Name: En la cuantificación in situ de las células beta pancreáticas misa en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Aprende a cuantificar células beta pancreáticas GFP en ratones mediante microscopía de fluorescencia y análisis de imágenes virtuales. Este protocolo permite estudiar la proliferación y distribución de islotes en investigación de diabetes.

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El estudio está respaldado por EE.UU. Servicio de Salud Pública de subvención DK-081527, 072473-DK y DK-20595 de la Universidad de Chicago Diabetes Research and Training Center (Animal principales modelos), y un regalo de la Fundación de la Familia Kovler.

Parte 1: Preparación de Muestras <ol><li> Coloque un ratón bajo un microscopio de disección, extirpar el páncreas completo junto con el duodeno y el bazo están todavía atadas, y colocar los órganos en una placa de vidrio previamente pesado. Quitar el duodeno mediante la reducción de su tejido conectivo en el lado donde se une con el páncreas. Cortar y extirpar el bazo y el exceso de grasa en el páncreas hasta que el páncreas está completamente aislado en la diapositiva. (Grasa de páncreas se distingue por su color blanco, como se diferencian por el color ligeramente más oscuro y curtidor de tejido pancreático.) </li><li> Coloque un cubreobjetos (cubierta de cristal grandes 50x75mm, 25x75mm estándar cubierta de vidrio) sobre el páncreas para que sea totalmente cubierta. Utilice un peso (por ejemplo, un libro pesado) para aplanar el páncreas entre la diapositiva y su cubierta. En función del peso, el aplanamiento del páncreas tarda aproximadamente cinco minutos. </li><li> Sacar el peso. Si el páncreas está bien pegado a la diapositiva, el lugar en el 4% de paraformaldehído (PFA) a 4 ° C durante la noche. Por la mañana, quitar el cubreobjetos y así exponer el páncreas entero de PFA durante el día (6-8 horas). Si el páncreas no está bien fija, le permiten permanecer en la AFP más tiempo, posiblemente durante la noche. Transferencia de las diapositivas en el contenedor con 1% de Triton X-100 en tampón fosfato salino (PBS) durante la noche. Al día siguiente, la transferencia de las diapositivas en el contenedor de sacarosa saturada durante 1-2 días. A continuación, traslado de las diapositivas a un contenedor de 100% de glicerol hasta que el tejido se elimina, lo que permite la resolución óptima de las señales fluorescentes, en la limpieza del tejido lleva días aproximadamente 1-3. (Las señales fluorescentes pueden persistir durante semanas e incluso meses, pero las imágenes se debe realizar poco después de que el tejido está autorizado para una óptima resolución.) </li><li> Guarde el páncreas en una zona oscura y fría con el fin de preservar el órgano y sus señales fluorescentes. </li></ol> Parte 2: Imágenes y cuantificar el área de las células beta en el páncreas intacto <ol><li> El uso de pinzas o guantes, toma la diapositiva del envase con 100% de glicerol. Prepare la diapositiva de imágenes por limpiando el exceso de glicerol y exclusivamente la limpieza de la parte posterior de la cubierta de vidrio con etanol. </li><li> Abra el software StereoInvestigator (MicroBrightField, Williston, VT) y selecciona la lente del objetivo 2x para los ratones de imágenes páncreas de más de 3 semanas en portaobjetos de vidrio grande, o la lente del objetivo 10x para los ratones de imágenes páncreas menores de 3 semanas presionado entre dos cubreobjetos de 25 mm. Visualizar la imagen seleccionado para vivir de la imagen (imagen → imágenes en vivo). Seleccione un tiempo de exposición que muestra claramente la GFP-etiquetados células beta. (Subexponiendo la imagen excluye pequeños islotes y las células beta, mientras que la sobreexposición de la imagen crea más señales falsas.) </li><li> Haga clic en cualquier lugar de la pantalla para establecer un punto de referencia y proceder a dibujar un contorno alrededor de todo el páncreas. Iniciar el proceso de Cortar (imagen → Adquirir Cortar Virtual). Determinar y seleccionar el mejor ejemplo de plano focal, el avión con el mayor número de islotes visible y centrada y las células beta en el eje Z por el desplazamiento de la rueda de enfoque. Una vez elegido, StereoInvestigator captura automáticamente la imagen visualizada en la pantalla. Con la platina, la función de Cortar Virtual captura secuencial cada panel óptico como una imagen distinta en el contorno dibujado (Fig. 1A), y luego combina todos ellos como una imagen fusionada (Fig. 1B). Cortar imagen virtual utiliza una configuración de epifluorescencia es decir, filtros de campo amplio que permite a la cámara para captar todas las señales presentes en una cierta profundidad, incluidos los que no la perfección en el enfoque, por lo que el sector Virtual final es un sistema integrado de dos dimensiones de imagen que no es de un máximo proyección de la reconstrucción tridimensional de todo el páncreas. Tiempo medio de exploración Virtual Slice es de 30 minutos por muestra, pero puede tomar hasta una hora para una gran páncreas. </li><li> Después de guardar la imagen, comienza su análisis mediante la apertura de la imagen con ImageJ. Cuando termine de cargar la imagen y aparece en la pantalla, abrir y ejecutar la macro rebanada análisis virtual ( <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1970/Supplementary_material%201.pdf">un material complementario</a> ). </li><li> Siga las instrucciones paso a paso proporcionadas por el macro. Eliminar los efectos no deseados creado por la dispersión de luz con la "varita mágica" y herramientas "Seleccionar área". Comprobar y restar fondo innecesario de la imagen. Determinar el radio de la mayor islote con la herramienta "Línea" de modo que la función resultante de rodar la bola puede quitar con eficacia la luz de autofluorescencia y dispersas. Probar y seleccionar la más adecuada "umbral bajo" para capturar las señales fluorescentes de pequeños islotes y las agrupaciones de las células beta (&lt;3x10 4 m 2). Probar y seleccionar la más adecuada "umbral alto" para capturar las señales fluorescentes de los islotes. Ejecutar la cuantificación de la rebanada virtual, que mediráy elaborar una lista de zona de los islotes, el perímetro, circularidad, y el diámetro de Feret. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1970/1970Fig1A.jpg" alt="Figura 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1a"> Figura 1 A Cortar Virtual de análisis de imágenes de toda la distribución de las células beta en el páncreas adulto intacto Imágenes de cada uno de los paneles ópticos de un páncreas de un ratón macho a 10 semanas adoptadas en virtud de un objetivo de 2x. Las imágenes incluyen la distribución de las islas, incluso pequeños grupos de células beta (&lt;10 células). <img src="/files/ftp_upload/1970/1970Fig1B.jpg" alt="Figura 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1b"> Figura 1B Cortar Virtual de análisis de imágenes de toda la distribución de las células beta en el páncreas adulto intacto Una rebanada unificada virtual con el páncreas dorsal a la derecha y el páncreas ventral de la izquierda. Barra de escala es de 5 mm. Resultados representante Preparación competentes del páncreas para obtener imágenes de rebanada virtual va a permitir una cuantificación efectiva de todas las buenas prácticas agrarias de etiquetado de las células beta en el páncreas entero como una rebanada de imagen virtual con islotes clara y distinta. Cortar imágenes éxito virtual de todo el páncreas in situ proporciona los medios para analizar y cuantificar las células beta, no sólo la zona de islotes individuales y totales, pero también distribución del tamaño de los islotes, el análisis regional, y los patrones de crecimiento también. Mientras que ImageJ mantiene la capacidad de detectar todas las células beta de forma simultánea en el análisis de imágenes Cortar Virtual, también puede controlar que las células beta de cuantificar por restringir el análisis a los tamaños de los islotes determinado (por área o diámetro), o por ubicación. Un análisis de norma excluye por ejemplo, los artefactos, los restos más pequeños que una sola de las células beta (&lt;170 m 2) y registra el área, el perímetro (la distancia alrededor de un área), la circularidad (un grado de redondez, donde 1.0 representa un círculo perfecto), y el diámetro de Feret (la distancia más larga dentro de un área) de cada islote detectado. Cortar el análisis virtual es capaz de mejorar las imágenes virtuales corte mediante el empleo de la segmentación de cuencas, que distingue y separa los islotes se superponen en islotes individuales de acuerdo a sus formas. El análisis también produce una serie de imágenes detalladas, lo que incluye las máscaras de las imágenes en tanto baja y alta intensidad (Fig. 1C), un resumen de todas las islas supone, que son cada uno numerado individualmente y que figuran en la tabla de información correspondiente (Fig. . 1D), y la imagen original rebanada Virtual (Fig. 1B). Tenga en cuenta que el sesgo potencial técnico la hora de elegir los valores de umbral puede sesgar la cuantificación de los islotes de los alrededores, incluyendo la luz gratuita de grandes estructuras, o reduciendo el número total de los islotes, las señales débiles, especialmente a partir de pequeñas partículas. <img src="/files/ftp_upload/1970/1970Fig1C.jpg" alt="Figura 1c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figura 1c"> Figura 1 C Cortar Virtual de análisis de imágenes de toda la distribución de las células beta en el páncreas adulto intacto Una máscara de las partículas fluorescentes en la parte virtual. Códigos de colores: [1] azul: fluorescencia de baja intensidad, [2] verde: intensidad de fluorescencia intermedia, y [3] rojo: fluorescencia de alta intensidad. <img src="/files/ftp_upload/1970/1970Fig1D.jpg" alt="Figura 1d" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="la figura 1d"> Figura 1D análisis de la imagen virtual de pedacito de toda la distribución de las células beta en el páncreas adulto intacto La cuantificación de los islotes individuales / grupos de células beta. Tenga en cuenta que cada uno de los islotes (incluyendo pequeños grupos de células beta) está numerado, con la información detallada en un gráfico correspondiente. Cuatro parámetros se tomaron para cada estructura: (1) área, (2) perímetro, (3) la circularidad: un grado de redondez en el número 1.0 representa un círculo perfecto, y (4) Feret de diámetro: la distancia más larga dentro de un área. Tenga en cuenta que # 706 muestra la resolución de los análisis con una superficie de sólo unas pocas células beta. Segmentación de las cuencas hidrográficas detecta grupos de islotes adyacentes, como la que se muestra, y apropiadamente los distingue como islotes distintos (islotes de 1554, 1555 y 1556). <img src="/files/ftp_upload/1970/1970Fig1E.jpg" alt="Figura 1e" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1E"> Figura 1E Cortar Virtual de análisis de imágenes de toda la distribución de las células beta en el páncreas adulto intacto 3-dimensional terreno del análisis de corte virtual, con ejes de área, perímetro y el diámetro de Feret. Cada punto representa un islote.

<ol><li>Miller, K., Kim, A., Kilimnik, G., Moka, U., Jo, J., Periwal, V., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+formation+during+the+neonatal+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Islet formation during the neonatal development in mice.</a> PloS One. 4, E7739-E7739 (2009).</li>
<li>Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+pancreatic+islet+distribution+in+situ+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).</li>
<li>Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).</li>
<li>Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+pancreatic+beta-cells+in+the+intact+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).</li>
</ol>

El análisis de las imágenes rebanada virtual de los islotes y las agrupaciones de las células beta en el páncreas intacto proporciona una visión a gran escala de toda la distribución de los islotes. Evolución y los cambios en la distribución de los islotes total en el tiempo por lo tanto pueden ser estudiados y comparados. Un ejemplo se demuestra en el análisis de la formación de los islotes pancreáticos (1). Un análisis completo de páncreas ratones recién nacidos en distintos momentos (P1-P21) ha demostrado que los isl...

<table><tbody><tr><td>Pinzas</td><td>Miltex Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>F.S.T.</td><td>14001-13</td><td>01n2</td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>F.S.T.</td><td>14072-10</td><td>02s5</td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio grande</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71862-01</td><td>75x51x1.2mm</td></tr><tr><td>Cubreobjetos grande</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>260462</td><td>50x75mm</td></tr><tr><td>Portaobjetos</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>25x75x1.0mm</td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-458-5M</td><td>75x25mm</td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Erie Scientific</td><td></td><td>25mm círculo</td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo Investigator</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ratones MIP-GFP</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

en la cuantificación in situ de las células beta pancreáticas misa en ratones

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

Seguimiento de los cambios de las poblaciones de células específicas en materia de salud y la enfermedad es un objetivo importante de la investigación biomédica. El proceso de monitoreo de páncreas de las células beta del islote proliferación y el crecimiento es particularmente difícil. Hemos desarrollado un método para capturar la distribución de las células beta en el páncreas intacto de ratones transgénicos con fluorescencia marcado las células beta con una macro escrita para ImageJ (rsb.info.nih.gov / ij /). Después de la disección del páncreas y la limpieza de tejidos, todo el páncreas se captura como una rebanada virtual, después de que la GFP-etiquetados células beta son examinados. El análisis incluye la cuantificación del total de las células beta del islote número de área, y distribución de tamaño con respecto a los parámetros y lugares específicos para cada islote y para pequeños grupos de células beta. Toda la distribución de los islotes se pueden trazar en tres dimensiones, y la información de la distribución del tamaño y la forma de cada islote permite una comparación cuantitativa y cualitativa de los cambios en el total de superficie de las células beta de un vistazo.

El protocolo siguiente se describe el proceso de disección del páncreas para obtener imágenes de corte virtual, y la posterior cuantificación de todas las buenas prácticas agrarias de etiquetado de las células beta en el páncreas.

En la cuantificación in situ de las células beta pancreáticas misa en ratones

El seguimiento de los cambios en poblaciones celulares específicas en estados de salud y enfermedad es un objetivo importante de la investigación biomédica. El proceso de monitorear el páncreas...

Comprender la proliferación de las células beta pancreáticas y el crecimiento de los islotes es un aspecto importante de la investigación sobre la diabetes. En este artículo en video, se demuestra la obtención de imágenes y el análisis de un páncreas completo de ratón utilizando ratones con células beta que expresan GFP; el páncreas se extrae de un ratón sacrificado y se aplanea sobre un portaobjetos de vidrio. El tejido pancreático se aclara mediante tratamientos secuenciales con paraformaldehído, Triton X, sacarosa y glicerol, empleando microscopía fluorescente.Se adquiere una imagen o corte virtual del páncreas. Luego, se analiza la imagen para determinar el número, tamaño y distribución de los islotes dentro del páncreas. Hola, soy German Kilimnik del laboratorio del Dr. RA en el Departamento de Medicina de la Universidad de Chicago.Soy Abraham Kim, también del Laboratorio HAR. Hoy les mostraremos un procedimiento para obtener imágenes y cuantificar todas las células beta en el páncreas de un ratón. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la estructura, el desarrollo y la formación del páncreas de ratón.Así que comencemos. Inicie este procedimiento ap

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

El ensayo in vitro función de las células β usando islotes aislados de ratones de Langerhans es un componente importante en el estudio de la fisiopatología de la diabetes y la terapéutica. Mientras que muchas aplicaciones posteriores están disponibles, este protocolo se describe específicamente la medición de intracelular de adenosina monofosfato cíclico (cAMP) como un parámetro esencial para determinar la función de las células β.

Un método para ratón islotes pancreáticos Aislamiento y cAMP intracelular Determinación

El objetivo de este protocolo es aplicar imágenes de resonancia magnética mejorada con contraste dinámico (DCE-MRI) para xenoinjertos ortotópicos de tumores pancreáticos en ratones. La DCE-MRI es un método no invasivo para analizar la microvasculatura en un tejido diana, y útil para evaluar la respuesta vascular en un tumor después de una terapia novedosa.

Dynamic Contrast mejorada de imagen de resonancia magnética de un modelo ortotópico de cáncer pancreático del ratón

Aquí, presentamos una metodología para generar y administrar microesferas de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) cargadas de interés a islotes de ratón intactos en cultivo con el posterior análisis de inmunofluorescencia de la proliferación de células β. Este método es adecuado para determinar la eficacia de los mitógenos candidatos a β células.

Administración sostenida de mitógenos de células β de los islotes intactos mouse<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Uso Biodegradable poli (ácido láctico-co-glicólico) Microesferas

Describimos un protocolo para la implantación guiada por ultrasonido de líneas celulares de adenocarcinoma ductal pancreático derivados de la murino directamente en el sitio del tumor nativo. Este enfoque resultó en tumores pancreáticos detectables por la ecografía dentro de 2-4 semanas de la inyección, y redujo significativamente la proporción de la sesión de células tumorales en la pared peritoneal en comparación con la implantación ortotópica quirúrgica.

Ultrasonido-Guiado Implantación Ortotópica de Adenocarcinoma Ductal Pancreático Murino

Este protocolo describe la generación quirúrgica de tumores pancreáticos ortotópicos y la rápida digestión de tumores pancreáticos murinos recién aislados. Después de la digestión, las poblaciones viables de células inmunitarias se pueden utilizar para análisis posteriores, incluida la estimulación ex vivo de las células T para la detección de citoquinas intracelulares por citometría de flujo.

Generación de tumores pancreáticos ortotópicos y caracterización ex vivo de la citotoxicidad de células T infiltrantes en tumores

Este estudio presenta la aplicación de rodajas de tejido pancreático vivo al estudio de la fisiología de los islotes y las interacciones entre los islotes y las células inmunes.

Observación de la función de los islotes y las interacciones entre los islotes y las células inmunes en rodajas de tejido pancreático vivo

Este protocolo describe dos métodos para el análisis cuantitativo de la mitofagia en las células β pancreáticas: en primer lugar, una combinación de colorantes específicos de mitocondrias permeables a las células y, en segundo lugar, un indicador de mitofagia codificado genéticamente. Estas dos técnicas son complementarias y pueden implementarse en función de necesidades específicas, lo que permite flexibilidad y precisión para abordar cuantitativamente el control de calidad mitocondrial.

Enfoques complementarios para interrogar el flujo de mitofagia en las células β pancreáticas

La administración intraperitoneal de fármacos es un enfoque no invasivo seguro y eficaz para inducir la lesión pancreática. Este estudio comparó cinco protocolos distintos de inyección intraperitoneal en ratones para inducir diversos grados de lesión pancreática y estableció un modelo de lesión pancreática grave para investigar los cambios patológicos y las estrategias de tratamiento para la pancreatitis aguda grave (PAS).

Preparación de un modelo de pancreatitis aguda grave en ratones mediante una combinación de caeruleina e inyección intraperitoneal de lipopolisacáridos

Describimos un método para utilizar linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) de ratones a través de citometría de flujo para la transferencia de células adoptivas. Este protocolo tiene como objetivo verificar la citotoxicidad específica de los TIL contra tumores en un modelo de ratón de cáncer de páncreas singénico, proporcionando información sobre el desarrollo de terapias celulares adoptivas para el cáncer de páncreas.

Aislamiento basado en citometría de flujo y evaluación terapéutica de linfocitos infiltrantes tumorales en un modelo murino de cáncer de páncreas

Este estudio utiliza marcadores de muerte celular y apoptosis basados en fluorescencia de tinción múltiple combinados con microscopía confocal para evaluar la apoptosis inducida por citocinas y la muerte β celular específica en islotes pancreáticos. Revela cambios espaciales y temporales en la muerte celular y la apoptosis en respuesta a estímulos extracelulares.

Tratamiento de islotes pancreáticos aislados y medición de la apoptosis

Proporcionamos un protocolo mínimamente invasivo para el trasplante intramuscular de islotes de células madre pancreáticas derivadas de células madre humanas en ratones inmunodeficientes, para implantación in vivo y análisis posteriores.

Trasplante intramuscular de células endocrinas pancreáticas derivadas de células madre pluripotentes humanas en ratones

Aprende a cuantificar células beta pancreáticas GFP en ratones mediante microscopía de fluorescencia y análisis de imágenes virtuales. Este protocolo permite estudiar la proliferación y distribución de islotes en investigación de diabetes.

En la cuantificación in situ de las células beta pancreáticas misa en ratones

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