Name: Determinación del tejido Con el trasplante de Cap Animal (ACT) en el ensayo Xenopus laevis /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-16T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Aprende el ensayo de trasplante de capa animal en Xenopus laevis para estudiar la determinación del destino tisular mediante sobreexpresión génica. Este método permite analizar la formación de tejidos ectópicos como estructuras oculares.

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Este trabajo fue apoyado por becas de Investigación para Prevención de la Ceguera (Premios de Desarrollo Profesional para MEZ y ASV y una beca para el Departamento de Oftalmología), la Fundación E. Matilda Ziegler (MEZ y ASV) y el National Eye Institute / NIH (MEZ , las subvenciones y R01EY015748 R01EY017964).

Parte I. La configuración para el ensayo ACT <ol><li> Generar ARN tope para la inyección según lo sugerido por el fabricante, utilizando sus fenol: cloroformo método de purificación (por ejemplo, mMessage mMachine Kit, Applied Biosystems / Ambion, Austin, TX). ARN que codifica una proteína fluorescente se utiliza como trazador. Transcribimos cualquier proteína amarilla fluorescente (YFP) o mCherry 5 cDNA, que se encuentra en un vector de expresión pCS2 +. </li><li> Tire de los tubos de vidrio borosilicato capilares para formar puntas cónicas de vidrio utilizando un extractor de micropipeta. Usamos Sutter Micropipeta Puller, P-97 (Sutter Instruments, Inc., Novato, CA), como se describió anteriormente 6. </li><li> Que las soluciones estériles en la Tabla 1 de un 10 X de Marc de modificación del timbre (MMR) solución madre (10 mM de MgCl2, 20 mM KCl, 20 mM CaCl 2, HEPES 50 mM, NaCl 1 M, ajustada a pH 7,5, autoclave y se almacena a RT). </li><li> Aislar a los testículos de una rana macho y almacenar el tejido a 4 ° C en una solución estéril de 1X MMR / gentamicina (50 mg / ml de sulfato de gentamicina; BioWhittaker, Cat # 17-518Z). Esto se puede hacer hasta una semana antes del inicio del experimento, pero es pierde su eficacia con el tiempo. </li><li> Solución de la puesta de huevos (1X: 150 mM NaCl, 2,62 mM KCl, 0,8 mM Na 2 HPO 4, 20 mM Trizma base, 2,62 mM NaHCO3 y 2,75 mM MgSO 4, se ajusta a pH 7,6) se puede hacer como una acción de 8x, que se puede almacenar a 4 ° C durante hasta dos semanas. Nota: ten cuidado con la contaminación en esta solución, ya que esto afectará la calidad de sus óvulos. </li><li> Generar las placas de la inyección. Para ello, se funden agarosa al 1% en 0,4 x MMR en un horno de microondas, añadir ~ 6 mL de solución agarosa derretida en 60 placas mm, suavemente desenrollar un molde de elastómero (Figura 1) en la parte superior de la solución para evitar las burbujas y dejar enfriar por unos 20 minutos a temperatura ambiente. Para determinar el número necesario, considerar el número de condiciones experimentales (por ejemplo 1, YFP, 2, YFP Noggin +) y es necesario el número de embriones transplantados de host. Para nuestros experimentos, generar por lo menos 20 embriones transplantados de host para cada condición experimental. A 18-19 ° C, los embriones serán en la etapa 15 por una hora. Si se toma una hora para llevar a cabo 20 trasplantes, a continuación, dos momentos de fertilización se necesitan, asumiendo que los embriones de acogida aceptará todos los trasplantes. Por lo tanto, cuatro platos de inyección será necesaria (2 x 2 exp condiciones de los puntos de tiempo fertilización = 4). Almacenar las placas a 4 ° C durante un máximo de una semana. </li><li> Generar las placas de aislamiento con tapa de agarosa al 1% + 0.7X MMR con los moldes en cuanto a la placa de la inyección. Hacer el mismo número de aislamiento de la PAC como placas inyección y un punto extra por el tiempo de fertilización (4 + 2 puntos de tiempo fertilización = 6). </li><li> Inyectar las hembras con 500 unidades de gonadotropina coriónica humana al final del día el día antes de la microinyección. Mujeres almacenar a 16-18 ° C durante la noche. </li></ol> Parte II. ARN Microinyección de embriones de Xenopus laevis A. Preparación para la microinyección <ol><li> Quitar las mujeres hormonalmente inducida y colocarlos en jaulas individuales que contiene 1X solución de puesta de huevos (ELS). Nota: no usamos los huevos que han estado en el ELS más de dos horas como la calidad de los huevos se reduce. Por lo tanto, una hora antes de la fecundación in vitro, se descartan todos los huevos en el tanque de modo que los huevos recién puestos sólo se recogen. </li><li> Prepare la aguja para la microinyección cortando la punta para obtener un diámetro de 25-35 micras. Coloque la aguja en la picoinjector y calibrar de modo que se prescinde de 10 nl por inyección. </li><li> Establecer una incubadora a 14 ° C. </li><li> Una vez que las hembras han puesto huevos durante aproximadamente una hora, retirar los óvulos del tanque utilizando una pipeta de transferencia y los situará en 60 mm placas de Petri. Eliminar la mayor cantidad de ELS de los huevos como sea posible y vuelva a colocar con 1X MMR. Los huevos pueden ser fertilizados inmediatamente o permanecer en el MMR 1X para un máximo de una hora. Para el ensayo de trasplante, lo mejor es fertilizar dos platos, el 80% de su capacidad de una sola capa de huevos en un máximo de tres lotes separados alrededor de las 11 am, al mediodía y la 1 pm. Después de la inyección, que será colocado a 14 ° C para que puedan llegar a las etapas que desee para el aislamiento de la tapa (etapa 8,5-9) y el trasplante (la etapa 15, véase la Parte I, # 6). </li><li> Para comprobar la calidad de los testículos, se realiza una fertilización mañana temprano (~ 8 am), lo que nos permite extraer los testículos de otro hombre, si el esperma de la primera no es viable. Nota: ~ 0,25 homogeneizar los testículos en una MMR mL 1X y añadir aproximadamente 5 a 7 gotas por la placa de los ovocitos. </li><li> In vitro fertilizar los huevos con testículos homogeneizada y, una hora más tarde, eliminar la capa gelatinosa de los huevos con jalea de solución (164μl 1M TDT + 10 ml 1M Tris, pH 8,8 hasta 50 ml de agua Nanopure autoclave). Espere hasta que llegan a la etapa de dos células para comenzar la clasificación, que dura aproximadamente 2 horas a 18 ° C o 1,5 horas a temperatura ambiente (22 ° C). </li><li> El uso de un transfer pipeta, embriones tipo uniformemente pigmentados y dividiendo por igual, como se muestra en la tapa de los animales a la izquierda en la figura 3, en el pozo de inyección de un plato lleno de 0,4 x Ficoll MMR + 6%. </li></ol> B. microinyección <ol><li> Parafilm tramo en la parte superior de una tapa de plato de Petri de 60 mm. Pipetear 2 l de la primera muestra de ARN en el Parafilm y se aspira con el PLI-100 para cubrir la aguja de la inyección. Asegúrese de verificar que la aguja está todavía dispensación 10 nl de la muestra antes de comenzar la inyección. </li><li> 20-30 inyectar dos células de embriones etapa (dos blastómeros) con 500 pg de ARN YFP en un plato y el gen de interés (por ejemplo, 20 pg Noggin ARN), además de ARN YFP en otro plato 7. </li><li> 100-200 lugar no inyecta embriones por cada punto de tiempo en el otro plato de la inyección con la solución de Ficoll. Moverlos dentro y fuera de la incubadora a la vez que los embriones inyectados. Estos son los anfitriones que se utilizan en la Parte IV. </li><li> Después de la inyección, todos los embriones se incuban a 14 ° C durante la noche. Repita este procedimiento para todos los tiempos. </li></ol> Parte III. Aislar a las tapas de los animales a partir de embriones inyectados <ol><li> Llegue temprano en la mañana a la etapa de los embriones. El menor período de tiempo debe estar en la etapa 9. Eliminar aquellos que no sobrevivieron. Continúe con los pasos siguientes de trabajo con cada punto del tiempo en lotes. </li><li> Retirar la solución de Ficoll de cada plato y añadir de nuevo MMR 0.7X / solución de gentamicina. A un plato de aislamiento de tapa, añadir una cantidad generosa de 0.7X MMR / gentamicina solución. Desalojar a los embriones de los pozos de inyección de plato con una pipeta de transferencia y el lugar en el plato de tapa de aislamiento recién preparada. </li><li> Aislar a las tapas de los animales en 0.7X MMR + solución de gentamicina, mantener 2 ó 3 embriones intactos para la estadificación. O bien el Gastromaster, equipado con una punta amarilla doblada a 400 micras, o un par de pinzas afiladas número 5 se puede utilizar. </li><li> Ponga las tapas en 14 ° C incubadora hasta el día siguiente. Los embriones de acogida deben ser retirados de la incubadora, al mismo tiempo como las tapas para evitar que en la misma etapa de desarrollo como el tejido de un donante. </li></ol> Parte IV. El trasplante de tapas en el flanco <ol><li> Quite las tapas y los embriones desde el punto de primera vez de los 14 ° C incubadora y la etapa de los embriones. Clasificar para el uniforme de color amarillo o rojo fluorescente-positivas las tapas, en función de la inyección del trazador (Figura 2). </li><li> Cuente el número de tapas y eliminar el doble del número de la etapa 12-13 embriones a un plato de inyección recién preparada con 0.7X MMR / solución de gentamicina. Con unas pinzas afiladas # 5, quitar la membrana vitelina de cada uno. Transferirlos a la plancha con los tapones, pero tenga cuidado. Sin su membrana vitelina, los embriones se puede disociar rápidamente en la superficie del agua. </li><li> Utilizando el gastromaster (punta amarilla, 200 250 micras alambre doblado, valor más alto) o # 5 pinzas, quite una de 200 micras cuadradas en la parte del embrión en la etapa 14-15 (Figura 3). Luego, cortar una tapa en la mitad (con la gastromaster o las pinzas # 5) y colocar el tejido en el agujero hecho en el embrión de acogida. Gire el embrión contra el bien para permitir la cicatrización. Haga esto para los embriones que puedas mientras están en la etapa 15. Repita este procedimiento para todos los tiempos. </li><li> El embrión usualmente sanan en un lapso de 30 minutos. Eliminar las células muertas (blancas) con un movimiento de cepillado suave con un fórceps # 5. Ellos crecen a 18 ° C durante la noche. </li><li> Bajo la lupa de fluorescencia, los embriones de tipo fluorescente con la etiqueta, el tejido trasplantado. Ponerlos de nuevo a 18 ° C para crecer hasta la etapa 42-43. </li><li> Anestesiar a los animales en tricaína. En este punto, usted puede tomar fotos debajo de un microscopio de fluorescencia de disección. Una vez haya terminado, fijar, sección y inmunotinción o llevar a cabo la hibridación in situ utilizando marcadores para tejido de interés. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diseño de plexiglás para la fundición del molde elastómero utilizado para la fabricación de platos embrión explotación. A 38 x 38 mm con las esquinas redondeadas cuadrados (~ 5 mm de profundidad), ha sido derrotado por un pedazo de plexiglás que es de 50 x 50 mm de lado y 25 mm de espesor. Circular, los pozos espaciados uniformemente (1,5 mm de diámetro) se han perforado 1 mm de profundidad en el plástico. Para hacer el molde de elastómero para los platos de microinyección, se vierte elastómero Sylgard en el plexiglás y permite que se solidifique, según las instrucciones del fabricante. Este molde elastómero se utiliza para hacer la inyección y las placas de tapa de aislamiento. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Tapa de la clasificación de los animales antes del trasplante es importante, ya que la expresión puede variar. Tapa de animales de la izquierda expresa mCherry uniformemente a través de los tejidos, mientras que el explante de la derecha tiene la expresión irregular y no se tiene. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. A tadp anfitriónole ha desarrollado una estructura con forma de ojo en su flanco de trasplantes de células de animales de la PAC. Una imagen fluorescente se ha superpuesto en la imagen de campo claro.

<ol><li>Smith, W. C., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+noggin%2C+a+new+dorsalizing+factor+localized+to+the+Spemann+organizer+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos.</a> Cell. 70, 829-840 (1992).</li>
<li>Lamb, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+induction+by+the+secreted+polypeptide+noggin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural induction by the secreted polypeptide noggin.</a> Science. 262, 713-718 (1993).</li>
<li>Green, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Methods+in+Developmental+Biology%3A+Xenopus+%26+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish.</a> Methods in Developmental Biology. , Humana Press. Towata, N.J. (1999).</li>
<li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Lan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin+Elicits+Retinal+Fate+in+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. , (2009).</li>
</ol>

En este video, hemos demostrado nuestra versión de las técnicas clásicas utilizadas por los biólogos de Xenopus, que reorganizan para crear la tapa de los animales del ensayo de transplante. A temperatura ambiente, los embriones de Xenopus se desarrollan muy rápidamente a través de las etapas 9 y 15. Poniéndolos a 14 ° C, el desarrollo del embrión es más lento y muchos más trasplantes se pueden realizar en un experimento. Si es necesario hacer crecer los embriones a los mayores niveles (&gt; 42/43), en...

<table><tbody><tr><td>Kit mMessage mMachine SP6</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Tubos capilares de borosilicato (1,0 mm de diámetro exterior x 0,5 mm de diámetro interior)</td><td>FHC, Inc.</td><td>27-30-1</td><td></td></tr><tr><td>Tractor de micropipetas Sutter</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de gentamicina [50 mg/ml]</td><td>Fisher Scientific</td><td>BW17-528Z</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Sylgard/elastómero 1,1 lb</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9644388</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de poliestireno de 60 x 15 mm</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>8609-0160</td><td></td></tr><tr><td>gonadotropina coriónica humana</td><td>Intervet Inc.</td><td>22219</td><td></td></tr><tr><td>Sistemas de microinyección Pico-Injector</td><td>Harvard Apparatus</td><td>650003</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora Torrey Pines Scientific ECHOtherm</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-680-21</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferencia</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>6290-20635A</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumostar n.º 5</td><td>Fisher Scientific</td><td>11295-10</td><td></td></tr></tbody></table>

determinación del tejido con el trasplante de cap animal (act) en el ensayo xenopus laevis</em

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Muchas proteínas juegan un doble papel en el desarrollo embrionario. Las que regulan la determinación de destino celular en un tejido específico también puede afectar el desarrollo de una región más grande del embrión. Esto hace que la definición de su papel en un determinado tejido difícil de analizar. Por ejemplo,<em&gt; Bocha</em&gt; Sobreexpresión en<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriones provoca la expansión de la región anterior completo, incluyendo el ojo<sup&gt; 1,2</sup&gt;. A partir de este resultado, no se sabe si Noggin desempeña un papel directo en la determinación de los ojos o que al causar una expansión del tejido neural, Noggin indirectamente afecta a la formación del ojo. Tener este fenotipo complejo hace que el estudio de sus ojos-papel específico en la determinación del destino de las células difíciles de analizar. Hemos desarrollado un análisis que supera este problema. Tomando ventaja de la naturaleza potente de la<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Animal tapa<sup&gt; 3</sup&gt;, Hemos desarrollado un ensayo para probar la capacidad del producto génico (s), como<em&gt; Bocha</em&gt; O los factores de transcripción de campo visual (EFTFs), para transformar las tapas en los tejidos o tipos celulares mediante el trasplante de este tejido en la parte del embrión<sup&gt; 4</sup&gt;. Si bien hemos encontrado ninguno de los tratamientos de proteína Noggin o un conjunto de factores de transcripción se puede determinar el destino de células de la retina en las tapas de los animales, este procedimiento podría ser utilizado para identificar productos génicos (s) involucrados en la especificación de otros tejidos.

Animales que sobreexpresan genes tapas de producto (s), se trasplanta al costado de desarrollo<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriones con el fin de establecer si el tejido está determinada.

Determinación del tejido Con el trasplante de Cap Animal (ACT) en el ensayo Xenopus laevis</em

Muchas proteínas desempeñan un papel dual en el desarrollo embrionario. Aquellas que regulan la determinación del destino celular en un tejido específico también pueden afectar el desarrollo...

El objetivo general del ensayo de CT es probar si un gen o genes de interés pueden especificar la dermis primitiva hacia un destino celular particular. El procedimiento comienza primero con la sobreexpresión de los ARN que codifican un gen reportero fluorescente y el gen o genes de interés en embriones en desarrollo de XUS lavis. El siguiente paso consiste en diseccionar el casquete animal o el odum primitivo que expresa los ARN sobreexpresados y cultivarlos hasta la etapa 15.El tercer paso del procedimiento consiste en eliminar el tejido del flanco de un embrión huésped en la etapa 15. El paso final es trasplantar la mitad del tejido del casquete animal donante al flanco del embrión huésped y cultivar el huésped hasta la etapa 42 a 43. Los resultados muestran la formación de tejidos ectópicos, como estructuras similares al ojo, mediante seccionado e inmunotinción para marcadores específicos de tejidos.Hola, soy y seno en el Departamento de Oftalmología de la Universidad Médica Upstate. Hoy les mostraré un procedimiento que llamamos el ensayo de trasplante de capa animal, que desarrollé en colaboración con Mike Suber. Utilizamos este ensayo en ambos laboratorios para estudiar los genes que son suficientes para la formación del ojo.Así que comencemos. Para iniciar este procedimiento, prepare los ARN de capuchón para la inyección transcribiendo noggin u otro gen de interés y YFP para usarlo como trazador. También prepare las soluciones basadas en MMR, un stock de solución ocho x para puesta de huevos y las agujas para inyectar los embriones.Se utiliza un molde de elastómero hecho a medida para fabricar platos de sujeción de embriones. Genere una placa de inyección por cada condición experimental derritiendo 1% AROS en 0,4 XMMR en un microondas. Transfiera aproximadamente seis mililitros de la solución a una placa de 60 milímetros.Coloque suavemente un molde de elastómero encima de la solución para evitar burbujas y deje enfriar durante aproximadamente 20 minutos. A temperatura ambiente, genere una placa de aislamiento de tapa por condición experimental, utilizando AGROS al 1% más XMMR 0,7 con moldes como se acaba de mostrar para las placas de inyección. Prepare placas adicionales para cada punto temporal.Consulte el protocolo escrito adjunto para obtener detalles sobre el cálculo de los puntos temporales. A continuación, aísle. Analice estos tejidos de una rana macho y almacene el tejido a cuatro grados Celsius en una solución estéril de 1 XMMR suplementada con 50 microgramos por mililitro de gentamicina.Esto puede hacerse hasta una semana antes del inicio del experimento, pero tenga en cuenta que el esperma pierde eficacia con el tiempo; realice la inyección en hembras con 500 unidades de gonadotropina coriónica humana al final del día anterior a la microinyección. Coloque a las hembras a 16-18 grados Celsius durante la noche.Ahora todo está listo para la microinyección al día siguiente. Comience retirando las hembras inducidas hormonalmente y colóquelas en tanques individuales que contengan un XELS. Prepare la aguja para la microinyección cortando la punta.Para obtener un diámetro de 25 a 35 micrómetros, coloque la aguja en el inyector pico PLI 100 y calíbrela para que administre 10 nanolitros por inyección. Establezca una incubadora a 14 grados Celsius colocando la salida a esta temperatura más baja después de inyectarlos con ARN; el desarrollo del embrión se ralentiza y se pueden realizar muchas más trasplantes en un experimento. Aproximadamente una hora antes de la fertilización, retire los huevos del tanque. Una vez que las hembras hayan puesto huevos durante una hora adicional, utilice una pipeta de transferencia para retirar los huevos recién puestos del tanque.Tenga en cuenta que no debe utilizar huevos que hayan estado en la solución ELS durante más de dos horas. Dado que la calidad de los huevos disminuye, coloque los huevos en placas de Petri de 60 milímetros. El recipiente está aproximadamente lleno en un 80 % con una sola capa de huevos.Elimine la mayor cantidad posible de ELS de los huevos y reemplácela con un XMMR. Los huevos pueden permanecer en un XMMR hasta por una hora. A continuación, fertilice in vitro los huevos con testículos homogenizados.Es recomendable fertilizar los embriones en tres lotes separados alrededor de las 11:00 a.m. y la 1:00 p.m. para que puedan desarrollarse hasta la etapa deseada: de 8,5 a nueve para el aislamiento del casquete y etapa 15 para el trasplante. Una hora después de la fertilización de los huevos, elimine la capa de gelatina de los huevos utilizando solución D de lavado de gelatina. Lávelos con abundantes cantidades de 0,1 XMMR y luego espere hasta que los huevos fertilizados alcancen la etapa de dos células.Para comenzar la selección, prepare un platillo de inyección lleno con 0,4 XMMR más 6% F ccal. Una vez que los embriones alcancen la etapa de dos células, utilice una pipeta de transferencia para seleccionar embriones con pigmentación uniforme y división pareja, y colóquelos en el pocillo del platillo de inyección.Continúe con el microinyección: primero estire el perfil sobre la parte superior de la tapa de una placa de Petri de 60 milímetros. Pipete dos microlitros de la muestra de ARN sobre la biopelícula y aspire. Utilice el inyector pico para llenar la aguja de inyección.Asegúrese de verificar que la aguja aún esté dispensando 10 litros de muestra antes de comenzar la inyección. El ARN se inyecta en ambos blastómeros de un embrión de dos células. Inyecte de 20 a 30 embriones, cada uno con 500 picogramos de Y-F-P-R-N-A, y colóquelos en un solo recipiente.Inyecte otros 20 a 30 embriones, cada uno con 20 picogramos de ARN de Nain premezclado con Y-F-P-R-N-A, y colóquelos en un platillo. Además, coloque de 100 a 200 embriones no inyectados por punto temporal en otro platillo de inyección que contenga la solución FICO. Introduzca y retire estos embriones del incubador al mismo tiempo que los embriones inyectados.Estos son los hospedadores que se utilizarán para trasplantar las tapas después de la inyección. Incubar todos los embriones a 14 grados Celsius durante la noche. Repetir para todos los puntos de tiempo planeados.Tras la incubación nocturna, se puede aislar el casquete animal. Llegue temprano en la mañana para determinar la etapa de los embriones. Recuerde retirar del incubador los embriones huésped no inyectados también.El primer punto temporal debe estar en la etapa nueve. Primero, retire los embriones que no sobrevivieron. A continuación, proceda a aislar los casquetes animales de los embriones viables, trabajando con cada punto temporal en lotes hacia un recipiente de aislamiento de casquetes. Agregue una cantidad generosa de solución de XMMR 0,7 X más gentamicina. Luego, deseche la solución de cada placa que contenga los embriones inyectados y agregue nuevamente solución de XMMR 0,7 X más gentamicina. Desprenda los embriones de los pozos del platillo de inyección utilizando una pipeta de transferencia y colóquelos en el platillo de aislamiento de capas recién preparado.Utilice el gastro máster equipado con una punta amarilla doblada a 400 micrómetros o un par de pinzas número cinco afiladas para aislar los casquetes animales en solución de 0,7 XMMR más solución de gentamicina. Mantenga dos o tres embriones intactos para la determinación de etapas. Después de aislar los casquetes animales, colóquelos nuevamente en el incubador a 14 grados Celsius junto con los embriones huésped hasta el día siguiente, cuando los casquetes se trasplanten al flanco de los embriones huésped.Retire los capuchones y los embriones huésped del primer punto temporal del incubador a 14 grados Celsius y clasifique los embriones para seleccionar capuchones uniformemente positivos para fluorescencia. Cuente el número de capuchones y retírelos. Doble el número de embriones huésped y colóquelos en un plato de inyección recién preparado con solución de 0.7 XMMR más gentamicina utilizando pinzas número cinco afiladas.Retire la membrana lene de cada embrión huésped. Trasfiera los embriones a la placa con las tapas, pero tenga cuidado ya que carecen de sus membranas lene. Los embriones pueden disociarse rápidamente en la superficie del agua utilizando el gastro master equipado con una punta amarilla que tenga un alambre doblado de 200 a 250 micrómetros en la configuración más alta o utilizando pinzas número cinco.Retire un cuadrado de 200 micrómetros de lado en el embrión en la etapa 14 a 15. Luego, nuevamente utilizando el gastro master o la pinza número cinco, corte un trozo de tejido por la mitad y colóquelo en el orificio hecho en el embrión huésped.Gire el embrión contra el pozo para permitir la cicatrización. Haga esto con tantos embriones como pueda mientras estén en la etapa 15. Repita para todos los puntos de tiempo.El embrión generalmente cicatriza en 30 minutos. Y con la pinza número cinco, retire las células muertas, que aparecen blancas, mediante un movimiento suave de cepillado. Incube los embriones trasplantados a 18 grados Celsius durante la noche.Después de la incubación nocturna, trabaje bajo el microscopio de disección de fluorescencia para separar los embriones que presenten el tejido trasplantado marcado con fluorescencia. Devuelva los embriones seleccionados a 18 grados Celsius para que crezcan hasta la fase 42 a 43. Cuando los animales alcancen la fase deseada, anestésielos en trica, examínelos bajo un microscopio de disección de fluorescencia y tome fotografías.Los embriones trasplantados pueden entonces fijarse, seccionarse e inmunotincionarse, o se puede realizar una hibridación in situ utilizando marcadores para un tejido de interés. A continuación se muestran resultados representativos de una renacuaja huésped con tejido donante que expresa un trazador fluorescente y nogina un día después del trasplante. Observe cómo el tejido forma una masa esférica en el costado de la renacuaja.Los embriones huésped que reciben tejido donante controlado expresando únicamente el trazador fluorescente ya comienzan a incorporar las células del casquete animal en su flanco. Unos días después, las renacuajos que reciben células donantes expresando nain forman estructuras similares a ojos en su costado, mientras que los renacuajos que reciben el tejido donante control tienen células fluorescentes en la superficie de su piel. Acabamos de mostrarle cómo realizar el ensayo de trasplante del casquete animal en Zaps Lavis.Al realizar este ensayo, es importante recordar tener todo preparado con anterioridad al procedimiento de ese día, para que los embriones no se desarrollen más rápido de lo que se puede atender. Eso es todo.Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.

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Investigación

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Biología

Xenopus epitelios embrionarios son un sistema modelo ideal para estudiar los comportamientos celulares, tales como el desarrollo de la polaridad y cambiar de forma durante la morfogénesis epitelial. Histología tradicional de muestras fijas cada vez se complementa con células vivas de imagen confocal. Aquí se demuestra métodos para aislar los tejidos de rana y visualizar en directo las células epiteliales y su citoesqueleto utilizando células vivas, la microscopía confocal.

Células vivas, imágenes y análisis cuantitativo de las células epiteliales embrionarias en Xenopus laevis</em

Xenopus laevis proporciona un sistema modelo ideal para el estudio de la especificación del destino celular y la función fisiológica de las células individuales de la retina en cultivo de células primarias. Aquí se presenta una técnica para la disección de tejidos retinales y la generación de cultivos de células primarias que se toman imágenes de la actividad del calcio y se analizaron mediante hibridación in situ.

Disección, Cultura y Análisis de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tejido de la retina embrionaria

Una técnica para el trasplante "Extreme anterior Dominio" tejido facial entre Xenopus laevis embriones se ha desarrollado. Los tejidos pueden moverse de un fondo de la expresión génica en otro, lo que permite el estudio de las necesidades locales para el desarrollo craneofacial y de señalización interacciones entre las regiones faciales.

Los trasplantes faciales en<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Los embriones

El manuscrito que aquí ofrece un simple conjunto de métodos para el análisis de la secreción y la difusión de ligandos marcados con fluorescencia en Xenopus. Esto proporciona un contexto para probar la capacidad de otras proteínas para modificar la distribución de ligando y permitir que los experimentos que pueden dar información sobre los mecanismos que regulan los gradientes de morfogenes.

Uso del análisis confocal de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Encargado de investigar moduladores de Wnt y Shh morfógeno Degradados

En los embriones de Xenopus, las células del techo del blastocelo son pluripotentes y pueden programarse para generar varios tejidos. Aquí, describimos los protocolos para usar explantes de techo de blastocoel de anfibios como un sistema de ensayo para investigar las características clave in vivo e in vitro del desarrollo neuronal temprano.

Celular-como Stem<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionarias explantes para Estudiar Características Temprana del Desarrollo Neural<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em

Describimos un sistema de ovocitos y capuchones animales de Xenopus para la clonación de expresión de genes capaces de inducir una respuesta en ectodermo competente, y discutimos técnicas para el análisis posterior de dichos genes. Este sistema es útil en la identificación funcional de una amplia gama de productos génicos.

Clonación funcional utilizando una<em&gt; Xenopus</em&gt; Sistema de Expresión de ovocitos

Este artículo presenta un método conveniente y rápido para la visualización de diferentes poblaciones de células neuronales en el sistema nervioso central de embriones de Xenopus utilizando la tinción de inmunofluorescencia en secciones.

La neurogénesis en la evaluación primaria<em&gt; Xenopus</em&gt; Los embriones Usando Inmunoticción

Este protocolo demuestra un método basado en la fluorescencia para visualizar la vasculatura y para cuantificar su complejidad en Xenopus tropicalis . Los vasos sanguíneos pueden visualizarse minutos después de la inyección de un colorante fluorescente en el corazón de un embrión después de manipulaciones genéticas y / o farmacológicas para estudiar el desarrollo cardiovascular in vivo .

Visualización y análisis cuantitativo de la angiogénesis embrionaria<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Describimos un protocolo para el xenotrasplante en la yema de embriones transparentes de pez cebra que se optimiza mediante un método de estadificación simple y rápido. Los análisis posteriores a la inyección incluyen la supervivencia y la evaluación de la carga de enfermedad de las células xenotrasplantadas mediante citometría de flujo.

Un método sencillo, rápido y eficaz para el análisis de xenotrasplantes tumorales en embriones transparentes de pez cebra

Esta es la primera parte de un protocolo integral de muestreo de Xenopus . Los tejidos muestreados son el ventrículo cardíaco, el tronco arterial, el lóbulo hepático izquierdo, la vesícula biliar, el pulmón, el páncreas, el bazo, la laringe, el esófago, el estómago, los intestinos, los testículos, los cuerpos grasos, el oviducto, los riñones pareados, el plexo ciático, la piel, el timo y todo el ojo.

Técnicas eficientes para el muestreo exhaustivo de tejidos accesibles en xenopus adulto

Aprende el ensayo de trasplante de capa animal en Xenopus laevis para estudiar la determinación del destino tisular mediante sobreexpresión génica. Este método permite analizar la formación de tejidos ectópicos como estructuras oculares.

Determinación del tejido Con el trasplante de Cap Animal (ACT) en el ensayo Xenopus laevis

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