Detección rápida homogénea de Ensayos Biológicos Usando el Sistema de modulación magnética biosensores

La biosensación mediante modulación magnética o MMB es una técnica novedosa para la detección de moléculas biológicas. Aquí se muestra un ensayo de prueba de principio en el que se detecta la interleucina ocho cuando se añade interleucina ocho, también llamada IL ocho, a una mezcla de reacción que contiene microesferas magnéticas recubiertas con anticuerpos mediante un anticuerpo anti-IL ocho inmovilizado y estreptavidina marcada con un fluoróforo. Se crea efectivamente un sándwich molecular que une la molécula fluorescente a la microesfera magnética.

La reacción se coloca en un vete y en un campo magnético alterno. Se aplican gradientes mediante dos polos electromagnéticos, que mueven las perlas en un movimiento oscilatorio. El movimiento periódico de la perla con proteínas fluorescentes entrando y saliendo de un haz láser ortogonal produce una señal fluorescente que es recogida por un PMT y demodulada.

Utilizando un amplificador de bloqueo, el movimiento de los corpúsculos puede visualizarse mediante una cámara CCD en lugar del PMT; se observa un movimiento sincrónico en muestras donde los corpúsculos magnéticos se han unido a proteínas fluorescentes mediante IL-8. Hola, soy Adia del Laboratorio de Óptica No Lineal y Láser del Departamento de Electrónica Física de la Universidad de Tel Aviv. Soy NoGo del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad de Illinois en Chicago, y soy Marcelo Erlich del Departamento de Investigación Celular e Inmunología de la Universidad de Tel Aviv.

Hoy les mostraremos un método para la detección homogénea rápida de ensayos biológicos mediante un sistema de biosensado con modulación magnética. Estamos utilizando este procedimiento en nuestro laboratorio para detectar proteínas y secuencias de ADN específicas a bajas concentraciones. Así que comencemos.

Comience este procedimiento preparando y etiquetando un tubo para cada reacción, incluyendo una muestra diana y una muestra control no diana. A cada tubo, añada los siguientes componentes del ensayo de citocinas Bio-Plex Precision Pro, uno por uno: perlas magnéticas acopladas, anticuerpo de detección IL-8, estreptavidina-PE y el analito IL-8. Ajuste el volumen hasta 100 microlitros con tampón de ensayo, luego agite durante 30 minutos en un agitador orbital compacto.

Después de agitar las muestras durante 30 minutos a temperatura ambiente, colóquelas directamente en cubetas para su análisis. Con el sistema MMB, limpie las cubetas transparentes utilizando un tejido para limpieza de lentes y etanol al 70 %. El instrumento utilizado para el análisis consta de un láser de 488 nanómetros, duplicado en frecuencia, que sirve como fuente de luz de excitación dirigida mediante un divisor de haz dicróico de 562 nanómetros hacia una lente objetivo de microscopio.

La lente del objetivo del microscopio enfoca el láser en un haz de 27 micrómetros de ancho en un tubo de vidrio silicato BO de 400 micrómetros de ancho. La luz emitida se filtra espectralmente mediante dos filtros de paso de banda sucesivos, se detecta mediante un fotomultiplicador o PMT y se demodula utilizando un amplificador de detección por sincronización. Se utiliza un modulador de corriente casero para entregar una onda cuadrada sucesivamente a cada electroimán.

La amplitud debe ser de 1,4 amperios con una frecuencia de uno a seis hercios, ya que las perlas entran y salen del haz láser dos veces en cada ciclo. La frecuencia de demodulación en el amplificador de bloqueo es de dos a 12 hercios. Inicie el sistema girando la llave del láser de 488 nanómetros a la posición de encendido y activando la alimentación eléctrica.

Luego, ajuste la potencia del láser al mínimo, aproximadamente entre cuatro y seis milivatios. Encienda el osciloscopio y después encienda el PMT. A continuación, coloque la muestra vetada entre los dos polos electromagnéticos.

Utilice la etapa rotacional del vete para asegurar que el haz láser atraviese el vete y no impacte en las paredes del vete. Utilice la etapa de traslación XY, Z del vete para cambiar su posición con respecto a la lente del objetivo y a los polos electromagnéticos. Para optimizar el acoplamiento de la luz fluorescente hacia el detector, el vete debe colocarse ligeramente detrás de la línea de los polos.

Ahora configure el osciloscopio para la medición de trazado temporal. Ajuste el control de ganancia del PMT a 0,5 voltios. A continuación, encienda el modulador de corriente y establezca la frecuencia en tres hercios.

Espere 30 segundos para permitir la agregación y condensación de las perlas. Las perlas magnéticas comenzarán a oscilar, acercándose al frente del tubo. Cuando el haz láser impacte en las perlas oscilantes, debería observarse un parpadeo de luz láser reflejada proveniente de las perlas.

Observe que las perlas se mueven más rápido cuando se aumenta la modulación de la corriente y más lento cuando se disminuye. La posición de las perlas en el tubo puede ajustarse utilizando etapas controladas por micrómetro. Para mover los polos, el movimiento de las perlas puede visualizarse mediante una cámara CCD que se coloca en lugar del PMT.

El osciloscopio detecta la señal periódica proveniente de las perlas acopladas con fluorescencia y registra el rastro temporal del osciloscopio. Los datos guardados pueden analizarse utilizando MATLAB. Se ensayaron mezclas de reacción con y sin IL ocho mediante MMB. En todas las reacciones con el objetivo, las perlas formaron un único agregado denso que se movía hacia dentro y hacia fuera del haz láser de forma sincronizada.

Sin embargo, sin el objetivo, las perlas estaban menos agregadas y su movimiento era menos unido. Aquí, el reloj de modulación del polo mostrado en amarillo y la señal de salida del PMT mostrada en magenta representan la frecuencia de modulación para cada polo a dos hercios. Por lo tanto, la frecuencia de demodulación es de cuatro hercios, como se espera teóricamente.

Cuando las perlas pasan por el haz láser, el PMT detecta la luz fluorescente y se produce un pico en el voltaje de salida del PMT cuando la señal del PMT y el reloj de doble modulación se introducen en el amplificador de bloqueo. El detector de fase sensible proporciona la sincronización y genera un alto voltaje. Los dos colores indican dos escaneos diferentes a la misma concentración objetivo.

Las líneas negras representan el promedio de cada señal. El amplificador de bloqueo no detectó ninguna señal cuando se probó la muestra de control. El amplificador de bloqueo no proporcionó ninguna señal bloqueada para este caso.

Este hecho, junto con la diferencia visual en la agregación, sugiere que el sistema MMB y la diferencia en las mediciones del rastreo temporal de la señal de salida del PMT pueden identificar claramente la presencia del objetivo ILH. Acabamos de mostrarle cómo detectar rápida y homogéneamente moléculas biológicas utilizando la modulación magnética. Biosensado con IL ocho como ejemplo.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar seguir los procedimientos de seguridad con láser. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.