La diferenciación de células madre embrionarias en los precursores de oligodendrocitos
19 de mayo de 2010
Se describe una molécula basada en pequeñas protocolo para la diferenciación de las células madre embrionarias de ratón en células precursoras de oligodendrocitos (OPC). Este protocolo genera Olig2 + NG2 + OPC con alta eficiencia de 30 días de diferenciación. También describe un método para generar "picos" OPC que puede disparar potenciales de acción.
El objetivo general del siguiente experimento es generar precursores de oligodendrocitos a partir de células madre embrionarias a través de una serie de pasos de cultivo durante 30 días. Esto se logra generando primero cuerpos embrionarios a partir de células madre embrionarias de ratón para iniciar la diferenciación celular. Como segundo paso, los cuerpos embrionarios se tratan con las moléculas pequeñas, ácido retinoico y morfina pura, que inducen la diferenciación dirigida de las células en una guarida liga.
Precursores de citas. Como tercer paso, los cuerpos embrionarios se desagregan en células individuales después de 22 días adicionales. En cultivo, aproximadamente el 80% de las células son OPC.
A continuación, se transducen las OPCs derivadas de MESC con virus bao portadores de la subunidad NAV 1.2 con el fin de generar OPCs de spiking, se obtienen resultados que muestran la expresión del marcador OPC y las propiedades de spicking de estas OBCs derivadas de MESC basadas en inmunofluorescencia, microscopía y registros electrofisiológicos. Hola, soy Pong Chiang del laboratorio del Dr. Ing en el Departamento de Biología Celular y Anatomía Humana de la Universidad de California Davis. También estamos afiliados al Hospital Shriners para Niños del Norte de California.
Hola, soy vial Raj, también del laboratorio Deng. Hoy te mostraremos un procedimiento para la diferenciación de células madre de emron de ratón en células precursoras del genocidio. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar las propiedades de las células madre embrionarias derd precursores de oligodendrocitos con el fin de generar células con mejor potencial terapéutico.
Así que comencemos. En la actualidad, se generarán células precursoras de oligodendrocitos u OPC a partir de la línea de células madre embrionarias de ratón OG two GFP. Estas células madre embrionarias necesitan ser pasadas cada tres días para mantenerlas sanas a una densidad óptima y para evitar la diferenciación espontánea. Pasaje.
Las células ESS cuando están al 70% de confluencia bajo una campana de flujo laminar. Retire el medio sobre el cultivo. Enjuague con PBS y tripsina los ojos con dos mililitros de precalentamiento.
Un x viaje LE express durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Detenga la reacción y vuelva a suspender las células en cuatro mililitros de medio celular MES. Transfiera las celdas a un tubo cónico de 15 mililitros y péguelas a 1000 RP durante cinco minutos.
Vuelva a suspender en la placa de medio MESL, una décima parte de las células sobre una capa confluente de alimentadores de metanfetamina irradiados en medio celular MES. Después de tres días, las células madre embrionarias tienen aproximadamente un 70% de confluentes y están listas para ser pasadas o suspendidas para formar cuerpos embrionarios para inducir cuerpos embrionarios y comenzar la diferenciación de las colonias de células madre embrionarias de ratón con tripsina como antes y luego resuspender las células en reemplazo de suero knockout o medio KSR. Cuente las células en un hemo TER, diluya la suspensión en KSR.
Medio a 15.000 células por mililitro placa de tres mililitros en cada pocillo de un cultivo de placa de seis pocillos de fijación ultrabajo. Las celdas suspendidas a 37 grados centígrados durante cuatro días. Cambie el medio por completo cada dos días.
A partir del cuarto día, reemplace el medio diariamente en el cuarto día Complemente el KSR con ácido retinoico 0.2 micromolar en el quinto día complemente con ácido retinoico y una hambruna de cebador micromolar en el sexto y séptimo día. Alimente los cuerpos embrionarios dentro de dos medios, suplementados con ácido retinoico 0,2 micromolar y un cebador micromolar hambruna. Después de ocho días en cultivo, la mayoría de los cuerpos embrionarios expresan GFP y están listos para ser desagregados en los ojos de tripsina y contar las células como antes.
Luego resus suspenderlos a 3,5 veces 10 a la quinta celda por mililitro. En medio OPC refaccionar tres mililitros de la suspensión en medio OPC. Usando placas de 60 milímetros recubiertas de poliornitina aproximadamente cada semana, las células se volverán confluentes y se verán como este paso a las células como antes con una tripsinización de tres minutos.
30 días después de la suspensión de resus original. En el medio KSR, las células muestran características de las células precursoras de oligodendrocitos para generar OPC en aumento. Utilice OPC derivados de ESL del ratón que estén entre el 50 y el 70 % de confluentes.
Cambie el medio por un XPBS para enjuagar las células. Para introducir sodio dependiente de voltaje. Subunidad alfa del canal 1.2.
Utilizamos el kit de canal de sodio MAM trasero. Mezcle un mililitro del componente A de MAM trasero con cuatro mililitros de un XPBS. Retire el enjuague de PBS y agregue el componente diluido.
A incubar a 37 grados centígrados durante dos horas. Reemplace el agente de memoria posterior con un medio OPC mejorado con los componentes B y C como se describe en el kit. Instrucciones Incubar durante dos horas adicionales a 37 grados centígrados.
Después de la incubación, reemplace el medio mejorado con medio OPC fresco. Después de otras 24 horas de cultivo, las OPC derivadas de ESL se pueden analizar para detectar picos en este punto de tiempo. Los EBS no muestran ninguna fluorescencia GFP.
Los EBS muestran una fuerte expresión de GFP y están listos para el cultivo por desagregación durante aproximadamente 30 días después de la suspensión original del resus. En el medio KSR, la mayoría de las células son inmunopositivas para la tinción de NG dos, lo que es consistente con la expresión de GFP. Sin embargo, a diferencia de las OPC cerebrales, estas OPC derivadas de células MES no disparan potenciales de acción incluso cuando las células se despolarizaron a cero milivoltios.
Después de introducir la subunidad NAV 1.2 por transducción viral, estos OPC derivados de células MES se excitan y disparan potenciales de acción. Acabamos de mostrarte cómo diferenciar células madre embrionarias de ratón en OPC y generar OPC de pico por transducción viral. Al realizar este procedimiento, es importante recordar almacenar correctamente el ácido retinoide por morfina y FGF dos y siempre usar alícuotas frescas, desechar cualquier ácido retinoide extra después de su uso.
Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.
Resumen
Este artículo presenta un protocolo para diferenciar células madre embrionarias de ratón en células precursoras de oligodendrocitos (OPC) utilizando moléculas pequeñas. El método logra una alta eficiencia en la generación de OPC Olig2+NG2+ en 30 días e incluye una técnica para producir OPC que disparan potenciales de acción.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Investigación con células madre
Antecedentes
- Las células precursoras de oligodendrocitos (OPC) son cruciales para la mielinización en el sistema nervioso central.
- Las células madre embrionarias de ratón (células ES) pueden diferenciarse en OPC para fines de investigación y terapéuticos.
- Las moléculas pequeñas pueden dirigir eficazmente el proceso de diferenciación.
- Comprender las propiedades de las OPC puede mejorar el potencial terapéutico en trastornos neurológicos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo confiable para generar células precursoras de oligodendrocitos (OPC) a partir de células ES de ratón.
- Investigar las propiedades electrofisiológicas de las OPC diferenciadas.
- Explorar el potencial de las OPC con actividad de disparo en aplicaciones terapéuticas.
Métodos Utilizados
- Se forman cuerpos embrionarios a partir de células ES de ratón para iniciar la diferenciación.
- Se utilizan moléculas pequeñas, incluyendo ácido retinoico y morfina pura, para inducir la diferenciación.
- Las células se disgregan y se cultivan para enriquecer las OPC.
- Se emplea la transducción viral para introducir canales de sodio activados por voltaje en las OPC.
Resultados principales
- Alrededor del 80 % de las células cultivadas se identifican como OPC después de 30 días.
- La microscopía de inmunofluorescencia confirma la expresión de marcadores de OPC.
- Los registros electrofisiológicos demuestran las propiedades de generación de potenciales de acción en las OPC transducidas.
- Las OPC no transducidas no exhiben potenciales de acción, lo que resalta la eficacia del método de transducción viral.
Conclusiones
- El protocolo genera eficazmente OPC a partir de células madre embrionarias de ratón.
- La transducción viral convierte con éxito a las OPC en células que generan potenciales de acción.
- Este método proporciona una base para estudiar las OPC en el contexto de la investigación y terapia neurológicas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La diferenciación eficiente de células madre embrionarias en células precursoras de oligodendrocitos (OPC) responde a una necesidad crítica de fuentes celulares escalables y comprometidas con la línea celular en la investigación regenerativa del SNC. Este protocolo permite la generación de alto rendimiento de OPC con fenotipo definido, lo que favorece la confianza predictiva en la validación temprana de dianas y en estudios funcionales. El enfoque facilita la reducción de riesgos mecanicistas y la selección de carteras para estrategias terapéuticas basadas en células dirigidas a enfermedades desmielinizantes.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar el compromiso de la línea oligodendrocítica y la especificidad de las vías mediante marcadores moleculares definidos.
- Apoya la desactivación de riesgos biológicos mediante la generación de OPC con perfiles de expresión consistentes de Olig2 y NG2.
- Facilita la confianza predictiva en la validación funcional de dianas a través de la caracterización electrofisiológica de subpoblaciones de OPC.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona una fuente reproducible de OPCs validadas para cribado de compuestos y ensayos fenotípicos posteriores.
- Normaliza los productos de diferenciación, asegurando el desarrollo cuantitativo y escalable de ensayos.
- Permite la evaluación confiable de moléculas candidatas en sistemas de linaje de oligodendrocitos relevantes para la enfermedad.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Alinea los modelos de OPC in vitro con los fenotipos derivados de tejido primario para lograr una continuidad traslacional.
- Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo al permitir estudios funcionales sobre OPCs con actividad de disparo y sin actividad de disparo.
- Facilita la reducción mecanicista de riesgos para candidatos en la línea de terapia celular dirigidos a la desmielinización.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este protocolo de diferenciación se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica, permitiendo la validación temprana de objetivos, el desarrollo de ensayos y la investigación traslacional sobre la biología de las OPC.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la prueba de hipótesis sobre el compromiso de linaje y las propiedades funcionales de las OPC.
- Cribado Proporciona poblaciones estandarizadas y reproducibles de OPC para plataformas de ensayos cuantitativos.
- Análisis: Proporciona lecturas de inmunofluorescencia y electrofisiología para el análisis comparativo de subtipos de OPC.
- Investigación traslacional Vincula hallazgos in vitro con modelos de tejido primario para la alineación preclínica.
- Reutilización Empresarial: Establece un flujo de trabajo reutilizable para la generación de OPCs en múltiples programas de investigación.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la investigación centrada en OPC.
- Valor operativo: Proporciona una generación estandarizada, escalable y reproducible de OPC para flujos de trabajo entre equipos.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital en carteras de terapia celular y neuroregeneración.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos terapéuticos basados en OPC.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de cultivo de células madre, diferenciación y transducción viral.
- Exige acceso a infraestructura de microscopía de inmunofluorescencia y grabación electrofisiológica.
- Necesita una estandarización rigurosa entre equipos de los protocolos de diferenciación y ensayos.
- Puede requerir adaptación para diferentes líneas de células madre embrionarias o modelos específicos de especies.
- Depende de la calidad constante de los reactivos y del momento preciso de los pasos de diferenciación.
