Name: El establecimiento de xenoinjertos de tumor cerebral intracraneal, con posterior análisis del crecimiento tumoral y respuesta al tratamiento con imágenes de bioluminiscencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-13T17:55:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Aprende a establecer xenoinjertos intracraneales de tumores cerebrales en ratones atímicos mediante inyección de células modificadas con luciferasa. Este método permite monitorear el crecimiento tumoral y evaluar la respuesta terapéutica mediante imágenes de bioluminiscencia en tiempo real.

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1. Preparación de las células tumorales. Las células de xenoinjertos de tumores cerebrales pueden ser originados por tumores propaga como tumores subcutáneos en ratones atímicos, o de cultivos celulares. La utilización de ambas fuentes de células se discute a continuación, junto con la demostración de un método para la implantación de células. Para preparar las células de tumores subcutáneos para la transferencia en el compartimento intracraneal, tumores extirpados flanco se colocan en placas de cultivo, donde el tejido es inicialmente picada con un bisturí y luego interrumpido mecánicamente por pipeteo repetitivo para crear una suspensión total de la celda 1. La suspensión total de la célula se hace pasar por una malla de nylon 70 M de filtros para producir una suspensión de células individuales para inyección intracraneal. La suspensión celular se centrifuga a 1000 rpm durante 10 minutos a 4 ° C, y el sobrenadante aspirado antes de resuspender el pellet de células en un volumen apropiado de medio libre de suero para obtener una concentración de trabajo final (ver más abajo). Para la preparación de líneas celulares establecidas para la implantación intracraneal, se cosechan las células por monocapas trypsinizing, o mediante la recopilación de las culturas neuroesfera suspensión, la centrifugación y resuspensión de las células como se ha indicado 2. El número de células inyectadas es variable dependiente de la localización neuroanatómica de la inyección. Para las inyecciones supratentorial que habitualmente se inyectan 5.3 x 10 5 células en 3 L de medio libre de suero (DMEM), mientras que para las inyecciones de tronco cerebral 3, tan sólo 5 x 10 4 células se inyectan en 0,5 mL. Inyección de grandes volúmenes de lo recomendado puede provocar el reflujo de las células tumorales a través del trayecto de la aguja, con exofítico resultante (Figura 1), en lugar de crecimiento de los tumores intracraneales. Después de retirarse de la muestra para la inyección intracraneal, la suspensión de células restantes deben ser colocados en hielo, con el contenido puede mezclarse con frecuencia para mantener la concentración adecuada al completar el establecimiento del tumor intracraneal entre los miembros de una serie de inyecciones. 2. Implantación de células tumorales Tenga en cuenta que todos los procedimientos que se describen a continuación han sido revisados ​​y aprobados por el Uso de Animales institucional y el cuidado en la Universidad de California en San Francisco. <ol><li> El área quirúrgica debe estar preparado rociando todas las superficies con un desinfectante, como la solución de clorhexidina al 2%. Después de usar el desinfectante, los siguientes materiales deben ser colocados en el área quirúrgica: <ul><li> Almohadilla eléctrica para mantener la temperatura del cuerpo del ratón </li><li> Dos pequeñas cápsulas de Petri, que contiene 3% de peróxido de hidrógeno, y otro que contiene clorhexidina al 2% </li><li> Hisopos estériles de gasa y algodón </li><li> Bisturís estériles desechables </li><li> Grapadora quirúrgica autoclave </li></ul></li><li> Para la anestesia de una inyección de anestesia se debe utilizar, por lo general una mezcla de ketamina-xilazina. </li><li> Una vez que un ratón es anestesiado, el cuero cabelludo se prepara limpiando varias veces con un trozo de gasa estéril empapado en la solución de clorhexidina. Pomada para los ojos se deben aplicar para mantener la humedad adecuada durante el procedimiento. Con un bisturí estéril, realizar una incisión sagital sobre el hueso parieto-occipital, aproximadamente 1 cm de largo. La superficie del cráneo expuesta se limpia con un algodón empapado en una solución de peróxido de hidrógeno al 3%. El bregma debe ser evidente en este punto (ver video). </li><li> Las coordenadas para la inyección de las células tumorales puede variar de acuerdo con el sitio deseado para el establecimiento del tumor. A continuación figura el procedimiento que usamos para el establecimiento del tumor intracerebral 2 en una localización neuroanatómica en el que muchos pacientes con tumores cerebrales experiencia en el desarrollo del tumor. Otros lugares de interés en la investigación de tumores cerebrales incluyen el puente, para el modelado anatómico del tallo cerebral tumores 3, y las inyecciones subdural para el modelado de la ubicación de los tumores meníngeos 4. Antes de la inyección de células tumorales, utilice una aguja de calibre 25 estéril afilado para perforar el cráneo de 2 mm a la derecha del bregma y 1 mm por delante de la sutura coronal, creando una apertura para la inyección de células tumorales (ver video). Este procedimiento funciona bien tanto para los ratones y las ratas (22 aguja de calibre para las ratas). </li><li> Antes de recurrir las células dentro de la jeringa, mezclar el contenido de la suspensión celular golpeando con el dedo. Cargue la jeringa con la cantidad deseada de suspensión celular, teniendo cuidado de evitar la creación de burbujas de aire. El exterior de la jeringa luego se deben limpiar con una gasa con alcohol para limpiar el exterior libre de células adherentes, lo que ayudará a prevenir el establecimiento y el crecimiento del tumor extracraneal (Figura 1). Para asegurarse de que la profundidad de la inyección adecuada es importante utilizar un bisturí para cortar de 3 mm de la punta de una punta de P20 pipetteman. En esta sección de la punta se puede montar sobre la jeringa y actuará para limitar la profundidad de la inyección, y se asegurará, además, que el tip de la aguja de la jeringa es de 3 mm de la parte inferior del cráneo. Coloque la jeringa perpendicular al cráneo y en el agujero creado con anterioridad, e inyecte lentamente la suspensión de células (una suspensión 3μL debe inyectarse en un período de 1 minuto). Un ángulo inadecuado de la inserción puede resultar en una jeringa de inyección intraventricular de las células y su posterior difusión espinal (Fig. 1B: Derecha) Al término de la inyección, deje la aguja en su lugar por un minuto, luego retire lentamente (ver video): estos pasos le ayudará a reducir reflujo de las células tumorales. </li><li> Como una alternativa al enfoque sin ayuda o sin mano de la implantación de células tumorales intracraneales 5, se puede utilizar un marco estereotáxico animales pequeños (F panel de visión esquemática), que generalmente promueve la ubicación de la inyección más consistente, pero a costa de grandes cantidades de tiempo de procedimiento. En nuestra experiencia, dos miembros del personal quirúrgico puede inyectar hasta 60 ratones / hora cuando se utiliza el enfoque a mano, mientras que la tasa máxima de inyección con un marco estereotáxico pequeños animales es de aproximadamente 15 ratones / hora. La conveniencia de procedimiento es una consideración importante cuando se inyectan grandes series de los ratones, y ayuda a reducir el tiempo en que las células tumorales, que se inyecta, se dejan en el hielo. </li><li> Limpia el cráneo con el peróxido de hidrógeno al 3% y secar con un hisopo de algodón estéril seca. Aplicar cera de hueso estéril en el orificio. Con una pinza, sacar el cuero cabelludo junto a la calavera y grapas para cerrar. Para una cicatrización óptima, el cuero cabelludo debe grapar con la dermis de cada lado del cuero cabelludo contra la otra (parte inferior contra la parte inferior). El cuero cabelludo con grapas deben limpiarse con solución de clorhexidina, y la buprenorfina se administra por inyección subcutánea para el alivio del dolor post-operatorio. </li><li> Controlar todos los ratones después de la operación hasta que se ambulantes y mantener la actividad normal. Por lo general, el tiempo de recuperación es de alrededor de 30 minutos. </li></ol> 3. Bioluminiscencia control del crecimiento tumoral <ol><li> De fondo. Imágenes de bioluminiscencia (BLI) se basa en la oxidación de la luciferina [d-(-) -2 - (60-hidroxi-20-benzotiazolilo)-thiazone-4-carboxílico] en presencia de oxígeno y el trifosfato de adenosina (ATP). Esta reacción es catalizada por la enzima luciferasa, que convierte la energía química en fotones con la emisión resultante de la luz. Las células humanas pueden ser modificados para expresar la luciferasa (ver más abajo), y sólo las células que expresan luciferasa capaz de emitir luz en presencia del sustrato luciferina. No es la luminiscencia de fondo mínimo de los animales tratados con luciferina anfitriones, de tal manera que hay una muy favorable relación señal-ruido para la detección de las emisiones de luminiscencia de la luciferasa modificado las células tumorales, permite un seguimiento muy sensible del crecimiento tumoral y respuesta al tratamiento in vivo. Por otra parte, la luciferasa y su sustrato, la luciferina, se ha demostrado que no es tóxico para las células de mamíferos, y no hemos encontrado diferencias funcionales entre las células que expresan luciferasa relativa a las células correspondientes modificaciones. Luciferina atraviesa fácilmente las membranas celulares y la barrera sanguínea del cerebro después de la intraperitoneal (ip) o intravenosa (iv) la inyección en ratones, lo que permite imágenes de cada compartimento que contiene luciferasa modificados células. El nivel de emisión de fotones y el espectro de luz emitido por la luciferasa modificados células es suficiente para penetrar en los tejidos de los animales de investigación pequeños, como ratones y ratas, y se puede detectar el exterior con cámaras de imagen con poca luz. La naturaleza no invasiva de imágenes de bioluminiscencia permite la monitorización repetida del crecimiento tumoral y respuesta al tratamiento en pacientes individuales de los animales. </li><li> Fuentes de células implantadas deben ser modificados de forma estable para la expresión de luciferasa de luciérnaga. Estas fuentes de células se pueden comprar o se han producido en los laboratorios individuales mediante lentivirus que se han construido para la expresión constitutiva de la luciferasa. Se recomienda encarecidamente el uso de células modificadas con lentivirus que codifica la luciferasa, en lugar de plásmido, para asegurar la expresión estable de la luciferasa celulares in vivo, lo cual es necesario para obtener imágenes de luminiscencia cuantitativas para proporcionar una indicación precisa de los cambios en la carga tumoral de los sujetos individuales de los animales que se repiten reflejado en el transcurso de un experimento. </li><li> BLI control. Recomendamos la realización de imágenes de bioluminiscencia cuantitativa (qBLI) 1x-2x por semana, comenzando una semana después de la inyección de células tumorales. Nuestra qBLI se lleva a cabo utilizando el IVIS Lumina imágenes estación (Caliper Life Sciences), y nuestros resultados indican datos similares se obtienen en el uso del Lumina IVIS, el IVIS 150, o la estación de IVIS 200 imágenes. En preparación para las imágenes, los ratones son a la vez anestesiados con ketamina / xilazina y administrado luciferina (D-luciferina sal de potasio, 150 mg / kg, Caliper Life Sciences) mediante inyección intraperitoneal, con ratones imágenes 12 minutos después de la inyección. La farmacocinética de la luciferina indican que el tiempo entre la administracióntración de la luciferina y la determinación de la luminiscencia celular debe estar entre 10-15 minutos después de la inyección de la luciferina, a fin de obtener el máximo de emisión de luminiscencia y la mayor sensibilidad de detección. El período de tiempo seleccionado en el intervalo de 10-15 minutos de tiempo se debe mantener lo más constante entre los animales que se va a examinar. Es de suma importancia para mantener la consistencia en la longitud de tiempo entre la inyección de luciferina y la obtención de lecturas de BLI. Las regiones de interés que abarcan la zona intracraneal de la señal se definen mediante el software de vida de la imagen (Figura 2), y el photons/s/sr/cm2 total (fotones por segundo por estereorradián por centímetro cuadrado) se registran (ver video). </li><li> Análisis de datos. Mientras que el crecimiento del tumor y la respuesta al tratamiento se controlan en los animales, le recomendamos los grupos de tratamiento de al menos 8 para aumentar la certeza estadística de conclusiones sobre la respuesta del tumor, o falta de ella, a la terapia. Con respecto a la presentación de los resultados qBLI, las lecturas de luminiscencia se convierten en valores normalizados dividiendo luminiscencia cada ratón s, obtenidos durante y posterior a la finalización del régimen terapéutico, con su correspondiente tratamiento previo luminiscencia máxima de lectura 6,7. Para el análisis de la supervivencia, el estimador de Kaplan-Meier 8 se utiliza, y de la cual las curvas de supervivencia se generan, y determinar los valores de la mediana de supervivencia. Las diferencias entre las curvas de supervivencia se compararon mediante una prueba de log-rank 9. </li><li> Recuperación del cerebro para su posterior análisis de tumor tratado y no tratado. Sobre la eutanasia de los animales, el cerebro del ratón debe ser rápidamente eliminado (ver video), y, o bien colocado en formalina para su posterior análisis de la morfología del tumor y la inmunohistoquímica, o debe ser montado en octubre para la congelación de la muestra. </li></ol> 4. Resultados representante En el ejemplo que se muestra en la Figura 3A, los ratones que recibieron inyecciones de células tumorales intracraneales fueron controlados por luminiscencia intracraneal hasta que los sucesivos valores de luminiscencia significa que señalan un crecimiento progresivo del tumor, y en el que se inició la terapia de tiempo (a partir de la flecha gris en el día 34: erlotinib administrado diariamente a 150 mg / kg hasta que la eutanasia es necesario). Los valores de luminiscencia para cada ratón se establece en un valor normalizado de una en el momento de iniciar el tratamiento, con las lecturas de luminiscencia posterior de cada ratón normalizado a su valor final de imagen antes del tratamiento. A modo de ejemplo, un ratón con una lectura de luminiscencia final pre-tratamiento de 2,0 x 10 7 fotones / seg en el día 34, cuya luminosidad se había incrementado a 6.0 x 10 7 fotones / seg en el día 38, tendría un valor de luminosidad día 38 normalizado de 3,0. La media de la bioluminiscencia normalizado y el error estándar correspondiente para el control de los grupos de tratamiento y se trazan para cada punto de la imagen en tiempo. En este ejemplo, una diferencia significativa en la luminiscencia normalizada promedio es evidente en el punto de imagen por primera vez con posterioridad al inicio del tratamiento (día 38), con la diferencia de luminosidad media del grupo que muestran un aumento más en los tiempos posteriores. En la mayoría de los casos, la actividad antitumoral de la terapia, según lo indicado por qBLI, está acompañada por una correspondiente diferencia significativa en la supervivencia (es decir, p &lt;0,05), como es el caso aquí (Figura 3B). Paneles 3C y 3D muestran adyacentes hematoxilina y eosina y anti-EGFR secciones teñidas de cerebro de ratón obtenido en el momento de la eutanasia, después de la colocación del cerebro resecado en formalina y posterior inclusión en parafina para el corte. <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Indicaciones de errores de inyección intracraneal. A) exofítico (extracraneal) el crecimiento del tumor (círculo rojo) puede ser causada por muy grande un volumen de inyección, suspensión de células residuales unido a la jeringa, o de retirar la jeringa con demasiada rapidez después de la inyección de las células tumorales. B) Inyección de células tumorales en los ventrículos puede causar la difusión de la columna vertebral del tumor (ratón hacia la derecha), en contraste con las células tumorales inyectadas correctamente, la señal para que se queda localizado en el sitio de inyección (ratón hacia la izquierda). <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Calor representaciones de mapas de imagen de la intensidad de la bioluminiscencia de los ratones representante de control (izquierda) y tratamiento (derecha), los grupos de un experimento de la respuesta al tratamiento. El software de imagen viva se puede configurar para definir las regiones de interés (círculos rojos), u operadores del instrumento se pueden definir las regiones de interés de forma manual. Para el uso de imágenes como estas para la construcción de la figura, se recomienda que el operador del instrumento muestra imágenes de mapas de calor con el mismo calor bioluminiscencia de Gama (parte superior de la figura), para proporcionar una representación visual de la magnitud de la diferencia entre los sujetos bioluminiscencia animal. <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Bioluminiscencia, la supervivencia y el análisis de tejido tumoral de un experimento en el que la respuesta terapéutica es evidente. Un gráfico) de las lecturas de la bioluminiscencia significa para el control y tratamiento de los ratones del grupo, con un error estándar indicado para cada punto de imagen. B) Representar la supervivencia de los ratones mismo p-valor determinado mediante el uso de la prueba de log-rank 7. C) H &amp; E manchadas sección del cerebro de los ratones con tumor. D) EGFR manchado sección. E y F) Aumentos de las áreas indicadas de los paneles C y D, respectivamente, con E panel que muestra tinción negativa para tumor supresor de proteína PTEN.

<ol><li>Giannini, C., Sarkaria, J. N., Saito, A., Uhm, J. H., Galanis, E., Carlson, B. L., Schroeder, M. A., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient+Tumor+EGFR+and+PDGFRA+Gene+Amplifications+Retained+in+an+Invasive+Intracranial+Xenograft+Model+of+GBM%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncol%22%5BJournal%5D)">Patient Tumor EGFR and PDGFRA Gene Amplifications Retained in an Invasive Intracranial Xenograft Model of GBM.</a> Neuro-Oncol. 7, 164-176 (2005).</li>
<li>Ozawa, T., Wang, J., Hu, L. J., Bollen, A. W., Lamborn, K. R., Deen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+human+glioblastomas+as+xenografts+in+the+brains+of+athymic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Growth of human glioblastomas as xenografts in the brains of athymic rats.</a> In Vivo. 1, 55-60 (2002).</li>
<li>Hashizume, R., Ozawa, T., Dinca, E. B., Banerjee, A., Prados, M. D., James, C. D., Gupta, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+brainstem+glioma+xenograft+model+enabled+for+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">A human brainstem glioma xenograft model enabled for bioluminescence imaging.</a> J Neurooncol. , Forthcoming (2009).</li>
<li>Baia, G. S., Dinca, E. B., Ozawa, T., Kimura, E. T., McDermott, M. W., James, C. D., VandenBerg, S. R., Lal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+skull+base+model+of+malignant+meningioma%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">An orthotopic skull base model of malignant meningioma.</a> Brain Pathol. 2, 172-179 (2007).</li>
<li>Ozawa, T., James, C. D. Human Brain Tumor Cell and Tumor Tissue Transplantation Models. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOzawa%2C+T+%22CNS+Cancer%3A+Models%2C+Markers%2C+Prognostic+Factors%2C+Targets%2C+and+Therapeutic+Approaches%22">CNS Cancer: Models, Markers, Prognostic Factors, Targets, and Therapeutic Approaches</a>. Van Meir, E. , Humana Press-Springer. New York, NY. 147-162 (2009).</li>
<li>Sarkaria, J. N., Yang, L., Grogan, P. T., Kitange, G. J., Carlson, B. L., Schroeder, M. A., Galanis, E., Giannini, C., Wu, W., Dinca, E. B., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Molecular+Characteristics+Correlated+with+Glioblastoma+Sensitivity+to+EGFR+Kinase+Inhibition+Through+Use+of+an+Intracranial+Xenograft+Test+Panel%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of Molecular Characteristics Correlated with Glioblastoma Sensitivity to EGFR Kinase Inhibition Through Use of an Intracranial Xenograft Test Panel.</a> Mol. Cancer Ther. 6, 1167-1174 (2007).</li>
<li>Dinca, E. B., Sarkaria, J. N., Schroeder, M. A., Carlson, B. L., Voicu, R., Gupta, N., Berger, M. S., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+Monitoring+of+Intracranial+Glioblastoma+Xenograft+Response+to+Primary+and+Salvage+Temozolomide+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence Monitoring of Intracranial Glioblastoma Xenograft Response to Primary and Salvage Temozolomide Therapy.</a> J. Neurosurg. 107, 610-616 (2007).</li>
<li>Kaplan, E. L., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-parametric+estimation+from+incomplete+observations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Stat.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Non-parametric estimation from incomplete observations.</a> J. Am. Stat. Assoc. 53, 457-481 (1958).</li>
<li>Peto, R., Peto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymptotically+efficient+rank+invariant+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Stat.+Soc.+Ser.+A.+Stat.+Soc%22%5BJournal%5D)">Asymptotically efficient rank invariant procedures.</a> J. R. Stat. Soc. Ser. A. Stat. Soc. 135, 185-207 (1972).</li>
<li>Camphausen, K., Purow, B., Sproull, M., Scott, T., Ozawa, T., Deen, D. F., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+in+vivo+growth+on+human+glioma+cell+line+gene+expression%3A+convergent+profiles+under+orthotopic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A.%22%5BJournal%5D)">Influence of in vivo growth on human glioma cell line gene expression: convergent profiles under orthotopic conditions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 102, 8287-8292 (2005).</li>
</ol>

Ortotópico (intracraneal) tumor cerebral establecimiento xenoinjerto proporciona un microambiente adecuado para el desarrollo de cáncer 10 CNS a hacerse la prueba de la respuesta terapéutica. Este tipo de modelo, además, proporciona información sobre el acceso terapéutico al cerebro y el tumor cerebral, que es de importancia crítica para determinar si un agente experimental se debe avanzar a la evaluación de ensayos clínicos en pacientes. Debido a la cantidad de xenoinjerto de tumor intracraneal no se puede medir directamente, por ejemplo, pinzas, el seguimiento longitudinal de crecimiento de los tumores intracraneales y respuesta al tratamiento requiere de imagen no invasivas, con nuestra experiencia de formación de imágenes de bioluminiscencia que indica que el enfoque más práctico para los experimentos cuyo objetivo primordial está evaluando el alcance de la respuesta del tumor a la terapia. Cuando los resultados de las imágenes de bioluminiscencia se combinan con el análisis de supervivencia de los animales sujetos, los dos conjuntos de datos proporcionan un enfoque poderoso y confiable para evaluar la eficacia terapéutica experimental. Por último, es de suma importancia que los xenoinjertos de tumores intracraneales del cerebro se cosechan a partir de materias animales sacrificados con el fin de evaluar los efectos morfológicos y moleculares de la terapia, y para ello prefiere la resección de todo el cerebro en el momento de la eutanasia, con la preservación del cerebro resecado para su posterior análisis. Considerando que la presentación anterior se ha concretado a la investigación de tumores cerebrales, los conceptos son sin duda generalizables a otros tipos de cáncer humano que son susceptibles de modelado ortotópico en los roedores.

<table><tbody><tr><td>Escalpel desechable</td><td>Feather Safety Razor Co, Ltd.</td><td>2975</td><td>No.21</td></tr><tr><td>Almohadilla calefactora</td><td>Dunlap</td><td>HP950</td><td></td></tr><tr><td>Gasa</td><td>Fisher Scientific</td><td>22028563</td><td></td></tr><tr><td>Hisopos de algodón</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-100</td><td></td></tr><tr><td>Clorhexidina al 2%</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9756995</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno al 3%</td><td>Fisher Scientific</td><td>H312P-4</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de 25 g</td><td>BD Biosciences</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Microjeringa fina de 10 µl de Hamilton</td><td>Hamilton Co</td><td>20734</td><td></td></tr><tr><td>Grapadora quirúrgica y grapas</td><td>Stoelting Co.</td><td>59020</td><td></td></tr><tr><td>Marco estereotáxico</td><td>Stoelting Co.</td><td>51725</td><td></td></tr><tr><td>Software Living Image</td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/Living%20Image%20Software" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Caliper Life Sciences</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-luciferina</td><td>Gold Biotechnology</td><td>LUCK-1G</td><td>Sal potásica</td></tr><tr><td>Xenogen Lumina</td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/IVIS%20Series" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Caliper Life Sciences</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

el establecimiento de xenoinjertos de tumor cerebral intracraneal, con posterior análisis del crecimiento tumoral y respuesta al tratamiento con imágenes de bioluminiscencia

Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging

Modelos de trasplante con células humanas de tumor en el cerebro han servido una función esencial en la investigación neuro-oncología por muchos años. En el pasado, el procedimiento más utilizado para el establecimiento humano xenoinjerto de tumor consistió en la recolección de las células de los frascos de cultivo, seguida de la inyección subcutánea de las células recogidas en ratones inmunodeprimidos. Considerando que este enfoque todavía ve el uso frecuente en muchos laboratorios, ha habido un cambio significativo en el énfasis en la última década hacia el establecimiento de xenoinjertos ortotópico, que, en el caso de los tumores cerebrales, requiere de la inyección de células tumorales en las adecuadas estructuras neuroanatómicas. Debido a que el establecimiento de xenoinjerto intracraneal elimina la posibilidad de controlar el crecimiento del tumor a través de la medición directa, como por el uso de pinzas, el cambio de énfasis hacia los modelos de xenoinjerto de tumor cerebral ortotópico ha requerido la utilización de imagen no invasivas para la evaluación de la carga tumoral en los animales huéspedes. De los métodos de imagen disponibles en la actualidad, la supervisión de bioluminiscencia se considera generalmente ofrecen la mejor combinación de sensibilidad, conveniencia y costo. Aquí, vamos a demostrar los procedimientos para el establecimiento ortotópico tumor cerebral, y para vigilar el crecimiento del tumor y la respuesta al tratamiento cuando se prueban tratamientos experimentales.

Luciferasa modificados xenoinjertos de tumores humanos el cerebro puede ser establecida por vía intracraneal en ratones atímicos, con posterior seguimiento del crecimiento del tumor y la respuesta a la terapia que utiliza imágenes de bioluminiscencia. En combinación con el análisis de supervivencia, la supervisión de bioluminiscencia es una herramienta esencial para la investigación pre-clínica de las terapias que se consideran para el tratamiento de tumores cerebrales.

El establecimiento de xenoinjertos de tumor cerebral intracraneal, con posterior análisis del crecimiento tumoral y respuesta al tratamiento con imágenes de bioluminiscencia

Los modelos de trasplante que utilizan células de tumores cerebrales humanos han desempeñado una función esencial en la investigación de la neurooncología durante muchos años. En el pasado, los más...

Durante muchos años, los modelos de trasplante que utilizan células de tumores cerebrales humanos han implicado principalmente la inyección subcutánea en ratones inmunodeprimidos. Recientemente, se ha producido un cambio hacia la inyección en la estructura anatómica adecuada: el cerebro.En este artículo en video, se establecen tumores intracraneales en ratones mediante un método de inyección en el que se crea un orificio en el cráneo y se utiliza una aguja para inyectar células tumorales modificadas para la imagenología por bioluminiscencia. Tras la cirugía, se monitorea la tasa de crecimiento tumoral y la respuesta al tratamiento. Mediante una estación de imagenología por bioluminiscencia, análisis de supervivencia y análisis histopatológico y de expresión proteica, los datos obtenidos pueden utilizarse entonces para evaluar la eficacia de terapias experimentales contra tumores cerebrales.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neuro-oncología, como si el agente anti-tumoral puede acceder al cerebro. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de tumores cerebrales en pacientes, porque estamos tratando tumores cerebrales humanos que se desarrollan en un huésped animal. Trabajando bajo una campana de cultivo de tejidos, prepare las células tumorales subcutáneas para su transferencia al compartimento intracraneal.Comience colocando los tumores de flanco extirpados en placas de cultivo celular. Con un escalpelo, pique el tejido. Luego, usando una pipeta, desintegre mecánicamente el tejido para crear una suspensión de agregados celulares.A continuación, pase la suspensión de agregados celulares a través de un filtro con malla de nailon de 70 micrómetros y recójala en un tubo de fondo redondo. Repita este proceso un total de tres veces para obtener una suspensión de células individuales adecuada para inyección intracraneal. Centrifugue la suspensión a 1000 RPM durante 10 minutos a cuatro grados Celsius; tras la centrifugación, aspire el sobrenadante y luego resuspenda los botones celulares en un volumen apropiado de medio libre de suero para obtener una concentración de trabajo final, como alternativa a la desagregación de tumores subcutáneos.Las células tumorales pueden obtenerse de cultivos celulares que contienen líneas celulares establecidas de tumores cerebrales. Recoger las células mediante tripsina en centrifugación.Tras la centrifugación Resus, suspenda las células en el volumen adecuado de DMEM libre de suero para inyecciones supratentoriales a mano alzada. Prepare de tres a cinco veces 10 a la cinco células en tres microlitros. Desinfecte el área quirúrgica rociando todas las superficies con clorhexidina al 2%.A continuación, coloque los siguientes materiales en el área quirúrgica: una almohadilla calefactora para mantener la temperatura corporal del ratón, dos pequeños recipientes de vidrio, uno con peróxido de hidrógeno al 3% y otro con clorhexidina al 2%, GRE estériles, hisopos de algodón, escalpelos desechables estériles y una grapadora quirúrgica esterilizada en autoclave.Una vez que el ratón haya sido anestesiado con una mezcla de ketamina y xilacina, cambie varias veces el área quirúrgica utilizando torundas estériles sumergidas en clorhexidina. Aplique mentol para mantener una humedad adecuada durante el procedimiento. Utilizando un escalpelo estéril, realice una incisión sagital sobre el hueso paroccipital, aproximadamente de un centímetro de longitud.Con un hisopo de algodón empapado en solución de peróxido de hidrógeno al 3 %, limpie la superficie expuesta del cráneo. En este momento, el bgma debería ser evidente para crear una abertura para la inyección de células tumorales. Utilice una aguja estéril de calibre 25 y punta afilada para perforar el cráneo.Dos milímetros a la derecha de bgma y un milímetro anterior a la sutura coronal. Mezcle el contenido de la suspensión celular golpeando suavemente. Cargue la jeringa con la cantidad deseada de suspensión celular.Evite crear burbujas de aire. Limpie el exterior de la jeringa con un hisopo de alcohol para eliminar cualquier célula adherida. Esto ayudará a prevenir el establecimiento y crecimiento de tumores craneales adicionales, como se muestra aquí, para asegurar que se alcance la profundidad de inyección adecuada.Cuando no se utilice un aparato estereotáxico para animales pequeños, use un bisturí para cortar tres milímetros del extremo puntiagudo de una punta de pipeta P20. Coloque la sección de la punta sobre la jeringa para limitar la profundidad de la inyección, asegurando así que la punta de la aguja de la jeringa esté a tres milímetros del lado inferior del cráneo. Por lo tanto, el siguiente paso del procedimiento es probablemente el aspecto más difícil de todo el método al realizar la inyección siguiente; lograr la muerte adecuada y la administración es de suma importancia para garantizar que el tumor se establezca y crezca en la ubicación correcta del cerebro.A continuación, coloque una jeringa perpendicular al cráneo a través del orificio e inyecte lentamente la suspensión celular. Inyectar volúmenes mayores de lo recomendado puede provocar reflujo de células tumorales a través del trayecto de la aguja, lo que resulta en un crecimiento tumoral subcutáneo en lugar de intracraneal. Como se muestra aquí, un ángulo inadecuado de inserción de la jeringa puede provocar la inyección de células en los ventrículos y una posterior diseminación espinal, tal como se observa aquí al finalizar la inyección.Deje la aguja en su lugar durante un minuto más, luego retire lentamente. Estos pasos ayudarán a prevenir el reflujo tumoral. Limpie el cráneo con peróxido de hidrógeno al 3 % y seque.Utilizando un hisopo estéril. Aplique cera ósea estéril en el orificio utilizando pinzas. Junte el cuero cabelludo sobre el cráneo con la dermis de cada lado, presionadas juntas, cara interna contra cara interna, y sujete con grapas.Luego limpie el cuero cabelludo utilizando clorhexidina. Administre buprenorfina mediante inyección subcutánea para aliviar el dolor postoperatorio. Aunque aquí no se muestra, la buprenorfina se absorbe rápidamente.Proceda a inyectar ratones adicionales. Asegúrese de mezclar las células entre inyecciones para mantener una concentración adecuada entre los miembros de una serie de inyecciones. Se recomiendan grupos de tratamiento de al menos ocho para ayudar a garantizar resultados estadísticamente significativos.Monitore todos los ratones posoperatoriamente hasta que puedan caminar y recuperen una actividad normal. Por lo general, el tiempo de recuperación es de aproximadamente 30 minutos, comenzando una semana después de la inyección de células tumorales. La imagen cuantitativa de bioluminiscencia o QBLI debe realizarse una o dos veces por semana. Aquí.La QBLI se lleva a cabo utilizando la estación de imagen IVIS Lumina y el software Living Image versión 3.2. Desde el menú de inicio de Windows, seleccione el programa del software Living Image. Una vez que el programa se abra, haga clic en el botón del sistema IVIS inicializado en el panel de control de la cámara.Después de la inicialización, el cuadro de estado de temperatura debe estar en verde, lo que indica que la cámara CCD está adecuadamente enfriada. Coloque el ratón anestesiado inyectado con luciferina sobre la platina de la cámara de imagen. Abra uno de los archivos guardados de su sesión de imagen y cambie la visualización de los datos de imagen de cuentas a fotones. Para determinar los fotones por segundo de la señal objetivo, seleccione el icono de círculo del menú desplegable de ROI.Debe aparecer una región de interés etiquetada como ROI alrededor de la señal objetivo. La señal debe ingresarse en un archivo de Excel en el que se indique el número del animal y el día de la adquisición de imágenes. Repita esta secuencia para todos los animales analizados durante su sesión de adquisición de imágenes.Una vez que se hayan determinado los conteos de fotones para cada ratón que fue analizado y los valores de fotones se hayan transferido a un archivo de Excel, convierta las lecturas de luminiscencia en valores normalizados dividiendo la luminiscencia de cada ratón obtenida durante y después de la finalización del régimen terapéutico por su luminiscencia máxima previa al tratamiento. Para realizar el análisis de supervivencia utilizando el software Prism, use el estimador de KAPLAN-Meier para generar gráficas de supervivencia y estimar los valores medianos de supervivencia.Las diferencias entre las curvas de supervivencia se comparan utilizando una prueba de rango logarítmico. La eutanasia del animal debe realizarse si este muestra una disminución significativa en su estado de salud, especialmente si hay una pérdida de peso mayor al 20 % del peso máximo. Con una rápida pulsación, retire el cerebro del ratón eutanasiado y luego coloque el cerebro en formol para el análisis posterior de la morfología tumoral e inmunohistoquímica.Este ejemplo muestra los valores medios de luminiscencia normalizada en ratones que recibieron terapia mediante inyección intracraneal de células tumorales con inicio de erlotinib en el día 34. Las barras de error indican el error estándar. Una diferencia significativa en la luminiscencia normalizada media es evidente en el primer punto temporal de imagenología tras el inicio de la terapia. La diferencia en la luminiscencia media entre los grupos muestra un aumento adicional en puntos temporales posteriores en la mayoría de los casos.La actividad antitumoral inducida por la terapia, indicada por QBLI, va acompañada de una diferencia significativa correspondiente en la supervivencia. Como es el caso aquí, las tinciones HEMMAT y EOSINA de secciones del cerebro de ratón incluidas en parafina muestran el patrón de distribución de las células tumorales. P 10 es un marcador que frecuentemente se asocia con la respuesta tumoral a la inhibición de EGFR. Aquí.Se observa que los otin de células tumorales tratadas carecen de expresión de P 10, como indica la ausencia de tinción marrón. Aquí se muestra una sección del cerebro de ratón incluido en parafina. Las células tumorales cerebrales sensibles al inhibidor de EGFR pueden identificarse mediante la tinción marrón de EGFR.Como ha visto, el aspecto más difícil de este procedimiento es la inyección adecuada de las células tumorales. ¿Cuál podría ser el siguiente experimento que se puede realizar utilizando este enfoque, como investigar los efectos sobre el crecimiento de modificaciones genéticas en células tumorales? Eso es todo.Espero que esta presentación haya sido útil. Buena suerte con sus experimentos.

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El establecimiento de xenoinjertos de tumor cerebral intracraneal, con posterior análisis del crecimiento tumoral y respuesta al tratamiento con imágenes de bioluminiscencia

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