Name: La instilación directa traqueal de solutos en pulmón de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: Aprende a realizar la instilación intratraqueal en ratones para entregar solutos directamente a los alvéolos pulmonares. Este protocolo mejora la investigación en fisiología respiratoria y modelos animales.

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Este trabajo fue apoyado por el NIH K99 HL09222601 y el S &amp; R Foundation Ryaji Uneo Premio otorgado a MNH.

1. Anestesia <ol><li> Anestesiando los ratones con isoflurano puede facilitar el manejo de los animales y las restricciones previas a la administración de anestesia intraperitaneally. El uso de un anestésico inhalado puede o puede no ser adecuado para un estudio particular: determinar en primer lugar el impacto del uso de isoflurano, o cualquier otro anestésico, en el estudio de pulmón propuesto. </li><li> Anestesiar a los animales con isoflurano. El video muestra el uso de una cámara fija en vaporizador isoflurano isoflurano al 2% mezclado con oxígeno. Si usted no tiene una cámara de isoflurano, también puedes usar estándares abiertos soltar las técnicas de exposición. Incluya las ratas en una campana de cristal (o de otro tipo adecuado de contenedores no porosos), con una malla de alambre instalado en la parte inferior. De una almohadilla de gasa debajo de la malla de alambre, aplicar una mezcla de 30% v / v isoflurano en propilenglicol. El uso de la malla se asegura de que el animal no esté en contacto con la almohadilla empapada de isoflurano, que podría causar irritación de la piel y una posible sobredosis. Después de una corta exposición a isoflurano, el animal debe ser anestesiado y no responderá con un reflejo de enderezamiento cuando el frasco se inclina y no responde después de la pizca del pie. </li><li> Los ratones más tranquilos con una inyección intraperitoneal de una mezcla de xilazina y ketamina. (Es una buena práctica cuando se realizan inyecciones intraperitoneales de retroceder para asegurar que las porciones del intestino u otros órganos vitales no han sido penetradas). Mezclar 150 xilazina l (100 mg / mL) con ketamina 1000 l (100 mg / mL) en 8850 l de 0,9% estéril tamponada con fosfato (PBS). En los ratones, la dosis será de aproximadamente 80 l por cada 10 gramos de peso corporal. La concentración final de 10 mg / kg de xilazina y ketamina 100 mg / Kg. Los animales se deben mantener secos y aislados para evitar la pérdida excesiva de calor corporal. Ungüento oftálmico puede aplicar a los ojos para prevenir la sequedad de la córnea. </li></ol> 2. Preparación del área quirúrgica <ol><li> Afeitar el área donde se realizará la incisión quirúrgica evita la contaminación de las áreas no preparado. Una máquina de afeitar eléctrica de cerca puede afeitar el pelo de los animales. El área de afeitado debe ser mayor que el sitio de la incisión. </li><li> La posterior aplicación de crema de depilación, como Nair, se eliminarán todas las pieles restantes. Aplique una capa gruesa de crema depilatoria para el área quirúrgica y dejar actuar durante 3 minutos. Limpie la piel y la crema del retiro del pelo con una toalla húmeda. No deje la crema depilatoria en más de 10 minutos. </li><li> Use alcohol al 70%, o una solución alternativa matorrales, para preparar asépticamente el área quirúrgica. </li></ol> 3. Procedimiento Quirúrgico <ol><li> La posición del animal anestesiado sobre una tabla inclinada quirúrgica, o de pie de restricción en ángulo. </li><li> Haga una pequeña incisión cerca de la cara anterior del cuello (región de la garganta). </li><li> Diseccionar los músculos platisma anterior y la tráquea con el fin de visualizar y acceder a los anillos traqueales. </li><li> Por lo general, los volúmenes de inyección intratraqueal de 3 gramos de l por peso (aproximadamente 30-75 l volumen final). Administrar la cantidad adecuada de instilado con una inyección subcutánea de 1 ml (sub-Q) con una jeringa de calibre 30, una aguja 5/16-inch. Sujete el lado cónico jeringa hacia arriba y paralelo a la tráquea, e inyectar el volumen total de instilado en la tráquea. </li><li> El animal puede responder sin aliento después de la instilación de soluto en los pulmones. La introducción de aire a través de la jeringa y observar si los pulmones se expanden también confirmará las técnicas de intubación exitosa. </li><li> Retire la jeringa de la tráquea. </li></ol> 4. Puntos de sutura. <ol><li> Sujete estampa de la aguja (la parte más gruesa de la aguja donde se une el material de sutura), con un porta-agujas. </li><li> Penetrar la piel con la punta de la aguja en un ángulo de 90 º aproximadamente 1-3 mm del borde de la herida, dependiendo del grosor de la piel. Sujete la aguja que sale después de una sola pasada a través del tejido. Puntos simples, de forma individual con nudos, de manera eficiente a cerrar la herida. </li></ol> 5. Recuperación de animales <ol><li> Los animales deben recuperar por completo de la anestesia y el procedimiento quirúrgico después de 3-24 horas. </li></ol> 6. Resultados representante Instilación intratraqueal de compuesto fluorescente, conjugado con dextrano Cy5.5, muestra la instilación éxito de compuesto fluorescente en pulmón de ratón B6 (Figura 1). El tinte fluorescente se dirige principalmente a los pulmones y se distribuye de manera uniforme. Señal fluorescente en el tracto gastrointestinal inmediatamente después del procedimiento indica que el esófago fue intubado sin darse cuenta durante el procedimiento (Figura 2). Los investigadores también pueden verificar la ejecución selectiva de los compuestos en los pulmones, y verificar la distribución de la instilado, siguiendo el procedimiento mediante el inflado de los pulmones y la preparación de cortes de tejido pulmonar (2, 3) o fijos histológicasmuestras quirúrgico. <img src="/files/ftp_upload/1941/1941fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Fluorescente Cy5.5 señal de co-registradas con la imagen de rayos X en los pulmones del ratón inculcado con éxito. 1,4 mg Cy5.5 Dextran (a una concentración de 10 ug / l) fue inculcado en la tráquea de pulmón de ratón B6. Cy5.5 señal fue detectada mediante un filtro de 675 nm de excitación y un filtro de emisión de 695 nm. <img src="/files/ftp_upload/1941/1941fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Co-registro de la señal fluorescente que se ve con rayos X en la superposición de ratón mal inculcado. Intubación inadecuada del esófago durante la instilación traqueal resultados protocolo en Cy5.5 entrega a los intestinos.

<ol><li>Driscoll, K. E., Costa, D. L., Hatch, G., Henderson, R., Oberdorster, G., Salem, H., Schlesinger, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratracheal+instillation+as+an+exposure+technique+for+the+evaluation+of+respiratory+tract+toxicity%3A+uses+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: uses and limitations.</a> Toxicol Sci. 55, 24-35 (2000).</li>
<li>Helms, M. N., Jain, L., Self, J. L., Eaton, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+regulation+of+epithelial+sodium+channels+examined+in+alveolar+type+1+and+2+cells+patch-clamped+in+lung+slice+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Redox regulation of epithelial sodium channels examined in alveolar type 1 and 2 cells patch-clamped in lung slice tissue.</a> J Biol Chem. 283, 22875-22883 (2008).</li>
<li>Helms, M. N., Self, J., Bao, H. F., Job, L. C., Jain, L., Eaton, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+activates+amiloride-sensitive+sodium+channels+in+alveolar+type+I+cells+in+lung+slice+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dopamine activates amiloride-sensitive sodium channels in alveolar type I cells in lung slice preparations.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291, L610-L618 (2006).</li>
<li>Iyer, S. S., Ramirez, A. M., Ritzenthaler, J. D., Torres-Gonzalez, E., Roser-Page, S., Mora, A. L., Brigham, K. L., Jones, D. P., Roman, J., Rojas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+of+extracellular+cysteine%2Fcystine+redox+state+in+bleomycin-induced+lung+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Oxidation of extracellular cysteine/cystine redox state in bleomycin-induced lung fibrosis.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L37-L45 (2009).</li>
<li>Li, T., Folkesson, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+for+alpha-ENaC+inhibits+rat+lung+fluid+absorption+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">RNA interference for alpha-ENaC inhibits rat lung fluid absorption in vivo.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 290, L649-L660 (2006).</li>
<li>Sager, T., Porter, D., Robinson, V., Lindsley, W., Schwegler-Berry, D., Castranova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+to+disperse+nanoparticles+for+in+vitro+and+in+vivo+investigation+of+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicol%22%5BJournal%5D)">An improved method to disperse nanoparticles for in vitro and in vivo investigation of toxicity.</a> Nanotoxicol. 1, 118-129 (2007).</li>
<li>Xu, J., Gonzalez, E. T., Iyer, S. S., Mac, V., Mora, A. L., Sutliff, R. L., Reed, A., Brigham, K. L., Kelly, P., Rojas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+senescence-accelerated+mouse+model+in+bleomycin-induced+lung+injury+suggests+that+bone+marrow-derived+cells+can+alter+the+outcome+of+lung+injury+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Use of senescence-accelerated mouse model in bleomycin-induced lung injury suggests that bone marrow-derived cells can alter the outcome of lung injury in aged mice.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64, 731-739 (2009).</li>
<li>Yeh, T. F., Lin, H. C., Chang, C. H., Wu, T. S., Su, B. H., Li, T. C., Pyati, S., Tsai, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+intratracheal+instillation+of+budesonide+using+surfactant+as+a+vehicle+to+prevent+chronic+lung+disease+in+preterm+infants%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Early intratracheal instillation of budesonide using surfactant as a vehicle to prevent chronic lung disease in preterm infants: a pilot study.</a> Pediatrics. 121, e1310-e1318 (2008).</li>
</ol>

Intratraqueal instilaciones se han utilizado en varios estudios diferentes para evaluar la toxicidad de los compuestos de prueba (6), inducen daño alveolar del pulmón (4, 7), sustituir los tensioactivos (8), así como alterar la expresión génica a través de la entrega de los oligonucleótidos pequeños directamente en el pulmonar (5). Actualmente estamos explorando el uso de inculcar 1) fluorescentes redox material sensible en el pulmón con el fin de medir el estrés oxidativo in vivo en condiciones normales y fisiopatológi...

<table><tbody><tr><td>Isoflurano</td><td>Webster Veterinary</td><td>14043-220-05</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Lloyd, Inc.</td><td></td><td>Nuevo medicamento veterinario aprobado #139-236</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Bioniche Pharma</td><td>67457-001-10</td><td></td></tr><tr><td>Nair</td><td></td><td></td><td>Disponible en farmacias</td></tr><tr><td>Jeringa SubQ de 1 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td>26 5/8 G</td></tr><tr><td>Sutura de nailon 4-0</td><td>Ethicon Inc.</td><td>1894G.S30</td><td></td></tr></tbody></table>

la instilación directa traqueal de solutos en pulmón de ratón

Direct Tracheal Instillation of Solutes into Mouse Lung

Intratraqueal instilaciones solutos entregar directamente a los pulmones. Este procedimiento objetivos de la entrega de los instilado en las regiones distales de los pulmones, y por lo tanto incorpora a menudo en los estudios dirigidos a estudiar los alvéolos. Ofrecemos un protocolo detallado para la supervivencia de realizar instilaciones intratraqueal en ratones. El uso de este enfoque, permite afrontar la entrega de los solutos de prueba o sólidos (como la terapéutica de pulmón, surfactantes, los virus, y los oligonucleótidos pequeños) en el pulmón distal. Instilaciones traqueal puede ser la metodología preferida, la inhalación a través de protocolos que se pueden orientar a todo el tracto respiratorio superior y, posiblemente, el investigador expone a sustancias potencialmente peligrosas. Además, al utilizar el protocolo de la instilación traqueal, los animales se pueden recuperar completamente el procedimiento no invasivo. Esto permite realizar posteriores mediciones fisiológicas de los animales de prueba, o la reinstalación con el mismo animal. La cantidad de instilado introduce en el pulmón debe ser cuidadosamente determinada y osmóticamente equilibrados para asegurar la recuperación de los animales. Por lo general, el volumen instilado 30-75 l pueden introducirse en los pulmones del ratón.

Intratraqueal instilaciones solutos entregar directamente a los pulmones. Este procedimiento objetivos de la entrega de los instilado en las regiones distales de los pulmones, y por lo tanto incorpora a menudo en los estudios dirigidos a estudiar los alvéolos. Ofrecemos un protocolo detallado para la supervivencia de realizar instilaciones intratraqueal en ratones.

La instilación directa traqueal de solutos en pulmón de ratón

Las instilaciones intratraqueales administran solutos directamente en los pulmones. Este procedimiento tiene como objetivo la entrega del instilado en las regiones distales de los...

En este procedimiento, los solutos pueden administrarse directamente en los pulmones. Inyecte primero en la tráquea. Retire el pelaje del roedor pequeño y realice una pequeña incisión cerca del aspecto anterior del cuello.Exponga la tráquea. Utilice una aguja subcutánea de un mililitro para instilar tres microlitros de solución por gramo de peso corporal a través de la tráquea. Retire la jeringa y cierre la herida con puntos de sutura.Hola, soy la doctora Ma Helms del Departamento de Fisiología de la Universidad de Emory. Hola, soy el doctor Mauricio Rojas del Departamento de Medicina de la Universidad de Emory. Hoy les mostraremos un procedimiento para instilar directamente solutos en las porciones distales del pulmón.Utilizamos habitualmente este procedimiento en mi laboratorio para estudiar la eliminación de líquido pulmonar en respuesta a varios compuestos instilados, y empleamos esta técnica en mi laboratorio para administrar bli. Creación de un modelo murino macho de lesión pulmonar. La instilación directa de solutos en los pulmones de roedores pequeños puede ser útil en sus estudios.Entonces comencemos. Como preparación para la cirugía, inicialmente se anestesia al ratón con

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Nos ilustran no quirúrgico de entrega de materiales de prueba en los pulmones de ratones anestesiados a través de la tráquea. Este método permite la exposición del pulmón a los patógenos bacterianos y virales, las citocinas, los anticuerpos, los granos, productos químicos, ni colorantes. Nos describen con más detalle la recolección y procesamiento de los pulmones y ganglios linfáticos de drenaje del pulmón (LDLNs) por citometría de flujo.

No quirúrgico instilación intratraqueal de ratones con el análisis de los pulmones y ganglios linfáticos de drenaje del pulmón por citometría de flujo

Este video describe un método simple y confiable de introducir líquido en la tráquea para la instilación pulmonar, la fijación y la medición del volumen pulmonar.

Instilación y fijación pulmonar: introducción de líquido en la tráquea y fijación de los pulmones para medir el volumen pulmonar fijado

Fuente: Venuprasad, K., et al. Administración intratraqueal de Haemophilus influenzae en modelos de ratón para estudiar la inflamación de las vías respiratorias. J. Vis. Exp. (2016)Este video demuestra la administración intratraqueal de un inóculo bacteriano patógeno pulmonar en un ratón anestesiado para modelar la infección del tracto respiratorio inferior.

Realización de la administración bacteriana intratraqueal en un modelo de ratón

Este artículo describe un método striaghforward y eficiente de intubación de ratones para las mediciones de la función pulmonar o la instilación pulmonar, que permite a los ratones para recuperar y se estudió en tiempos posteriores. El procedimiento consiste en una fuente de luz de fibra óptica de bajo costo que ilumina directamente la tráquea.

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El uso de un modelo que imita el estado de las enfermedades pulmonares en los seres humanos es crítico para el estudio de la fisiopatología y / o la etiología de una enfermedad en particular y para el desarrollo de la intervención terapéutica. Aquí un método intubación endotraqueal no invasivo que puede entregar directamente materiales exógenos a los pulmones del ratón se presenta.

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En este artículo se presenta un método rápido y sencillo para la administración de bleomicina directamente en la tráquea ratón a través de la intubación. Las principales ventajas de este método son que es altamente reproducible, fácil de dominar, y no requiere equipo especializado ni largos tiempos de recuperación.

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Aquí, proponemos un protocolo para la administración de lipopolisacáridos intratraqueales (LPS) a través de la intubación endotraqueal orofaríngea no invasiva. Este método minimiza el trauma del procedimiento quirúrgico para el animal y administra LPS con precisión a la tráquea y luego a los pulmones.

Instilación intratraqueal no invasiva de lipopolisacáridos en ratones

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Aprende a realizar la instilación intratraqueal en ratones para entregar solutos directamente a los alvéolos pulmonares. Este protocolo mejora la investigación en fisiología respiratoria y modelos animales.

La instilación directa traqueal de solutos en pulmón de ratón

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