Name: En vivo-La centrifugación de embriones de Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-23T16:55:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Aprende a separar orgánulos por densidad en embriones vivos de Drosophila mediante centrifugación in vivo. Este método evita artefactos de ruptura celular y facilita experimentos de colocalización y análisis bioquímico.

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Damos las gracias a Susan Gerbi, Heidi Smith, y David Lambert para el suministro de material a prueba in-vivo centrifugación en Sciara coprophila y obsoleta Ilyanassa, respectivamente. Agradecemos a los miembros del laboratorio de Welte para comentarios sobre la técnica y el manuscrito. Desarrollo y el perfeccionamiento de la prueba de centrifugación en vivo fue apoyada por NIGMS conceder GM64687 para el PMA. Las imágenes mostradas en la figura. 1 y la figura. 5E, F se publicó anteriormente con el 2 y se reproduce aquí con permiso.

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</ol>

Los pasos críticos Asegúrese de que la concentración de agar es lo suficientemente alto. Si es demasiado baja, el agar se desintegra durante la centrifugación, y los embriones va a estallar o ser orientadas al azar. Si la concentración de agar es sólo un poco demasiado bajo o si el agar es húmeda (extracción suficientemente seca o insuficiente de los servicios de apoyo técnico en exceso en el paso 4.3), los embriones se saldrán de sus agujeros durante la centrifugación y se convierten en mal orientada. Si el agar se vierte demasiado fino, también se derrumbará o crack durante el centrifugado. Asegúrese de que los embriones no han avanzado más allá de las etapas cellularization. De lo contrario, la separación de los orgánulos no va a funcionar (Fig. 5C), ya que se convertirá en orgánulos secuestrado dentro de miles de células individuales. En los embriones más jóvenes en la etapa de célula, los orgánulos son libres para migrar grandes distancias y se acumulan de acuerdo a su densidad característica. Para evitar el análisis de embriones que son demasiado viejos, asegúrese de que (i) incluye una colección pre-para permitir que las hembras para depositar sus huevos viejos (paso 2.4), (ii) recoger los embriones durante 3 horas o menos (paso 2.5), (iii) seleccionar visualmente los embriones antes de las etapas cellularization para integrarse en agar (paso 4.2), (iv) mantener incorporación de corto tiempo para prevenir el desarrollo hasta el final de cellularization (paso 4.6), y (v) desechar los embriones que no la capa de forma correcta (paso 5.6) . No escatime en el tiempo de centrifugación. Aunque algunos de los embriones muestran capas bien incluso después de sólo 10 minutos de centrifugación, la separación no es coherente desde el embrión al embrión. 30 vueltas min dar resultados muy consistentes. Además, cuanto mayor sea el tiempo de centrifugación, el más largo de las capas se mantienen estables después de la centrifugación ha terminado. Esto es importante para aquellas aplicaciones en las que se necesita tiempo para procesar los embriones más antes de su uso (por ejemplo, si es que necesitan ser procesados ​​para los experimentos de trasplante o montados para el análisis confocal). Posibles modificaciones Recolección de huevos y eliminación de los diferentes protocolos de corion existen muchos de los pasos 2 y 3 1, 3, 9, y el trabajo, así como los aquí descritos, siempre y cuando los embriones utilizados son los jóvenes, la producción de huevo es alta, y la fracción del mis- embriones escena se reduce al mínimo. Antero-posterior alineamiento El protocolo orienta todos los embriones de tal manera que el extremo posterior está enterrado en el agar y el extremo anterior es hacia arriba (Fig. 3). Esta orientación es buena para mantener la coherencia, de modo que es posible utilizar el micrópilo como un hito que terminan apuntando hacia arriba durante la centrifugación (Fig. 1, 5). Sin embargo, con la práctica, es fácil detectar la orientación de los embriones de centrifugado por la aparición de los distintos lípidos gota y las capas de yema de huevo por el microscopio de campo brillante. Entonces se convierte en la posibilidad de montar los embriones, ya sea con terminar, esta flexibilidad se acelera el proceso de montaje. Centrifugación desorientada El aspecto más tiempo y es técnicamente desafiante del protocolo es el montaje de los embriones en agar (paso 4). Se requiere tocar cada embrión en dos ocasiones (una vez que lo inserte en el agujero y una vez que se recuperan después de centrifugación). Como alternativa, se puede transferir los embriones en el paso 4.1 en tubos de microcentrífuga lleno de TSS. Cuando estos tubos se centrifugan en una microcentrífuga (13.000 rpm, 10-30 min), los embriones también suelen capa y 10-13. Esta variación permite procesar cientos de embriones a la vez muy rápidamente. Sin embargo, la estratificación no es tan consistente, una fracción de los embriones no se desarrolla de distintas capas a pesar de las fuerzas de centrifugación mucho mayor (~ 16 000 g) que aplica en el protocolo anterior. Más problemático es el hecho de que la orientación de los embriones es variable, y se puede observar la separación en distintos ángulos con respecto al eje principal del embrión. Esta variabilidad requiere el investigador para clasificar después de la centrifugación como un embrión en particular, se organizó en el tubo de centrífuga. Con el uso de la autofluorescencia yema como un marcador para la parte más densa del embrión, esto es a menudo posible, aunque requiere mucha práctica y más juicio para hacerlo de forma fiable. Si hay embriones suficiente en la muestra, uno puede ser capaz de resolver los casos en que los embriones que pasó a ser dispuestos como en la figura. 1. Centrifugación de los embriones en su cáscara de huevo es posible incluir los embriones en agar para el paso 4 sin necesidad de retirar el corion 2 primeros. En este enfoque, los embriones en la placa de la colección están cubiertos con aceite de halocarbonos en lugar de 50% de lejía en el paso 3.2 (halocarbonos se vuelve transparente el corion). Embriones de las etapas apropiadas se seleccionan y se transfieren a una placa de agar con unas pinzas nuevas, sólo por el acaparamiento de los filamentos de huevo con las pinzas, el daño ael embrión adecuado se evita. Los embriones están inmersos en el paso 4.4 hasta 4.8, con los filamentos de huevo anterior que sobresale de el agujero en el agar. La cáscara del huevo se elimina por tratamiento con lejía al 50% después de que los embriones han sido centrifugado y excavado en el agar como en el paso 5.4. Centrifugación en presencia de la cáscara de huevo puede mejorar la tasa de devitellinization después de la fijación (paso 6.2), pero la selección de las etapas de centrifugación correcta (paso 4.2) es más difícil. Aplicaciones Centrifugación embrión es particularmente útil para los experimentos de colocalización, es decir, para probar si una proteína se localiza en un determinado orgánulos más importantes. Por ejemplo, la proteína está presente en Klar principios de gotas de lípidos embrionarias, sin embargo, esta localización es difícil de demostrar en los embriones intactos. En parte, esto se debe a que tanto Klar puntos lagrimales y las gotas de lípidos son abundantes en la periferia del embrión 10, por lo que colocalización duro para descartar falsos. Sin embargo, la centrifugación concentra las gotas de lípidos en una capa distinta, y por lo tanto, colocalización con la señal de Klar se hace evidente 10. Un análisis similar se ha demostrado de manera inequívoca la localización de las otras proteínas a 8 gotas de lípidos, 13-15, con ejemplos sorprendentes como las histonas ciertos 2 y en los casos en que una proteína está presente por doquier, pero enriquecido por las gotas de lípidos 8. Los embriones se pueden seleccionar visualmente la etapa de desarrollo (paso 4.2), es posible la determinación de la contratación desarrollo regulado de proteínas a 8 gotas de lípidos, 15. Las pruebas de colocalización con las gotas de lípidos es muy fácil, ya que las gotas de lípidos se acumulan en una diferencia visual de &quot;tope&quot;, por lo que ningún marcador más o mancha se requiere para identificar a esta capa. De hecho, debido a su facilidad y resultados visuales potencialmente sorprendentes (Fig. 1, fig. 5 D, E), el laboratorio emplea esta técnica de manera rutinaria como la primera prueba si un candidato proteína se localiza en las gotas de lípidos. En principio, los estudios similares colocalización debe trabajar para los orgánulos que se muestran en la figura. 1, y es probable que para otros (incluyendo parásitos intracelulares), cuya distribución en los embriones de centrifugado aún no se ha documentado. Desde la centrifugación se concentra en los organelos bandas apretadas, que facilita el aislamiento de una fracción enriquecida en estos orgánulos. Este enfoque ya ha sido utilizado para recuperar las gotas de lípidos para el trasplante en dos embriones de donantes. También puede ser posible analizar bioquímicamente la fracción enriquecida (por ejemplo, mediante la reducción de las capas de embriones después de la fijación 15). El método descrito aquí tiene aplicaciones más allá de embriones de Drosophila, como la centrifugación puede ser usado para estratificar a los huevos de diferentes especies (incluyendo ranas, nematodos, tunicados, anélidos, erizos de mar, moluscos, cnidarios y) 16. En nuestro propio laboratorio, se ha utilizado el protocolo anterior para los embriones de la mosca doméstica Musca domestica 2 y han utilizado la centrifugación no orientado en el análisis de los embriones de los hongos mosquito Sciara coprophila 17 y el caracol Ilyanassa obsoleta 17. Finalmente, este método no se limita a los embriones: La centrifugación también puede ser útil para estratificar a otras células grandes, como los ovocitos (por ejemplo, en Drosophila 2, 18 y el algodoncillo error Oncopeltus fasciatus 17). Para el modelo diferentes, las condiciones de centrifugación exacta necesita ser optimizado: Por ejemplo, 10 minutos a 3000 g es suficiente para estratificar de manera eficiente los embriones de Musca domestica 2, y si se centrifuga mucho más tiempo, los embriones tienden a separarse durante la fijación y tinción.

<table><tbody><tr><td>Placas de Petri de 60x15 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>#35-1007</td><td>De Falcon</td></tr><tr><td>Malla metálica</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CX-0150</td><td>acero inoxidable tipo 304; tamaño de malla #150 x150, diámetro del alambre: 0.0026 pulgadas</td></tr><tr><td>Agujas de tungsteno</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-10</td><td>0.25 mm</td></tr><tr><td>Soporte de alfiler/aguja niquelado Moria</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Jaulas para moscas</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-100 o 59-101</td><td>Para placas de Petri de 65 mm o 100 mm de diámetro, respectivamente</td></tr><tr><td>Aceite de halocarbono 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8773</td><td></td></tr></tbody></table>

en vivo-la centrifugación de embriones de drosophila

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

Una estrategia importante para la purificación y aislamiento de los diferentes tipos de organelos intracelulares es separarlos unos de otros sobre la base de diferencias en la densidad de flotación. Sin embargo, cuando las células se rompen antes de la centrifugación, las proteínas y orgánulos en este entorno no-nativos a menudo inadecuadamente pegan unas a otras. Aquí se describe un método para separar organelos por la densidad de intacto, viviendo embriones de Drosophila. Principios de los embriones antes de cellularization se cosechan a partir de las jaulas de la población, y sus cáscaras de huevo exterior se eliminan mediante el tratamiento con 50% de lejía. Los embriones se transfieren a una placa de agar pequeña y se inserta, extremo posterior en primer lugar, en pequeños agujeros verticales en el agar. Las placas que contienen embriones incrustado se centrifugan durante 30 min a 3000g. El agar soporta los embriones y los mantiene en una orientación definida. Posteriormente, los embriones son extraídos del agar con una aguja de punta roma. Centrifugación separa orgánulos importantes en distintas capas, una estratificación fácilmente visible por el microscopio de campo brillante. Una serie de marcadores fluorescentes están disponibles para confirmar la estratificación éxito en embriones vivos. Proteínas asociadas con ciertos orgánulos se verá enriquecido en una capa de concreto, lo que demuestra colocalización. Las capas individuales pueden ser recuperados para su análisis bioquímicos o trasplante en la donación de óvulos. Esta técnica es aplicable para la separación de orgánulos en otras células grandes, incluyendo los huevos y los ovocitos de diversas especies.

Se describe un método para separar los orgánulos de la densidad en la vida<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriones. Los embriones están inmersos en agar y se centrifuga. Esta técnica produce la separación reproducible de los organelos importantes a lo largo del eje antero-posterior del embrión. Este método facilita la colocalización experimentos y las fracciones de los rendimientos de orgánulos para el análisis bioquímico y experimentos de trasplante.

En vivo-La centrifugación de embriones de Drosophila

Una estrategia fundamental para purificar e aislar diferentes tipos de orgánulos intracelulares consiste en separarlos entre sí basándose en las diferencias de...

La separación de los principales orgánulos dentro de los huevos de la mosca de la fruta según su densidad comienza con la recolección de embriones, que tienen menos de tres horas de edad. Las cubiertas del huevo se eliminan luego mediante incubación en lejía al 50 % tras la desovación. Los embriones, que presentan estadios definidos, se montan en agar. Como paso final, los embriones se centrifugan y se recuperan, examinando los embriones recuperados mediante luz brillante y fluorescencia. La microscopía muestra la localización de proteínas específicas en ciertos orgánulos. Una estrategia principal para purificar y aislar orgánulos intracelulares consiste en separarlos de todos los demás componentes celulares por densidad, pero existe un desafío, ya que las células se rompen antes de la centrifugación, liberando proteínas y orgánulos que normalmente están separados.Las mayas se adhieren entre sí bajo estas condiciones in vitro no nativas. Por el contrario, algunas proteínas podrían desprenderse de las estructuras a las que normalmente se unen. La principal ventaja de la técnica que vamos a describir es que permite la separación por densidad in vivo.Por lo tanto, evita romper las células y los artefactos que conlleva este procedimiento. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología celular. Facilita enormemente los experimentos de colocalización y permite el aislamiento de fracciones organulares específicas para experimentos de trasplante y para análisis bioquímicos.En este procedimiento, se prepara un medio de agar al alto porcentaje que contiene jugo de manzana y se vierte en placas según se detalla en el protocolo escrito adjunto. Las placas se utilizan tanto en el paso de puesta de huevos como para la posterior inclusión y centrifugación de los embriones. Este procedimiento comienza con la iniciación de la recolección de huevos.Primero, prepare una pasta de levadura mezclando levadura seca con agua hasta obtener una consistencia similar a la de la mantequilla de maní. Luego, cubra una porción de una placa de agar con jugo de manzana fresco con la pasta de levadura. Las moscas adultas se mantienen en jaulas a las cuales se adhieren placas de agar en la parte inferior.Para retirar la placa actual, invierta la jaula para moscas y golpéela contra la superficie del banco. Unas cuantas veces, las moscas caen al fondo y quedan brevemente desorientadas durante este período muy corto. Reemplace rápidamente la placa de agar antigua con la placa nueva recubierta con la pasta de levadura.La levadura proporciona nutrición para la producción de huevos, y junto con el jugo de manzana en el agar, induce la puesta de huevos. Descarte la recolección de huevos durante los primeros 30 a 60 minutos. Esto produce una gran fracción de embriones mal estadiados, ya que fueron retenidos por las hembras tras la fertilización.Las colecciones posteriores de huevos suelen estar dominadas por huevos depositados poco después de la fertilización. Recolecte los huevos durante hasta tres horas, ya que el estratificado más consistente se logra en embriones jóvenes. Se prefieren tiempos de recolección más cortos de una hora o menos.Para experimentos de rutina, utilice pinzas para retirar cualquier mosca adherida a la levadura o a la superficie de la placa de agar. Después de recolectar los huevos, proceda a retirar el huevo, retire la cáscara, coloque la placa de agar bajo un microscopio estereoscópico y observe los embriones mediante transiluminación. Asegúrese de identificar los filamentos del huevo para eliminar la cáscara de los embriones.Presione una solución de lejía al 50 % debajo de la placa de agar, cubriendo los embriones, e incube durante varios minutos. Agite la placa de agar ocasionalmente para mover los embriones dentro de la lejía. Examine nuevamente los huevos bajo el microscopio.Una vez que los filamentos de huevo ya no sean visibles, se habrá eliminado con éxito el Corian. Esto generalmente requiere de tres a cinco minutos de incubación con la solución de lejía. A continuación, utilice un tamiz de malla metálica para separar los embriones de la lejía.La cesta se prepara a partir de un cuadrado de dos centímetros por dos centímetros de una lámina plana de malla metálica, con una indentación en el centro. Sujete la cesta de alambre con pinzas y sosténgala sobre la tapa invertida de la placa de agar. Vierta la mezcla de lejía y embriones desde la placa de agar a través de la malla metálica, dejando que drene hacia la tapa de la placa de agar.Si los embriones permanecen en la placa de agar, rocíe agua destilada sobre la placa para desalojarlos y vierta la mezcla de agua destilada y embriones a través de la malla metálica. Toque la parte inferior de la malla metálica con una toalla de papel para absorber cualquier líquido excesivo. Luego, rocíe agua destilada a lo largo del perímetro del cesto de alambre para enjuagar el residuo de lejía, minimizando así la pérdida de embriones.Escurra con frecuencia el exceso de líquido. Repita el paso de lavado de cinco a diez veces hasta que se haya eliminado todo el blanqueador. Si la canasta de alambre aún huele a blanqueador, continúe lavando los embriones.Una vez que los embriones se hayan lavado suficientemente, se pueden montar en agar. Lave los embriones fuera del canasto de alambre. Con TSS hacia un plato de Petri vacío, el embrión debe hundirse hasta el fondo.En un microscopio estereoscópico, observe los embriones mediante transiluminación. Es posible reconocer visualmente etapas específicas con facilidad. Utilizando una pipeta P200, seleccione embriones de las etapas deseadas y transfiéralos a una pequeña placa de agar.Trabaje rápidamente, ya que los embriones están envejeciendo y sumergirlos durante más de 30 minutos en TSS puede afectar el desarrollo, utilizando una pipeta. Bajo una toalla Kim. Retire la mayor parte del TSS.La superficie del agar debe estar ligeramente húmeda, lo que facilita mover los embriones. Sin embargo, no debe haber acumulaciones de líquido en ninguna parte de la placa, ya que el exceso de líquido durante la centrifugación hará que los embriones se deslicen fuera de los orificios. El aspecto más difícil de este procedimiento es montar los embriones y el sacacorchos.Esto es particularmente desafiante porque los embriones son delicados y pueden destruirse fácilmente si se manipulan de forma brusca. Para prevenirlo, la aguja debe moverse lentamente, con cuidado y en pequeños incrementos. La práctica es la mejor manera de aprender exactamente cuánto tacto y presión puede soportar el embrión. Monte la lanceta y la aguja hacia atrás en un portaagujas de modo que el extremo romo sobresalga mientras observa.Bajo el microscopio, utilice la aguja para hacer perforaciones verticales en el agar cerca de cada embrión, de modo que pueda observar simultáneamente al microscopio mientras introduce la aguja en el agar; la aguja se sostiene en un ángulo. Por ello, es difícil hacer perforaciones perfectamente verticales. Sin embargo, la ligera inclinación de la aguja crea una pequeña depresión o surco en un lado del orificio, de forma que el embrión se desliza fácilmente a lo largo de este y entra en el orificio.A continuación, identifique los extremos anterior y posterior de los embriones alargados, ya que el embrión debe introducirse en los orificios con una orientación consistente. Normalmente con el extremo anterior hacia arriba, la membrana ign en el extremo anterior se caracteriza por una estructura especializada. La microestaca, utilizando el extremo romo de la aguja, empuja al embrión para moverlo a lo largo del agar y orientar y maniobrar su extremo posterior hacia un orificio perforado.Luego, empuje el extremo anterior hacia el orificio. El embrión debe deslizarse fácilmente dentro del orificio a lo largo de la ligera depresión generada durante la punción. A medida que el embrión se inclina hacia arriba, empuje más hacia abajo dentro del orificio.El agar es lo suficientemente blando como para que, una vez que se inserta parcialmente un embrión en un orificio perforado, pueda empujarse más hacia adentro sin causar daño. Cuando se empuja completamente, el embrión generalmente ya está bastante vertical. Si no lo está, alineamos el embrión insertado más verticalmente empujándolo lateralmente.Si el orificio no es demasiado grande, la posición del embrión será mantenida estable por el agar durante toda la centrifugación. Con práctica, es posible incrustar de 100 a 250 embriones por placa. La cantidad de embriones necesaria depende de la aplicación posterior.Mantenga el tiempo de montaje breve. Si se desea una etapa de desarrollo estrecha, ya que los embriones continúan desarrollándose durante el montaje, retire los embriones sobrantes no utilizados con un pincel húmedo para moscas. A continuación, los embriones montados en agar se centrifugan.Transfiera las placas que contienen los embriones de mosca a los cubos oscilantes de la centrífuga, con el lado del agar hacia abajo. Asegúrese de que la centrífuga esté equilibrada uniformemente y centre las placas a 4.000 rotaciones por minuto durante 30 minutos a una temperatura de cuatro a 10 grados Celsius. Después de la centrifugación, coloque la placa de agar bajo el microscopio estereoscópico y cúbrala con una capa de TSS utilizando el extremo romo de la aguja.Extraiga los embriones de sus orificios. Los embriones flotan en el TSS pero permanecen sumergidos. Los embriones presentan una capa claramente definida con una tapa marrón en el extremo anterior, una región media transparente y un área gris oscuro en el extremo posterior.Deseche los embriones que no muestren una estratificación definida para la observación directa mediante microscopía de campo brillante o microscopía de fluorescencia epiescopia. Utilice una pipeta P200 para transferir embriones bien estratificados en TSS a un tubo microcentrífugo. Luego, transfiera los embriones en tampón a un portaobjetos de vidrio, y monte según se describe en el protocolo escrito adjunto.Si los embriones deben fijarse, utilice una pipeta P200 para transferir embriones bien estratificados en TSS a un vial de centelleo. Fije los embriones utilizando técnicas de fijación estándar. Dado que, para los embriones de centrífuga, la eficiencia del paso de desvitalización es baja.Comience con tantos embriones como sea práctico. Si los embriones van a utilizarse en experimentos de trasplante, transfiera los embriones a placas de agar y monte sobre laminillas. Utilizando procedimientos estándar de manejo de embriones, las referencias a dichos procedimientos pueden encontrarse en el protocolo escrito.La estratificación inducida por la centrifugación es estable durante decenas de minutos. A continuación se muestran imágenes con luz brillante de embriones vivos de oph antes de la centrifugación, mostradas con el extremo anterior a la izquierda y el extremo posterior a la derecha, con el lado dorsal arriba y el lado ventral abajo. Los embriones en etapa de segmentación aparecen uniformes.Las etapas marrones como esta son ideales para la centrifugación in vivo. Los embriones de blaster derm tienen un borde claro que aparece similar en todos los lados. Esta periferia clara se expande hasta casi el final de la ization.Los embriones aún pueden estratificarse con éxito mediante centrifugación hasta el final de la fertilización. La estratificación del vitelo y los núcleos no es tan consistente como en las etapas de segmentación. Una vez que aparecen embriones celulares asimétricos, los ventrículos dorsal y ventral se vuelven distintos y se desarrollan diversos pliegues.El embrión mostrado se encuentra en una etapa temprana de extensión de la banda germinal. En estas etapas, la centrifugación ya no es efectiva para estratificar los principales orgánulos. La embriogénesis es un continuo.Por lo tanto, estas etapas no son entidades discretas, sino que se transforman una en otra conforme avanza el desarrollo. Esta película lapseada captura cuatro horas de la génesis del embrión desde las etapas de segmentación. La extensión de la banda germinativa se aceleró 720 veces.A continuación se muestran imágenes de embriones centrifugados tomadas mediante iluminación transmitida. El embrión de la izquierda se estratificó adecuadamente. Las gotas lipídicas de baja densidad forman una capa lipídica en la punta más anterior.Los vehículos de yema de alta densidad se acumulan como una zona gris oscuro en el extremo posterior. Estas dos capas están separadas por una amplia zona clara que representa otros orgánulos y citoplasma. El embrión de la derecha fue centrifugado tras la ization.La estratificación es mínima si se dispone de un microscopio de fluorescencia epiluminiscente. Estos embriones vivos centrifugados pueden examinarse bajo excitación UV, donde la yema muestra una intensa fluorescencia azul del agua. Una capa compacta de material autofluorescente en el polo posterior indica una centrifugación exitosa y sirve como marcador para el extremo posterior.La apariencia de las capas cambia drásticamente si los embriones se fijan. Las gotas lipídicas se vuelven translúcidas y la capa lipídica aparece blanquecina y esponjosa mediante microscopía de luz brillante, en lugar de marrón oscuro. La fluorescencia de Yo corso se destruye parcial o completamente por la fijación, volviéndose mucho menos intensa o incluso indetectable.En esta imagen, los orgánulos están marcados con indicadores fluorescentes y los marcadores se acumulan en posiciones características a lo largo del eje anterior-posterior. Ciertas proteínas de fusión de histonas se localizan tanto en gotas lipídicas como en núcleos, por lo que pueden utilizarse para marcar estos compartimentos celulares y también para monitorear la etapa del embrión según el número de núcleos marcados. Como acaba de ver, uno de los aspectos más difíciles de este procedimiento es incrustar los embriones en el tornillo sinfín.Pero con algo de práctica, podrá hacerlo de forma rápida y eficiente. Una vez dominada, esta técnica hace que experimentos de colocalización, de otro modo tediosos, sean muy sencillos.Por ejemplo, nuestro laboratorio utiliza rutinariamente esta técnica para comprobar mediante microscopía de fluorescencia si una proteína de interés se localiza en un orgánulo mayor específico. Además, se pueden recuperar capas individuales de los embriones centrifugados para análisis bioquímicos o experimentos de trasplante. Esta técnica no es útil únicamente para embriones de mosca de la fruta.La centrifugación también separa orgánulos por densidad en los huevos de otras especies y en otros tipos celulares grandes, como los cítos.

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