Patrón fotoestimulación con dispositivos digitales de Micromirror encargado de investigar la integración a través de puntos dendríticas Poder

El objetivo general de este procedimiento es controlar patrones complejos de luz en el tiempo y el espacio para que pueda usarse para estimular las neuronas. Esto se logra colocando primero un chip DMD en un plano de imagen conjugada apropiado en la trayectoria óptica del microscopio. El segundo paso del procedimiento es iluminar adecuadamente el DMD con una fuente de luz intensa como un láser.

El tercer paso del procedimiento es eliminar el efecto de moteado de la iluminación coherente. El paso final del procedimiento es integrar una interfaz gráfica de usuario para manipular el chip DMD. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran que experimentos que antes eran difíciles de lograr ahora se pueden completar con relativa facilidad mediante la lisis multisitio del neurotransmisor de la jaula empleando el sistema DMD.

Hola, soy Michael Mohammed y soy el laboratorio del Dr. Chaman Tang en el Departamento de Neurología de la Universidad de Maryland. Hoy te mostraremos un procedimiento para generar patrones complejos de eliminación en un microscopio óptico. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la integración dendrítica.

Así que comencemos. Este protocolo demostrará el funcionamiento de un dispositivo de micro espejo digital o un sistema de iluminación DMD para la neurociencia experimental. Un DMD es un chip semiconductor óptico con varios cientos de miles de espejos móviles microscópicos dispuestos en una matriz rectangular En su superficie, la posición de cada espejo corresponde al píxel de una imagen.

Cada espejo se puede controlar individualmente para inclinarse entre dos orientaciones. En la orientación apagada, la luz se dirige lejos del eje óptico de la iluminación de la muestra. En la orientación on, la luz se dirige a lo largo del eje óptico.

DMD es muy adecuado para la lisis porque tolera la luz ultravioleta muy intensa, genera altas relaciones de contraste entre los píxeles de encendido y apagado, y puede cambiar entre los dos estados en decenas de microsegundos. La aplicación de los DMD para la investigación biomédica se ve favorecida por el amplio uso de software y hardware de manipulación de imágenes, y por el interés comercial en el campo de la visualización de imágenes. Los componentes modulares son comercializados por Texas Instruments como kits de descubrimiento DLP que proporcionan los controladores electrónicos de soporte para adaptar el DMD a un sistema microscópico.

Es necesario comprender los conceptos básicos sobre la óptica de la microscopía. El microscopio fluorescente moderno básico consta de una ruta de imagen y una ruta de iluminación. Se compone de un objetivo, un cubo de filtro y dos lentes de tubo distintas para la ruta de imagen e iluminación.

El microscopio está diseñado para tener posiciones conjugadas con el plano de la imagen de la muestra, donde los objetos enfocados en el plano de la muestra también aparecerán enfocados en estos planos de imagen conjugados. Un corolario de este concepto es que cualquier imagen brillante creada en el plano de la imagen conjugada también se proyectaría nítidamente en el plano de la imagen de la muestra. Esta estrategia se utiliza para proyectar un patrón de iluminación generado por computadora sobre la muestra.

El rayo láser sirve como una fuente de luz muy brillante que iluminará el patrón implementado por los micro espejos en los chips DMD colocados en un plano de imagen conjugado. El diseño de un sistema de iluminación DMD depende de las luces de excitación utilizadas para los experimentos optogenéticos, que utilizan luz en la longitud de onda visible. El patrón iluminado se puede llevar a través de la trayectoria de la cámara.

Por lo tanto, el chip DMD se puede montar simplemente en uno de los dos puertos de cámara de un módulo de puerto de cámara dual. Por el contrario, para los experimentos que utilizan luz en el rango UV, como la lisis de compuestos enjaulados, la luz debe llevarse a través de la ruta de iluminación epi y se debe crear un plano de imagen conjugado más accesible. Esto se debe a que la lente del tubo de imagen no está diseñada para la transmisión UV.

En cambio, la lente de tubo de iluminación se utiliza para la transmisión UV y realiza un trabajo adecuado en la formación de imágenes. Cada micro espejo en el DMD puede cambiar entre una inclinación positiva y negativa de 12 grados en relación con el plano del chip. Dependiendo de la entrada digital que recibe de la computadora, el eje de rotación está a lo largo de las esquinas diagonales de cada espejo, 45 grados con respecto a los lados rectangulares del chip.

La orientación de la inclinación del espejo se designa mediante un triángulo de color dorado en una esquina de la superficie frontal del chip. La inclinación del microespejo dicta la alineación del tono y el acimut del haz de iluminación entrante. Para iluminar el DMD, primero configure el paso del haz de iluminación para que esté a 24 grados del eje perpendicular del chip DMD y configure el acimut para que sea perpendicular al eje de rotación del espejo.

La alineación precisa del haz es fundamental para un funcionamiento eficiente. Para experimentos de lisis. Utilice una fuente láser para generar el haz enfocable de alta intensidad necesario para un desenjaulado rápido.

Aquí se emplea un láser ateado ND triplicado con frecuencia de estado sólido bombeado por diodo cuasi continuo, use un láser de potencia relativamente alta porque solo una pequeña fracción de la salida del láser se entrega realmente a la muestra. Cuando se utiliza un sistema DMD, se lanza la salida del láser a una fibra multimodo para que pueda colocarse y orientarse fácilmente a lo largo del eje correcto para iluminar el DMD y proporcionar una solución a la mancha. Problema generado a partir de la iluminación coherente que transmite la luz a través de la fibra óptica.

La fibra se enrolla alrededor de un estirador eléctrico de fibra de pazo que se acciona para oscilarla alrededor de 40 kilohercios. El estiramiento microscópico de la fibra es suficiente para mover el patrón de moteado muchas veces durante la duración de milisegundos de cada pulso de fotoestimulación, eliminando así eficazmente el moteado. Finalmente, la salida de la fibra óptica se coteja con un objetivo de microscopio UV para iluminar los DMD para coregistrar el píxel CCD con el software de imagen DMD que correlaciona los espejos DMD individuales con píxeles específicos de la cámara CCD de imagen que se escribió.

La interfaz gráfica de usuario dentro del software permite al usuario asignar la orientación del espejo DMD que corresponde a la región de la imagen CCD con el mouse de la computadora utilizando la interfaz gráfica de usuario. Etiquete la ubicación para la fotoestimulación moviendo el cursor sobre la imagen que se muestra en la pantalla de la computadora y haga clic en la región etiquetada de interés para programar la tienda de patrones de entrega de luz. El patrón marcado en la pantalla de la computadora como una serie de imágenes separadas programa la sincronización de los pulsos láser para cada patrón espacial en el software.

Esto se integrará con el programa de adquisición de datos P clamp. Por último, utilice el programa de adquisición de datos para coordinar la sincronización de la electrónica DMD, la activación del láser y la adquisición de la señal eléctrica fijada por el parche de la neurona objetivo. Aquí se muestra una calibración de la resolución del sistema óptico.

El tamaño mínimo del punto se muestra medido desde un objetivo fluorescente. La resolución fisiológica efectiva se mide por la amplitud del flujo de corriente en función de la fotoestimulación. En la posición del punto, el glutamato en jaula fue fotografiado adyacente a una rama dendrítica de dos micrómetros de diámetro.

A medida que se movía el lugar. Ortogonalmente a través de la dita se muestran las respuestas eléctricas a la fotoestimulación de diferentes intensidades. Se muestran las respuestas de tensión en función de la intensidad de la lisis.

La estimulación dendrítica distribuida se puede implementar fácilmente utilizando un sistema basado en DMD. Aquí, la intensidad de entrada se varió aumentando el número de puntos de fotoestimulación marcados como círculos en las dos ramas dendríticas. La suma espacial puede ser no lineal entre puntos de bifurcación.

Se vuelve cada vez más súper lineal con amplitudes de entrada crecientes que llegan a las dos puertas a las ramas. Estos resultados ilustran claramente la forma no lineal de suma a través de puntos de ramificación dendrítica. La superlinealidad está mediada en gran medida por receptores NMDA y no por canales dependientes de voltaje.

Esto se puede demostrar ya que la aplicación de dos antagonistas NMDA A PV y MK 8 0 1 eliminan en gran medida el comportamiento no lineal. Acabamos de mostrarte el diseño básico y el funcionamiento de un sistema basado en DMD para la fotoestimulación de patrones de tejido neural. El sistema se puede adaptar para la estimulación con luz visible, como la que se utiliza para experimentos optogenéticos.

También puede ser adaptable para luces UV cercanas como se usa para la lisis de un solo fotón. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que si se va a utilizar una luz a una longitud de onda inferior a 400 nanómetros y la mayoría de las personas salen a través de la ruta de iluminación epi, esa alineación precisa del haz de iluminación dentro de unos pocos grados es crítica, y que si se usa una luz coherente, las manchas deben eliminarse de manera efectiva. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.