Vídeo Bioinformática Análisis de Crecimiento Humano Colonia células madre embrionarias

Este protocolo demuestra el método de bioinformática de video para medir el crecimiento de colonias de células madre embrionarias humanas mediante el análisis de videos de lapso de tiempo recopilados en una incubadora de TC de icon biostation, equipada con una cámara para imágenes de video. Las colonias de células madre embrionarias humanas o HESC se cultivan hasta un 70% de fluidez, se resiembran y se incuban durante 48 horas, después de lo cual las colonias HESC se filman durante 48 horas adicionales en el Biot ct. La tasa de crecimiento se determina utilizando la mejora de la segmentación y las recetas de medición desarrolladas con el software CL quant.

Las recetas se validan en comparación con Adobe Photoshop, una herramienta de análisis de imágenes que permite el ajuste manual preciso de la mascarilla a cada colonia. El campo emergente de la bioinformática en vídeo puede utilizarse para automatizar el procesamiento, el análisis y la extracción de datos biológicos a partir de vídeos microscópicos. Hola, soy Serena Lin del laboratorio del Dr. Prou Talbot en el Departamento de Biología Celular y Neurociencia aquí en la Universidad de California Riverside.

Hola, soy Sean Fino, también del Talbot Lab. Hola, soy TI Satish del Programa de Posgrado en Biología Celular Molecular y del Desarrollo. Hoy te mostraremos cómo medir el crecimiento de colonias de células madre embrionarias humanas utilizando herramientas de bioinformática en vídeo.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para medir los efectos de los tóxicos ambientales en el comportamiento de las células madre embrionarias humanas. Demostraremos este procedimiento en nuestra nueva instalación central de células madre. Así que comencemos.

Para preparar HESC para el análisis de video, cultive HESC en placas de seis pocillos recubiertas con matrigel hasta que el 70% del medio aspirado confluente de un pocillo que contenga HESC y enjuague dos veces con un mililitro de PBS. Agregue un mililitro de Accutane e incube durante un minuto a 37 grados centígrados en 5% de dióxido de carbono. A continuación, agregue de 10 a 12 cuentas de vidrio en el pozo y agite el plato suavemente hasta que las colonias se desprendan por completo.

Neutralice Accutane utilizando un mililitro de células madre embrionarias humanas de mantenimiento, medio o fibroblastos embrionarios de ratón condicionados. Recoja las células desprendidas sin las perlas en un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue a 200 g durante tres minutos. Decantar el SUP natant y romper el pellet con 500 microlitros de medio de mantenimiento de células madre embrionarias humanas frescas o placa M-T-E-S-R 100 microlitros de la suspensión HESC gota a gota en múltiples pocillos de una placa recubierta de matrigel de 12 pocillos.

Balancee la placa hacia adelante y hacia atrás suavemente y observe los cultivos bajo un microscopio óptico para hacer que los grupos de células se distribuyan uniformemente por todos los pocillos. Coloque la placa en una incubadora a 37 grados y 5% de dióxido de carbono durante 48 horas para asegurarse de que las celdas estén conectadas planas y lo suficientemente grandes como para visualizarlas fácilmente. Después de 48 horas, aspire el medio y lave los pozos con 500 microlitros de PBS para eliminar las células no adheridas, luego agregue 500 microlitros de medio M-T-E-S-R a cada uno.

Bueno, coloque inmediatamente la placa en el Biot CT y comience a recopilar imágenes de lapso de tiempo. Trate de seleccionar campos con colonias individuales discretas que no sean propensas a convertirse en otras colonias. En este protocolo, las células se graban en vídeo durante 48 horas adicionales con fotogramas a intervalos de siete minutos.

Para crear primero la receta de segmentación, escanee manualmente todo el video para verificar que contiene una sola colonia que permanece enfocada durante todo el período de grabación. Después de esto, abra el asistente de segmentación en el software CL quants y haga clic en el botón siguiente. Seleccione el canal de imagen correcto y haga clic en el botón siguiente.

Elija coincidencia suave y haga clic en Siguiente. Seleccione una o dos regiones deseadas rodeando el borde exterior hasta el área central de la colonia. Esta área debe ser lo más pequeña posible, pero debe ser representativa de toda la colonia.

No elija demasiadas regiones, ya que esto puede resultar en una aplicación incorrecta de la mascarilla. Haga clic en el botón Siguiente. Seleccione No quiero regiones encerrando en un círculo regiones que no forman parte de la colonia y que no forman parte del fondo.

Estas regiones tienen patrones que deben suprimirse, como los desechos y las células muertas. Haga clic en Siguiente. Seleccione el fondo encerrando en un círculo las regiones que no son colonias, escombros o células muertas.

El fondo debe ser uniforme y probable que aparezca en cada fotograma. Por lo general, seleccionamos el fondo gris alrededor de la colonia. Haga clic en el botón Siguiente.

Se debe mostrar una máscara de color sobre la región de interés si la máscara no cubre con precisión la región de interés. El rango del umbral de segmentación en la esquina inferior derecha de la pantalla puede aumentarse o disminuirse si es necesario cambiar la máscara. Seleccione Actualizaciones de regiones de coincidencia suave.

Esto permite cambiar las áreas de deseo, no quiero o fondo. Si la mascarilla es satisfactoria, seleccione aplicar umbral y guardar mi mascarilla. A continuación, haga clic en el botón Siguiente.

A continuación, la máscara se mostrará en un color diferente. Seleccione finalizar. La receta debe mostrarse en la esquina superior derecha del software como receta de segmentación.

Cambie el nombre de la receta si lo desea haciendo clic con el botón derecho e ingresando un nuevo nombre. Para aplicar la receta. Haga clic con el botón derecho y coloque el mouse encima.

Aplicar receta. Aparecerá un menú que permite seleccionar el número de fotogramas a utilizar. Establezca el intervalo de fotogramas en cada 20 fotogramas para garantizar la fidelidad de la máscara.

Compruebe manualmente aleatoriamente el 10% de los fotogramas a los que se aplicó la máscara para crear una receta de mejora que elimine las regiones no deseadas de los residuos. Haga clic con el botón secundario en la carpeta de recetas de mejora y, a continuación, haga clic en nuevo. Se debe mostrar una nueva receta de mejora desde el campo de visión original.

Mueva el ratón sobre los iconos de la barra de herramientas para identificar el botón del módulo de mejora de alternancia situado a la derecha de la imagen y haga clic en él. Seleccione el menú desplegable de etiquetado. Seleccione el etiquetado para los dos conectados.

Debería mostrarse una nueva barra de tareas. Tome la máscara inicial de la receta de segmentación y arrástrela al cuadro de entrada. La barra ahora debería mostrar el número de máscara de entrada.

Arrastre el icono con el número de máscara de entrada hasta el icono de máscara cero. Busque el tamaño mínimo en la barra de tareas y ajuste el número hasta que solo se muestre la región de interés. Asegúrese de hacer clic en ejecutar para cada prueba de ajuste.

Una vez que el ajuste de tamaño mínimo sea satisfactorio, haga clic en la receta de mejora anterior en la parte inferior de la pantalla, seleccione guardar en receta. El software ahora solicita sobrescribir la receta seleccionada y seleccionar sí el punto. Verifique la receta de mejora utilizando el mismo procedimiento que el de la segmentación de verificación puntual.

Si está satisfecho con las recetas de segmentación y mejora, continúe creando la plantilla de medición. Para comenzar a seleccionar, cree una plantilla de medición en la barra de herramientas de la derecha. En la ventana de medición, seleccione mover el cursor sobre la figura de celda de imágenes prediseñadas.

Mantenga presionada la tecla de control y seleccione la celda en la sección de morfología, desmarque el parámetro predeterminado y verifique el parámetro de área. A continuación, salga de la ventana de la plantilla. Seleccione el icono.

Crear receta de medición. Cambie el nombre de la receta. Mover a la pestaña y seleccionar plantilla En la esquina superior derecha, arrastre y suelte la plantilla de medición creada anteriormente en la ventana de medición.

Haga clic en Sí para continuar en la ventana de receta de medición, seleccione Asignaciones de canales. A continuación, se seleccionan las asignaciones de máscaras de celda completa. A continuación, seleccione la opción de celda completa Para mejorar la máscara, seleccione la receta de medición en la pestaña de recetas.

En la ventana principal, seleccione el icono Guardar dentro de la ventana de la receta de medición. A continuación, cierre la ventana Siguiente cierre y vuelva a abrir el campo de visión. Haga clic con el botón derecho en la carpeta de la lista de recetas y, a continuación, haga clic en nuevas, arrastre las recetas en el orden de la aplicación necesaria a la lista de recetas, seleccione bloquear la lista de recetas y ejecute las recetas secuencialmente en los datos de vídeo con Adobe Photoshop.

Se analizaron 20 fotogramas de las mismas colonias. Abra manualmente un marco de una imagen de colonia en Adobe Photoshop. Haga clic en la herramienta de varita mágica en la barra de herramientas.

Haga clic en el área alrededor de la colonia para que todo el campo quede cubierto excepto la región de la colonia. Asegúrate de que la línea punteada alrededor de la colonia encaje justo alrededor de la periferia de la colonia y no dentro de ella. Si la línea de puntos no está alrededor de la periferia, cambie el valor de tolerancia en la barra de herramientas superior según corresponda.

Haga clic en editar en el modo de máscara rápida en la barra de herramientas y haga clic en la colonia para que se seleccione la colonia. Vaya a la ventana, despliega el menú desplegable y haga clic en histograma. La caché debe establecerse en uno.

Si la caché es dos, haga clic en la expresión exclamativa para cambiar la caché a uno. Registre el valor del píxel en una hoja de cálculo. Repita el proceso anterior cada 20 fotogramas.

Los datos recopilados con Photoshop y el software CL quant se pueden trazar juntos. Nuestro protocolo para cuantificar el crecimiento de colonias de HESC demuestra una aplicación de la bioinformática en vídeo a un problema biológico. Aquí mostramos un gráfico que compara el aumento en el tamaño de la colonia durante 48 horas según lo determinado utilizando el software CL quant y Adobe Photoshop.

El gráfico muestra cinco colonias diferentes, cada una analizada por ambos paquetes de software. Cada colonia está representada por un color diferente. Las líneas continuas se derivaron con el software sail quant, mientras que las líneas punteadas se recogieron con Photoshop.

El gráfico de los datos brutos muestra que ambos métodos de medición están de acuerdo para tener en cuenta el hecho de que las colonias tienen un tamaño inicial diferente. Esta figura muestra los datos retrazados como el aumento porcentual en el tamaño de la colonia. Las tasas de crecimiento son similares independientemente del tamaño de la colonia inicial y ambas medidas de análisis dan resultados similares.

El siguiente gráfico muestra las medias de los datos de cambio porcentual anteriores sobre el crecimiento de las colonias HESC. Este gráfico muestra claramente una buena concordancia entre el análisis realizado con bioinformática de vídeo y Adobe Photoshop. Acabamos de mostrarte cómo medir el crecimiento de colonias de células madre embrionarias humanas utilizando herramientas de bioinformática en vídeo.

Al realizar este procedimiento con microscopía de contraste de fase, asegúrese de incluir el halo alrededor de la colonia para una selección precisa de la colonia por parte del software. También es importante recordar que se pueden utilizar otros métodos de cultivo, incubación y recolección de videos en lugar del protocolo que demostramos. Una vez que se desarrollen y validen las recetas, realizarán el análisis mucho más rápidamente y con menos variación experimental que el análisis manual.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.