Name: Los modelos de ratón de la Retinopatía (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Aprende a crear modelos de ratón de leucomalacia periventricular mediante ligadura carotídea unilateral e hipoxia. Este método permite estudiar mecanismos de lesión cerebral en recién nacidos prematuros.

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Este trabajo está apoyado en parte por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (SR1 NS059043 y ES015988 SR1), la Sociedad Nacional de Esclerosis Múltiple, Fundación Roche para la Investigación de la Anemia, Feldstein Fundación Médica y Hospitales Shriners para niños. Nos gustaría agradecer al Dr. David Placer por sus sugerencias. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de WD de los Institutos Nacionales de Salud (SR1 NS059043 y ES015988 SR1), la Sociedad Nacional de Esclerosis Múltiple, y los Hospitales Shriners para Niños. Declaramos que no hay intereses contrapuestos en relación con este artículo.

Los procedimientos detallados de la creación de una lesión cerebral neonatal en ratones P6: <ol><li> Después del parto el día 6 (P6) de los ratones se anestesian con enfriamiento indirecto en el hielo hasta el punto de falta de respuesta a estímulos dolorosos (anestesia profunda). </li><li> Después de limpiar la piel con alcohol, una incisión en la línea media ventral se hace en la parte anterior del cuello. </li><li> Bajo un microscopio de disección, la bifurcación de la arteria carótida común derecha se acerca suavemente retracción de los músculos omohioideo y esternocleidomastoideo. </li><li> La fascia alrededor de la vaina carotídea se retira, y la rama interna proximal aislada del nervio vago y cerca ganglios simpáticos con un gancho. La arteria carótida interna se cauteriza con una punta de la cauterización. </li><li> Después de la cauterización, la incisión se sutura la piel, y el animal se mantiene caliente hasta que esté completamente despierto y luego regresó a la presa. </li><li> Una hora después de la ligadura, el animal se coloca en una cámara sellada impregnada de nitrógeno hasta un nivel del 6,0% de O 2 se alcanza. El animal se expone a 35 min de hipoxia. </li><li> Después de la exposición la hipoxia, el ratón se recupera en un cojín de la calefacción (33 ° C) durante 30 minutos y luego se devuelve a la presa. Para la creación de la lesión cerebral a la hipoxia combinada / isquemia y la infección / inflamación, el animal se inyecta por vía intraperitoneal con 0,015 ml de lipopolisacárido (LPS, 1 mg / kg). </li><li> Cuatro días post-hypoxia/ischemia, los ratones se anestesian con enfriamiento indirecto en el hielo hasta el punto de falta de respuesta a los estímulos nocivos, entonces perfundidos con paraformaldehido 4% de solución salina y después. Los cerebros se retiran y se crioprotegieron. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1951/1951fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Caracterización de la lesión cerebral en el modelo murino de hipoxia / isquemia con tinción H &amp; E. No hay necrosis focal (flechas) en la sustancia blanca cerebral ipsilateral (A) de la ligadura de la carótida, en comparación con la sustancia blanca cerebral contralateral (B). Necrosis ipsilateral y microinfartos focales se observan en el hipocampo (C) y el tálamo (D) en el cerebro con una lesión cerebral ipsilateral materia blanca. Los resultados representativos y cifras: Modelos de ratón de PVL con hipoxia / isquemia y / o infección / inflamación se logran mediante la ligadura de carótida unilateral seguida por la exposición a la hipoxia y la inyección de LPS. Estamos definiendo los modelos de ratón nuevos modelos adecuados PVL. El examen neuropatológico de las secciones coronal teñidas con hematoxilina y eosina (H &amp; E) a través del cerebro anterior revela toda necrosis focal en la materia blanca central del hemisferio cerebral ipsilateral a la ligadura de la carótida (Fig. 1A), con preservación relativa de las neuronas en la corteza que recubre cerebral en comparación con la sustancia blanca cerebral contralateral (Fig. 1B). En el centro de sustancia blanca necrótico, hay un marcado aumento de la celularidad que consiste en macrófagos y astrocitos reactivos, como es característico de PVL humanos focal. En el contralateral sustancia blanca central, el núcleo oligodendroglial están dispuestos en fascicular, como haces, esta arquitectura es completamente alterada por la necrosis focal en el lado ipsilateral. Es de destacar que también se observa necrosis ipsilateral en el hipocampo (Fig. 1C) y el tálamo (microinfartos focales) (Fig. 1D) en el cerebro con una lesión cerebral ipsilateral materia blanca. PVL humanos tampoco se produce en un aislamiento total de las lesiones que acompañan la materia gris. El sello distintivo de PVL es la relación, aunque no completa, ahorradores de la corteza cerebral que recubre el asunto heridos blanco - una característica que creemos que está presente en nuestros modelos de ratón. <img src="/files/ftp_upload/1951/1951fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Escala de puntuación de 0-5 para la evaluación de lesiones de sustancia blanca por MBP o O1 en modelos de ratón de la leucomalacia periventricular. Nuestros modelos de ratón muestran las características de la FPV, tanto a nivel fenotípico y molecular. Hemos utilizado la detección inmunohistoquímica de la proteína básica de mielina (MBP) o antígeno O1 para evaluar una lesión, han establecido una escala estándar de 0 a 5 de la puntuación de la lesión de sustancia blanca (Fig. 2), y han caracterizado a la patología de la sustancia blanca (Fig. . 3). Más recientemente, un ensayo de no sesgada estereológicos se ha implementado para sustituir a la primera semi-cuantitativos método. Además, para probar los efectos correlativos de la lesión de sustancia blanca en los resultados funcionales, se han realizado pruebas de comportamiento de la función motora. Hemos demostrado que los ratones presentan déficit motor impresionante a la hipoxia siguientes P10-21 / isquemia más LPS en P6. Hemos establecido los criterios de puntuación con una escala de 0-4 para definir la disfunción extremidad contralateral en ratones heridos en P10-21. Por lo general, los ratones normales se pueden corretear de un 30 ° de inclinación (puntuación de 4) y sube a 45 ° de inclinación, sin deslizamiento (puntuación de 3). Los ratones lesionados tienen puntuaciones más bajas en correlación con los grados de lesión de sustancia blanca. <img src="/files/ftp_upload/1951/1951fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Caracterización de lesiones de sustancia blanca por MBP o O1 coloración y la estructura de la mielina por microscopía electrónica (EM). MBP y tinción O1 mostrar la mielina perdida en la sustancia blanca cerebral ipsilateral a la ligadura, en comparación con la sustancia blanca contralateral. Examen EM muestra axones mielinizados en la sustancia blanca cerebral contralateral a la ligadura y el tejido degenerado en la materia blanca ipsilateral. Anticipamos que el establecimiento de los modelos de ratón de nuevo PVL nos permitirá estudiar los mecanismos específicos de PVL-como la lesión del cerebro inmaduro. Nos ocuparemos de la patogénesis utilizando cepas de ratones transgénicos para examinar el papel de las moléculas individuales de interés y evaluar los objetivos de la neuroprotección.

<ol><li>Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVolpe%2C+JJ+%22Neurology+of+newborn%22">Neurology of newborn</a>. , Saunders. Philadelphia. 217-276 (2001).</li>
<li>Deng, W., Pleasure, J., Pleasure, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+periventricular+leukomalacia%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Progress in periventricular leukomalacia.</a> Arch. Neurol. 65, 1291-1295 (2008).</li>
<li>Follett, P. L., Deng, W., Dai, W., Talos, D. M., Massillon, L. J., Rosenberg, P. A., Volpe, J. J., Jensen, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptor-mediated+oligodendrocyte+toxicity+in+periventricular+leukomalacia%3A+a+protective+role+for+topiramate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptor-mediated oligodendrocyte toxicity in periventricular leukomalacia: a protective role for topiramate.</a> J. Neurosci. 24, 4412-4420 (2004).</li>
</ol>

La lesión del cerebro en desarrollo lleva a devastadoras consecuencias neurológicas. Sorprendentemente, el patrón de la lesión cerebral perinatal es altamente dependiente de la edad. En recién nacidos a término, que afecta principalmente a la corteza cerebral con pérdida neuronal característica. Sin embargo, en los bebés prematuros, que afecta selectivamente la materia blanca cerebral con daño importante a los oligodendrocitos en desarrollo, un trastorno denominado leucomalacia periventricular (LPV). La magnitud del problema de las lesiones cerebrales en el bebé prematuro es extraordinario. Parto prematuro y la mejora de los cuidados intensivos neonatales han llevado a casi el 90% de supervivencia de los 13 millones de niños prematuros en todo el mundo (aproximadamente 56.000 en los Estados Unidos), nacido el año con un peso al nacer inferior a 1500 gramos, es decir, de muy bajo peso al nacer. Aproximadamente el 10% de los sobrevivientes posteriormente presentan parálisis cerebral y aproximadamente el 50% tienen déficits cognitivos y de comportamiento. PVL es el cerebro más importante de la patología subyacente parálisis cerebral en recién nacidos prematuros. No hay tratamiento específico para PVL existe en la actualidad, en parte debido a la patogenia no ha sido bien entendido 1,2. Aunque la etiología de la CVP es multifactorial, hipoxia perinatal / isquemia con infección intrauterina materna se cree que es una causa primaria de la FPV. Un modelo de hipoxia / isquemia del PVL en la rata a P7 ha sido establecido con anterioridad 3. Este modelo es único en el que se asemeja a LPV en recién nacidos prematuros. El sello distintivo de este modelo es selectiva de la materia blanca patología, a diferencia de la mayoría de los modelos de carrera que se caracterizan por un infarto de la materia gris. Sin embargo, las limitaciones del modelo hipóxico-isquémica en la rata no debe pasarse por alto. En primer lugar, la etiología de la CVP suele ser multifactorial. Además de la hipoxia / isquemia, materno-fetal infección / inflamación se asocia fuertemente con la FPV. Por lo tanto, la inflamación combinado hipoxia / isquemia y la infección / probable que crear modelos más PVL-como. La edad de roedores que mejor se correlaciona con el período de desarrollo humano de mayor riesgo de lesiones PVL (24-32 semanas de gestación) es después del parto porque la diferenciación oligodendroglial es predominantemente un evento post-natal en los roedores. Ya que es imposible producir una infección materno-fetal / inflamación de edad posnatal, que sería razonable para simular una infección en una fase de desarrollo postnatal relevante para crear un modelo de roedores de la FPV. Hemos tratado de combinar la inyección de LPS con el modelo de hipoxia / isquemia en ratones a P6, para producir lesiones PVL más clínicamente relevante. En segundo lugar, el óptimo de prueba de concepto de enfoque experimental para un papel causal de una molécula hace necesario el uso de ratones transgénicos, la manipulación genética son mucho más difíciles en la rata que en el ratón. Por lo tanto, hemos tratado de convertir nuestro modelo experimental de PVL de la rata en el ratón. Modelos de ratón de PVL facilitará en gran medida 1) el estudio de la biología de la enfermedad y la patogénesis utilizando disponibles cepas de ratones transgénicos, 2) la realización de ensayos de medicamentos para descubrir posibles agentes con potencial terapéutico, y 3) las pruebas de la utilidad de las células madre utilizando cepas inmunodeficientes ratón.

<table><tbody><tr><td>LPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4130</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de hipoxia</td><td>BioSpherix</td><td>A-30274</td><td></td></tr><tr><td>Gancho quirúrgico</td><td>F.S.T.</td><td>10064-14</td><td></td></tr></tbody></table>

los modelos de ratón de la retinopatía

Mouse Models of Periventricular Leukomalacia

Se describe un protocolo para el establecimiento de modelos de ratón de la leucomalacia periventricular (PVL). PVL es la forma predominante de la lesión cerebral en los bebés prematuros y el antecedente más común de parálisis cerebral. PVL se caracteriza por daño la sustancia blanca periventricular, con lesiones oligodendroglial prominentes. Hipoxia / isquemia, con o sin infección sistémica / inflamación son las principales causas de la FPV. Nosotros usamos ratones P6 para crear modelos de lesión cerebral neonatal mediante la inducción de hipoxia / isquemia, con o sin infección sistémica / inflamación con la ligadura de carótida unilateral seguida por la exposición a la hipoxia, con o sin la inyección de la endotoxina lipopolisacárido (LPS). Inmunohistoquímica de la proteína básica de mielina (MBP) o O1 y el examen microscópico electrónico muestran la pérdida de mielina prominentes en la sustancia blanca cerebral con daño adicional en el hipocampo y el tálamo. Establecimiento de modelos de ratón de PVL facilitará en gran medida el estudio de la patogénesis de la enfermedad utilizando disponibles cepas de ratones transgénicos, la conducción de los ensayos de medicamentos de una manera relativamente alto rendimiento para identificar posibles agentes terapéuticos, y el ensayo de transplante de células madre utilizando cepas de inmunodeficiencia ratón.

Se establecieron modelos de ratón de leucomalacia periventricular (LPV), la lesión cerebral predominante en los bebés prematuros se caracteriza por lesiones de sustancia blanca periventricular. Hipoxia / isquemia con / sin infección sistémica son las causas principales de la FPV. La ligadura de carótida unilateral y la exposición hipoxia con / sin inyección de lipopolisacárido crea PVL-como lesiones en los ratones P6.

Los modelos de ratón de la Retinopatía

Describimos un protocolo para establecer modelos murinos de leucomalacia periventricular (LPV). La LPV es la forma predominante de lesión cerebral en prematuros...

Para comenzar este procedimiento, se anestesiania a seis ratones mediante enfriamiento indirecto en hielo hasta el punto de no responder a estimulaciones nocivas. Bajo un microscopio estereoscópico, se accede a la arteria carótida común derecha. Se utiliza un gancho quirúrgico para aislar la arteria carótida común del nervio vago y de los ganglios simpáticos cercanos.La arteria carótida común se cauteriza entonces. Hola, soy Hin del laboratorio de Bin del Departamento de Biología Celular y Anatomía Humana de la Universidad de California en Davis. Hola, soy Jennifer Plain.También soy del Laboratorio de uno Ang. Hoy les mostraremos el procedimiento para crear un modelo murino de PVL de Perticular lulac. La forma predominante de lesión cerebral en bebés prematuros se caracteriza por ser paraventricular.Analizamos lesiones meta. Utilizamos seis ratones para crear una lesión similar a la LPV mediante la ligadura unilateral de la carótida y la hipoxia con inyección posterior de LPS. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la patología de la LPV.El establecimiento de modelos de ratón de LVP facilitará en gran medida el estudio de la patogénesis de la enfermedad utilizando cepas de ratones transgénicos disponibles. Estos modelos facilitarán la realización de ensayos farmacológicos de manera relativamente alta en rendimiento para descubrir agentes terapéuticos candidatos, así como para probar el trasplante de células madre y cepas de ratones inmunodeficientes. Así que comencemos.Antes de la cirugía para inducir una lesión cerebral neonatal, realice una compresión en la pata para confirmar que el animal está completamente anestesiado. Limpie la piel alrededor del cuello del ratón P seis anestesiado con alcohol. A continuación, realice una incisión ventral en la línea media del cuello anterior.Bajo un microscopio estereoscópico, retraiga suavemente los músculos omohioideo y esternocleidomastoideo para acceder a la arteria carótida común derecha. Retire la fascia alrededor de la vaina carotídea. Luego, utilice un gancho para aislar la arteria carótida común del nervio vago y los ganglios simpáticos cercanos.Ahora cauterice la arteria carótida común tras el cauterio. Cierre la incisión cutánea con adhesivo tisular. Utilice una almohadilla térmica para mantener al animal caliente hasta que despierte completamente, y luego devuélvalo a la madre.Una hora después de la ligadura carotídea, coloque el ratón en una cámara sellada infundida con nitrógeno hasta que se alcance un nivel de 6% de oxígeno. Exponga al animal a 35 minutos de hipoxia; tras la exposición a la hipoxia, permita que el ratón se recupere sobre una almohadilla calefactora durante 30 minutos y luego devuélvalo a la hembra para la inducción de lesión cerebral mediante la combinación de hipoxia, isquemia e infección. Inflamación. El animal se inyecta inicialmente con 0,015 mililitros de lipopolisacárido y luego se devuelve a la hembra.A continuación se presentan algunos resultados representativos de modelos murinos de leucomalacia periventricular o PVL. En primer lugar, un examen neuropatológico de secciones coronales teñidas con hematoxilina y eosina a través de todo el prosencéfalo revela necrosis focal en la sustancia blanca central del hemisferio cerebral ipsilateral a la ligadura carotídea en la sustancia blanca necrótica focal. Hay un aumento notable en la celularidad compuesta por macrófagos y astrocitos reactivos, característico de la PVL humana focal en la sustancia blanca central contralateral.Los núcleos oligo den leal están dispuestos en haces similares a fascículos. Esta arquitectura se ve completamente interrumpida por la necrosis focal en el lado ipsilateral. En cerebros con lesión ipsilateral de la sustancia blanca cerebral, también se observan necrosis ipsilateral en el hipocampo e infartos microscópicos focales en el tálamo.A continuación, la detección inmuno-citoquímica de la proteína básica de la mielina MVP o del antígeno O uno se utiliza para evaluar la lesión. Aquí se muestra una escala estándar para puntuar la lesión de la sustancia blanca utilizando una escala de cero a cinco. La patología de la sustancia blanca también se caracteriza mediante tinción con MVP u O uno y la estructura de la mielina mediante microscopía electrónica. Las tinciones con MVP y O uno muestran pérdida de mielina en la sustancia blanca cerebral ipsilateral respecto a la sustancia blanca contralateral.El examen mediante microscopía electrónica muestra axones mielinizados en la sustancia blanca cerebral contralateral a la ligadura y tejido degenerado en la sustancia blanca ipsilateral. Finalmente, para evaluar los efectos correlativos del daño en la sustancia blanca sobre los resultados funcionales, se realizaron pruebas conductuales de función motora como se muestra en esta gráfica. La puntuación conductual basada en una prueba de escalada revela que los ratones expuestos a hipoxia-isquemia sin LPS presentan puntuaciones significativamente más bajas en comparación con los ratones controles normales de P14.Además, los ratones expuestos a isquemia por hipoxia con LPS tienen puntuaciones significativamente más bajas en comparación con los ratones Hi P14. Acabamos de mostrarle cómo crear un modelo de ratón de LPV mediante isquemia por hipoxia con o sin inyección intraperitoneal de A RPS.Al realizar este procedimiento, es importante recordar aislar la arteria carótida común de otros tejidos antes de la cauterización. De lo contrario, la lesión resultante será demasiado severa o no se producirá lesión alguna. Eso es todo.Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

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Neurociencia

El medio de oclusión intraluminal modelo cerebral en ratones se presentan en la presente memoria. La extensión del infarto cerebral se evaluó mediante una puntuación neurológica y tinción con violeta de cresilo, una alternativa a la tinción con TTC, que ofrece la gran ventaja de prueba en paralelo marcadores de interés muchos.

Modelo de ratón de MCAO intraluminal: Evaluación del infarto cerebral mediante tinción con violeta de cresilo

El video muestra el procedimiento para crear un modelo de ratón para estudiar la lesión cerebral hipóxico-isquémica neonatal. Describe los pasos para inducir quirúrgicamente la isquemia y someter al animal a hipoxia para exacerbar el daño cerebral. Por último, se muestra cómo evaluar las lesiones cerebrales resultantes, asegurando que el modelo de ratón esté preparado para futuras investigaciones científicas.

Establecimiento de un modelo murino de lesión cerebral hipóxico-isquémica neonatal

Utilizando resonancias magnéticas (humanas), software de imágenes 3D y análisis inmunohistológicos, documentamos los cambios en los ventrículos laterales del cerebro. El mapeo longitudinal en 3D de los cambios en el volumen del ventrículo lateral y la caracterización de los cambios celulares periventriculares que ocurren en el cerebro humano debido al envejecimiento o la enfermedad se modelan en ratones.

Modelado 3D del lateral Ventrículos y histológico Caracterización de Tejidos periventricular en los seres humanos y de ratón

Presentado es una batería concisa de pruebas motoras neonatales en ratones. Con estas pruebas, se pueden demostrar déficits motores neonatales en una variedad de trastornos motores neonatales. Al tener un conjunto estandarizado de pruebas, se pueden comparar los resultados de diferentes estudios, lo que permite un informe mejor y más preciso entre los grupos.

Una batería de pruebas de motor en un modelo de ratón neonatal de la parálisis cerebral

Describimos un modelo de ratón de malaria cerebral experimental y mostramos cómo se puede rastrear la patología inflamatoria y microvascular in vivo utilizando imágenes de resonancia magnética.

Seguimiento In Vivo del Desarrollo del Edema y Patología Microvascular en un Modelo de Malaria Cerebral Experimental usando Imágenes de Resonancia Magnética

Este protocolo demuestra la inducción de la enfermedad de malformación cavernosa cerebral en un modelo de ratón y utiliza contraste realzado micro tomografía para medir la carga de lesión. Este método aumenta el valor de modelos de ratón establecido para estudiar la base molecular y terapias potenciales para la malformación cavernosa cerebral y otras enfermedades cerebrovasculares.

Inducción y Micro-CT en la proyección de imagen de malformaciones cavernosas cerebrales en modelo murino

Aquí se describe el modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico, donde se produce un accidente cerebrovascular a través del cráneo intacto mediante la inducción de la oclusión microvascular permanente utilizando iluminación láser después de la administración de un tinte fotosensible.

Modelado de accidente cerebrovascular en ratones: lesiones corticales focales por fototrombosis

Presentamos un modelo de hemorragia intraventricular neonatal utilizando crías de rata que imita la patología observada en humanos.

Modelado de hemorragia intraventricular neonatal a través de la inyección intraventricular de hemoglobina

La encefalomielitis autoinmune experimental es uno de los modelos murinos de esclerosis múltiple más utilizados. En el protocolo actual, los ratones C57BL/6J de ambos sexos son inmunizados con el péptido glicoproteico de los oligodendrocitos de mielina, lo que resulta principalmente en paresia ascendente de la cola y las extremidades. Aquí discutimos el protocolo de inducción y evaluación de EAE.

Modelización de la esclerosis múltiple en los dos sexos: encefalomielitis autoinmune experimental inducida por MOG35-55

Este protocolo presenta un modelo murino modificado de lesión cerebral traumática leve repetitiva (rmTBI) inducida a través de un método de lesión craneal cerrada (CHI). El enfoque presenta una ventana de cráneo adelgazada y percusión de fluidos para reducir la inflamación comúnmente causada por la exposición a las meninges, junto con una mejor reproducibilidad y precisión en el modelado de rmTBI en roedores.

Modelo de ratón modificado de lesión cerebral traumática leve repetitiva que incorpora ventana de cráneo adelgazada y percusión de fluidos

Aprende a crear modelos de ratón de leucomalacia periventricular mediante ligadura carotídea unilateral e hipoxia. Este método permite estudiar mecanismos de lesión cerebral en recién nacidos prematuros.

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