Name: Microinyección de embriones de medaka para su uso como un organismo modelo genético (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Aprende la técnica de microinyección en embriones de medaka para analizar la función génica en vertebrados. Este método permite estudiar expresión génica in vivo a nivel de célula única con observación microscópica.

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Este trabajo fue apoyado por una beca de la MRC.

1. El apareamiento y la recolección de huevos <ol><li> Medaka mujeres y hombres se pueden distinguir fácilmente por el tamaño y la forma de las aletas anal y dorsal. Las aletas anales de los machos son más grandes y con forma de paralelogramo, en comparación con el de las hembras. La aleta anal femenino es más pequeño y con forma de triángulo. La aleta dorsal macho tiene una muesca profunda claramente visible entre los dos últimos rayos. </li><li> Medaka poner hasta 40 huevos todos los días y las hembras llevan los huevos medaka agrupadas en su vientre por filamentos de unión durante varias horas antes de que se despojó a las plantas en el tanque. </li><li> Las hembras pueden quedar atrapados en una red y mantenida en el interior suavemente de ambos lados con una sola mano. Los huevos se pueden suavemente burla de la barriga con el dedo índice de la otra mano. La hembra puede ser devuelto al tanque. Los huevos deben ser transferidos a una placa de Petri de 6 cm llena de medios de embriones con fórceps romos o un dedo. </li><li> Pares medaka rara vez luchan cuando se mantienen en una caja pequeña de apareamiento. Por lo tanto, se pueden mantener en un pequeño tanque con flujo de agua para que puedan ser alimentados y los huevos se pueden recoger desde el mismo par todos los días durante un par de meses. </li><li> Es importante que las hembras no deben ser mantenidos sin los hombres, ya que la ovulación ocurre todos los días en las mujeres medaka. De lo contrario, las mujeres no pueden entregar los huevos y sentirse mal. </li></ol> 2. Embriones de limpieza <ol><li> Transferencia agrupado los huevos con una pipeta de vidrio al papel de lija (P2000 tamaño de grano, resistente al agua) colocado en la tapa de una caja de Petri de 9 cm. Retire el exceso de medio, sino garantizar un volumen suficiente como para evitar que restos de secado de los embriones. </li><li> Ruede suavemente los embriones en el papel de lija con el dedo índice, aplicando una presión mínima y manteniendo los dedos en paralelo a la superficie del papel de la arena durante unos 45-60 segundos para eliminar algunos de los pelos de la superficie externa del corion. No ruede más de 5.7 embriones a la vez esta precaución reducirá al mínimo el riesgo de aplastamiento de los embriones por debajo de la otra. </li><li> La transferencia de embriones limpia con un plato fresco de medio embrión. </li></ol> 3. Hacer las placas de agarosa para la celebración de los embriones durante la microinyección Los embriones se mantienen en depresiones durante la inyección hecha con un molde de plexiglás en el 1,5% de agarosa (Figura 1). La concentración de agarosa es importante mantener los embriones correctamente. <ol><li> En primer lugar, hacer un marco de agarosa para mantener el molde de plexiglás. Vierta agarosa al 1,5% en agua a una profundidad de 0,5 cm en una placa de Petri de 9 cm y esperar hasta que se solidifica por completo. Recorta una zona de la agarosa sólo mayor que el tamaño del molde. </li><li> Vierta agarosa al 1,5% para rellenar el área de corte y colocar el molde para que no queden atrapadas burbujas y esperar hasta que se solidifica de agarosa. Esta placa de agarosa se puede almacenar en el refrigerador para acelerar solidifaction. </li><li> Retire el molde para crear canales para sostener los huevos. Añadir medio embrión suficiente para sumergir el molde, cubrir y guardar a 4 ° C hasta que se necesite. <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Esquema de la medida del molde utilizado para preparar los canales en placas de agarosa para la microinyección. </li></ol> 4. Microinyección de embriones medaka En medaka, ADN, ARN, oligonucleótidos morfolino y tintes trazadores microinyección a través del corion en el citoplasma del 1 al 64 de células embrionarias etapa en lugar de la yema como en el pez cebra. Desde el citoplasma es más pequeño y menos visible en medaka, práctica mediante la inyección de colorantes como la rodamina dextrano se recomienda para desarrollar esta habilidad. Además del rojo de fenol como trazador también se anima a permitir la confirmación de las inyecciones. A medida que el corion rodea embriones medaka es duro, una aguja corta, fuerte inyección de ancho y es necesario (Figura 2). Prepare esta aguja fuerte inyección de ancho de un filamento de vidrio que contienen capilares. <ol><li> Preparar la solución de la inyección con rojo fenol como trazador y cargarlo en la aguja de la parte posterior con un microloader Eppendorf. Conecte la aguja del inyector de aire de la bomba. </li><li> Los huevos se recogerán y agrupado tan pronto como sea posible después de la fertilización para inyectar en el estadio de una célula. Más embriones pueden ser inyectados por el almacenamiento en hielo (no más de 30 minutos) para detener la división celular. <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Comparación de las agujas medaka y pez cebra. Tenga en cuenta que la punta de la aguja de MF (arriba) es más corto y más ancho por lo tanto, más fuerte para perforar el corion dura alrededor de embriones medaka. </li><li> La transferencia de los huevos en la placa de agarosa y alinearlos en las bateas con una pinza. Justo antes de la inyección, cinco huevos se deben rotar por lo que la membrana celular del citoplasma de una célula puede ser golpeado por THe aguja perpendicularmente. El citoplasma de la célula se puede encontrar buscando en un área desprovista de pequeñas gotitas de aceite que es opuesto al del lado del huevo con gotas de aceite más denso. El ámbito en el que se puede confirmar que el citoplasma de vista desde el lado. </li><li> Coloque la aguja cerca de los huevos. Abra la punta de la aguja tocando suavemente la punta de la aguja para el corion o el uso de microforceps (Figura 3). Una pequeña cantidad de sustancia de la inyección se debe considerar que el flujo hacia fuera. </li><li> Punción a través del corion para colocar la punta de la aguja en su interior del corion. Ajustar la presión de la celebración del inyector a ser relativamente alta, para asegurar que no se produce el reflujo, debido a la alta presión sobre la punción a través del corion duro (configuración de 80-100hPA de presión de mantenimiento y 500 700 hPa para la presión de inyección). </li><li> Inserte la punta de la aguja en el citoplasma por bruscamente empujando su membrana. No inserte la punta de la aguja en la yema. A diferencia de pez cebra, la sustancia inyectada en la yema no será transferida al citoplasma. Líquidos inyectados tienen un límite distinto cuando se inyecta en la yema de huevo, mientras que la frontera es borrosa cuando está en el citoplasma (Figura 4). De vez en cuando la aguja puede ser bloqueada por agarosa / escombros. Fórceps puede ser usado para tocar / rebreak el extremo de la aguja y eliminar el bloqueo. Si la aguja se rompe en cualquier momento durante la inyección de burbujas, se verá en el medio del embrión y la sustancia que se inyecta se perderá. Las inyecciones deben ser realizadas de manera sistemática, de arriba abajo a lo largo de los canales de agarosa y de izquierda a derecha en el molde. </li><li> Embriones inyectados debe ser transferido a un recipiente limpio con medio embrión y el desarrollo a la temperatura adecuada. <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Romper la punta de la aguja antes de la inyección. 1: Mueva la punta de la aguja cerca del corion del embrión; 2: Toca el corion y mover la aguja hacia atrás y hacia adelante suavemente para romper la punta; 3: Cuando una pequeña cantidad de sustancia de inyección fluye fuera de la final de la aguja, lo que confirma la rotura de la punta. </li></ol> 5. Los resultados representativos <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Imágenes representativas de inyectar embriones medaka. El panel A muestra una imagen representativa de la inyección correcta de rodamina dextrano en el citoplasma de una célula del embrión etapa medaka. El panel B muestra una imagen representativa de la inyección incorrecta de rodamina dextrano en el saco vitelino de un estado embrionario de las células medaka. Los paneles C y D muestran los embriones de los grupos A y B, respectivamente, en aproximadamente 30 horas después de la inyección. EM: embrión, es anterior al alza en los paneles C y D y el punto de vista es dorsal. Tenga en cuenta que el cuerpo del embrión en el panel D no es rojo como el medio de contraste se inyectó correctamente en el saco vitelino. Las flechas en B y D indican rodamina dextrano inyecta incorrectamente en el saco vitelino en cuenta el límite circular distintas. Las líneas de puntos en A y B indican esquema del citoplasma de una célula, vista es lateral.

<ol><li>Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+genome-wide+screen+for+mutations+affecting+organogenesis+in+Medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes.</a> Mech Dev. 121, 647-658 (2004).</li>
<li>Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medaka+and+zebrafish%2C+an+evolutionary+twin+study%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study.</a> Mech. Dev. 121, 629-6237 (2004).</li>
</ol>

En este vídeo, se demuestra un método para trazador celular, ARNm, ADN o anti-sentido de la inyección de oligonucleótidos en una etapa de células de embriones medaka. Esta técnica nos ha permitido estudiar diversos procesos de desarrollo in-vivo en tiempo real. Este proceso y el análisis detallado posterior que ofrece tiene el potencial de mejorar significativamente nuestra comprensión de la organogénesis de vertebrados y la biología celular subyacente. Tal conocimiento puede ser importante para el, y el rendimiento de las aplicaciones terapéuticas en medicina regenerativa.

<table><tbody><tr><td>Red de malla fina de 4&quot;</td><td>Herramientas</td><td>J K Aquatics Ltd.</td><td>MD001</td><td>Utilizada para capturar peces durante la recolección de huevos.</td></tr><tr><td>Medio para embriones</td><td>Reactivo</td><td>Elaborado en el laboratorio</td><td></td><td>200 ml de solución stock 50X, 1 ml de azul de metileno al 1% en H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O/10 litros de agua RO (solución stock 50X: NaCl 14,7 g, KCl 0,6 g, CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 2,4 g, MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 4,0 g/1 litro de agua RO).</td></tr><tr><td>Papel de lija impermeable de grano fino - tamaño de grano p2000</td><td>Herramientas</td><td>Hermes Abrasives Ltd.</td><td></td><td>Tamaño de grano muy fino para rodar/limpiar embriones con corion.</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio borosilicatado</td><td>Herramienta</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC100-10F</td><td>Para fabricar agujas de microinyección.</td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>Equipo</td><td>Narishige International</td><td>Modelo PP-830</td><td>Para fabricar agujas de microinyección.</td></tr><tr><td>Micropipeta cargadora Eppendorf</td><td>Herramienta</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td>Para cargar agujas de microinyección.</td></tr><tr><td>Aparato de microinyección</td><td>Equipo</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Modelo 5242.</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Equipo</td><td>Narishige International</td><td></td><td>Modelo MN151.</td></tr><tr><td>Placa de agarosa para inyección</td><td>Herramientas</td><td>Elaborada en el laboratorio</td><td></td><td>Para sostener embriones durante la inyección.</td></tr></tbody></table>

microinyección de embriones de medaka para su uso como un organismo modelo genético

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

En este vídeo, se demuestra la técnica de microinyección en un escenario de células de embriones medaka. Medaka es una pequeña puesta de huevos de peces de agua dulce que permite a los análisis genéticos y embriológicos y es uno de los organismos modelo vertebrado en el que todo el genoma impulsado fenotipo mutante pantallas se llevaron a cabo 1, como en el pez cebra y el ratón. Divergencia de superposición de funciones de los genes relacionados entre medaka y pez cebra permite la identificación de los fenotipos de la novela que no son identificables en una sola especie 2, por lo tanto medaka y pez cebra son complementarios para la disección genética de las funciones de genoma de los vertebrados. Para aprovechar las ventajas de los peces medaka cuyos embriones son transparentes y desarrollar el exterior, la microinyección es una técnica fundamental para inyectar células marcadores de las células de etiquetado, ARNm o de oligonucleótidos antisentido para la sobre-expresión y derribando los genes de interés, y las autoridades nacionales designadas para la toma de líneas transgénicas.

Medaka y pez cebra son complementarios para la disección genética de las funciones de genoma de los vertebrados. Este protocolo pone de relieve los puntos clave para el éxito de microinyección en embriones medaka, una técnica importante para el análisis embriológicos y genéticos con medaka y pez cebra en un laboratorio.

Microinyección de embriones de medaka para su uso como un organismo modelo genético

En este video, demostramos la técnica de microinyección en embriones de medaka en etapa de una célula. El medaka es un pez de agua dulce ovíparo pequeño que permite...

El objetivo general de este procedimiento es determinar la función del gen o proteína mediante la interrupción de los patrones normales de expresión de su gen o proteína de interés. Esto se logra primero preparando los moldes de aros y las agujas de inyección. El segundo paso del procedimiento consiste en recolectar embriones en estadio de célula media en el estadio de una sola célula.El tercer paso del procedimiento consiste en orientar los embriones de una sola célula en la posición correcta para la inyección. El paso final del procedimiento es inyectar trazadores celulares, ARNm u oligonucleótidos antisentido en los embriones de una sola célula en estado medio. En última instancia, los resultados pueden obtenerse mediante observación microscópica que muestre cambios morfológicos, fisiológicos o moleculares asociados con la proteína afectada por la sustancia inyectada.Hola, soy Sean Brazinski del laboratorio de la Dra. Makoto Seki del Departamento de Biología y Bioquímica de la Universidad de Bath. También soy miembro del completo laboratorio Seki. Hoy les mostraremos un procedimiento para la microinyección de embriones de Meca con trazadores celulares, ARNm y oligonucleótidos antisentido.Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la función del gen de interés in vivo a nivel de célula individual. Así que comencemos. A diferencia del pez cebra, los machos y las hembras de maka se pueden distinguir fácilmente por sus aletas dimórficas.Las aletas femeninas tienen una forma redondeada con un margen liso. Tanto la aleta anal como la dorsal del macho son más grandes que las de la hembra, y la aleta dorsal presenta una muesca profunda entre los dos últimos radios. Mantenga una pareja reproductora de meca en un tanque de apareamiento con o sin flujo de agua.Este P puede mantenerse en el tanque con agua corriente durante hasta dos meses. Para inyecciones diarias, la hembra pone hasta 40 huevos diariamente, que se agrupan en el vientre mediante filamentos de fijación. Utilice una red para atrapar y retirar una hembra del tanque y sostenga el pez con una mano para asegurarlo dentro de la red. Separe suavemente los huevos con el dedo índice.Devuelva la hembra al tanque. Utilice pinzas o el dedo índice para transferir los huevos a una placa de Petri de seis centímetros llena con medio para embriones. Bajo un microscopio estereoscópico, use dos pares de pinzas para cortar los filamentos de fijación y separar los huevos.Recoger los embriones con una pipeta de pasta para separarlos de las heces y las algas, y transferir un máximo de 40 huevos a un recipiente con medio embrionario fresco. Coloque los huevos sobre hielo si va a microinyectarlos inmediatamente. Alternativamente, manipule la velocidad de desarrollo hacia estadios posteriores mediante variaciones en la temperatura de incubación.Se requiere un molde de plexiglás para fabricar placas de agarosa para sostener embriones durante la inyección. Consulte la sección escrita de este protocolo para obtener detalles. Vierta 0,5 centímetros de agarosa al 1,5% en agua en una placa de Petri de nueve centímetros.Una vez que el aase haya solidificado, corte un área un poco más pequeña que el molde para que este no se hunda hasta el fondo. Rellene el área cortada con más aase al 1,5 % y coloque el molde de plexiglás sobre ella. Evite introducir burbujas de aire cuando el Aris haya solidificado.Generalmente, libere el molde para crear canales. Cubra los Aris con medio para embriones. Cubra el recipiente y almacénelo a cuatro grados Celsius hasta que esté listo para su uso.Prepare una aguja de inyección ancha y resistente a partir de un capilar de vidrio que contenga un filamento. Utilice un microcargador para llenar la aguja de inyección con la solución de inyección, que incluya rojo de fenol como trazador, y conecte la aguja a un soporte para inyector con bomba de aire. Coloque el montaje junto a un microscopio estereoscópico.Transfiera los huevos de la etapa adecuada a la placa de inyección con agarosa. Los embriones pueden mantenerse en hielo hasta por 30 minutos para detener el desarrollo mientras se realiza la inyección bajo el microscopio estereoscópico. Use pinzas para alinear de siete a diez huevos en cada surco.Gire los huevos de manera que la aguja de inyección impacte perpendicularmente sobre los huevos. La célula única del embrión se encuentra opuesta a las gotas de aceite. Por lo tanto, la gota de aceite debe orientarse hacia la izquierda, de modo que la célula única quede a la derecha para la inyección.En meca, los ácidos nucleicos y los colorantes trazadores se inyectan por microinyección a través de la corion hacia el citoplasma del embrión, en lugar de inyectarlos en la yema. En el caso del pez cebra, acerque la aguja hacia los huevos. Toque la punta de la aguja al corion o utilice pinzas microscópicas para abrir ligeramente la punta de la aguja, de modo que una pequeña cantidad de la solución inyectable fluya hacia el exterior.Vuelva a romper la aguja en caso de obstrucción, perfore el Corian y mueva la punta de la aguja de inyección justo dentro de la capa interna para reducir la probabilidad de reflujo hacia la aguja. Ajuste la presión de sujeción del inyector a aproximadamente 80-100 hectopascales de forma precisa. Perfore la membrana e inserte la aguja en el citoplasma.Inyecte el embrión. Observe el embrión desde un lado para confirmar la distribución uniforme del material inyectado dentro del citoplasma. Los líquidos que se han inyectado correctamente en el citoplasma presentan un límite difuso; el material inyectado demasiado profundamente en la yema tiene un límite definido y no se transferirá al citoplasma.Transfiera los embriones inyectados a una placa limpia con medio embrionario y permita que se desarrollen según sea necesario en un incubador a temperatura adecuada. El panel A muestra una imagen representativa de la inyección correcta de dextrano rumine en el citoplasma de un embrión Meca en estadio de una sola célula. El panel B muestra una imagen representativa de la inyección incorrecta de dextrano rumine en el saco vitelino de un embrión Meca en estadio de una sola célula. Las líneas punteadas indican el contorno del citoplasma de una célula.Los paneles C y D muestran los embriones de los paneles A y B, respectivamente, aproximadamente a las 30 horas posteriores a la inyección. Obsérvese que el cuerpo del embrión en el panel D no es rojo, ya que el colorante fue inyectado incorrectamente en la vesícula vitelina. Acabamos de mostrarle cómo microinyectar ácidos nucleicos o trazadores en la etapa de una sola célula de embriones más oscuros.Al realizar este procedimiento, es importante contar con embriones correctamente estadiados para lograr una inyección exitosa. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

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Biología

Microinyección es un método bien establecido y eficaz para la introducción de sustancias extrañas en embriones de pez cebra fecundado. Este sentido, demuestran una sólida técnica de microinyección para la realización de la sobreexpresión de ARNm, y morpholino oligonucleótidos estudios caída de genes en el pez cebra.

Microinyección de ARNm y oligonucleótidos antisentido Morpholino en embriones de pez cebra.

Este vídeo muestra cómo morfolino o ARNm puede ser inyectado en embriones de pez cebra en el estadio de una célula para aumentar o disminuir el nivel de productos específicos de genes durante el desarrollo posterior.

Microinyección de embriones de pez cebra para analizar la función génica

Debido a que el corion duro y blando de embriones, la manipulación de embriones medaka es más complicado que en el pez cebra. Este video muestra paso a paso los procedimientos para la forma de manipular embriones medaka, incluyendo dechorionation, montaje de agarosa para la imagen y el trasplante de células para la producción de quimeras. Estos procedimientos son esenciales para el uso medaka y pez cebra en un laboratorio para sacar el máximo provecho de sus características complementarias para...

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