe ser demasiado alta. Esto fundiría y deformaría las puntas de las agujas después de suavizar los bordes ásperos. Toque cuidadosamente el filamento calentado con la punta de la aguja y luego retire suavemente el filamento para generar un extremo puntiagudo.Una aguja afilada, suave y limpia es fundamental para obtener blastocitos donantes intactos sin dañar los embriones huésped. Tire de una pipeta de vidrio sobre una llama de gas para fabricar una sonda de vidrio fina con un extremo suavizado. Esta sonda se utilizará para colocar los embriones en la orientación adecuada antes del trasplante.El día del experimento, retire los divisores de las cápsulas cruzadas para permitir que los peces se reproduzcan. Ocho. Después de 30 minutos, recolecte de 100 a 200 embriones vertiéndolos en una red. Coloque los embriones en una placa de Petri llena con agua E tres.Luego, utilizando pinzas finas, desprenda los embriones eliminando manualmente las COR. A continuación, use una pipeta de vidrio con el vástago doblado para transferir cuidadosamente los embriones recubiertos a los pozos de aros. No permita que los embriones entren en contacto con el aire, ya que esto provocaría su ruptura.Deje que los embriones se desarrollen a 28,5 grados Celsius en los pocillos de aros hasta tres horas post-fecundación o HPF mientras los embriones se desarrollan. Prepare un aparato de trasplante conectando la aguja de trasplante a un sistema de bombeo microscópico lleno de aceite mineral. Asegúrese de que el sistema no tenga fugas ni burbujas de aire atrapadas.Rellene completamente la aguja de trasplante con aceite mineral, excepto por el espacio de medio hasta un microlitro en la abertura de la punta. Retire los embriones del incubador y colóquelos sobre la platina del microscopio para trasplantar el blasmafago. Utilice una sonda de vidrio de posicionamiento para orientar hacia arriba el lado del blasmafago de los embriones de tres a cuatro HPF.Luego, inserte suavemente la aguja de trasplante en un embrión donante y aspire lentamente de cinco a veinte blasfemias dentro de la aguja, asegurándose de que la punta de la aguja no entre en contacto con el aire durante el trasplante. Introduzca la aguja cargada con blasfemias en un embrión huésped y libere lentamente las blasfemias. El sitio en el que se liberan las blasfemias influirá en la localización de sus descendientes en estadios posteriores del desarrollo; para analizar el desarrollo retiniano y cerebral, libere las células en el polo animal.Si se va a analizar el desarrollo de otros tejidos y órganos, deben considerarse en consecuencia distintas ubicaciones de liberación. Para minimizar el daño mecánico durante el trasplante, los embriones huésped se dejan en los pocillos de agros a 28,5 grados Celsius hasta el día siguiente. Luego, transfiera los embriones mosáicos a placas de 24 pocillos previamente recubiertas con 0,5 mililitros de 1%aros y llenadas con un mililitro de agua para huevos E tres.Se debe añadir un embrión a cada pocillo para prevenir infecciones bacterianas con 10 microlitros de penicilina y estreptomicina 100x. En cada pocillo, pese y prepare agarosa de punto de fusión baja o LMP, y mantenga la solución en un baño de agua a 30 grados Celsius. Transfiera un embrión mosáico a un plato flora con fondo de vidrio de 0,17 milímetros de espesor.Elimine cualquier exceso de agua E tres para que solo quede cubriendo al embrión. Luego, añada de 30 a 50 microlitros de LMP al 1,5 % fundido al embrión rápidamente antes de que la solución de ARO se solidifique. Coloque el ojo o el cerebro lo más cerca posible del fondo de vidrio.Una vez que la solución se enfríe, agregue más solución de agrosa para asegurar aún más los embriones en su lugar. Sumerja el bloque de agrosa solidificado en dos a tres mililitros de agua para huevos E3 para microscopía confocal. Se utiliza un objetivo invertido de inmersión en agua 40x con gran profundidad de enfoque.Agregue una gota de agua sobre el objetivo y coloque un cultivo de tejidos en placa de flora sobre la platina, enfocando para el desarrollo de la imagen. Realice imágenes de lapso de tiempo tomando fotografías de los embriones cada cinco minutos. Dependiendo de la naturaleza de los experimentos, se pueden ajustar los intervalos de tiempo entre disparos.Aquí se muestra una imagen representativa de un pez cebra a las 24 HPF. La expresión de GFP resalta las células donantes en verde. Las células del neuroepitelio retiniano abarcan todo el grosor de la pared retiniana.Esta película muestra los movimientos de las células donantes en el cerebro del huésped a las 24 HPF. Observe cómo las morfologías celulares cambian con el tiempo. Solo mostraremos cómo realizar el transporte de espejo mamario en pez cebra.Al realizar este procedimiento, es importante recordar preparar adecuadamente una buena aguja en el área mamaria de trasplante con suavidad. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con su experimento.

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Biología

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