Las operaciones de carga en Kinesin molecular Traslados Desarrollado

El objetivo general de este procedimiento es cargar nanosferas sobre microtúbulos, que se desplazan sobre una superficie recubierta con cinasas en motores. Esto se logra primero recubriendo la superficie de una celda de flujo de vidrio con una solución de caseína. El segundo paso del procedimiento consiste en absorber proteínas motoras de cinasina sobre la superficie de la celda de flujo.

El tercer paso del procedimiento consiste en agregar los microtúbulos. El paso final del procedimiento es añadir las moléculas de strept haver, que se unirán a los microtúbulos, y luego agregar las nanosferas. Las nanosferas se unen a la superficie de la celda de flujo, donde pueden ser captadas por los microtúbulos.

Finalmente, se puede observar cómo los nanoesferas son captadas por los microtúbulos y transportadas a través de la superficie mediante microscopía de fluorescencia. Hola, soy Elaine Jen Smith del laboratorio del Dr. Henry Hess y del Departamento de Ciencia e Ingeniería de Materiales de la Universidad de Florida. Hoy les mostraremos un procedimiento para el ensayo de motilidad invertida.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la carga de material sobre microtúbulos y el movimiento de transportadores moleculares. Así que comencemos. Antes de iniciar este procedimiento, prepare frescamente todas las soluciones stock según se describe en la parte escrita de este video.

Una vez preparadas las soluciones stock, inicie la preparación de microtúbulos pipeteando 25 microlitros de solución de crecimiento en un tubo microcentrífugo de 0,65 mililitros. A continuación, añada 6,25 microlitros de la solución de crecimiento a 20 microgramos de tubulina biotinilada liofilizada. Vortexe la solución y colóquela en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 30 minutos para polimerizar. Tras la incubación, diluya la solución 100 veces en tampón Taxol y vortexe suavemente.

Esta solución sirve para estabilizar los microtúbulos. Etiquete la solución como vacía 100 y almacénela a temperatura ambiente. A continuación, realice una dilución diez veces mayor de MT 100 en tampón antidesvanecimiento y etiquete esta solución como MT 1000.

Luego, prepare los motores de quinesina diluyendo la solución de quinesina 20 veces en el tampón TP. Etiquete la solución como quinesina en 20 y guárdela en hielo. Finalmente, prepare las soluciones de estreptavidina y de nanoesferas.

Primero, agregue estreptavidina marcada con Alexa Fluor 5 6 8 hasta una concentración de 100 nano molares en Buffer Antifa. Etiquete la solución como STV 100, luego diluya las nanoesferas 5.000 veces en Buffer Antifa y etiquete esta mezcla como NS 5.000. Almacene ambas soluciones sobre hielo.

Después de preparar las soluciones para el ensayo de carga, construya una celda de flujo utilizando una placa portaobjetos y una cubreobjetos separadas por cinta adhesiva doble cara. Primero, pegue dos tiras de cinta adhesiva doble cara en los bordes de una placa portaobjetos, dejando un espacio de aproximadamente un centímetro entre las tiras. Luego, coloque la cubreobjetos sobre la cinta.

Aplique presión sobre la cubreobjetivo utilizando el borde plano de una pinza para crear un sello. La celda de flujo construida tiene aproximadamente dos centímetros de largo, un centímetro de ancho y 100 micrones de alto, y un volumen de aproximadamente 20 microlitros. Para comenzar el ensamblaje del ensayo invertido.

Coloque la punta de la pipeta entre la cubeta y la portaobjetos. Luego, inyecte una solución de caseína de 0,5 miligramos por mililitro en la celda de flujo. Este recubrimiento en la celda de flujo permitirá que la quinesina conserve su funcionalidad tras la absorción.

Espere cinco minutos para que la solución de caseína recubra. A continuación, absorba la quinesina en la cámara de flujo introduciendo la quinasa en solución 20; las soluciones se introducen en las cámaras de flujo colocando la punta de la pipeta entre el cubreobjetos y el portaobjetos. Luego, la solución se inyecta en la cámara de flujo desde un lado, mientras simultáneamente se retira por el otro lado.

Con papel de filtro, permita cinco minutos para que la quinasa absorba. A continuación, introduzca los microtúbulos en la celda de flujo pipeteando la solución MT 1000 en la celda de flujo. Permita cinco minutos para que los microtúbulos se asienten y se unan a los motores de quinasa tras la unión de los microtúbulos a los motores de quinasa.

Recubra los microtúbulos con estreptavidina fluorescente TTR introduciendo la solución STV 100 en la cámara de flujo. Deje cinco minutos para que las moléculas de estreptavidina TTR se unan a los microtúbulos. Lave el exceso de estreptavidina TTR introduciendo tres lavados de 30 microlitros de solución Antifa en la cámara de flujo.

Finalmente, introduzca las nanoesferas de poliestireno biotiniladas y marcadas con fluoresceína mediante pipeteo de la solución NS 5.000 en la celda de flujo. La superficie absorbe de forma estacionaria. Las nanoesferas colisionarán con los microtúbulos en movimiento y se cargarán sobre ellos.

En este experimento, se utiliza un microscopio de fluorescencia Eclipse TE 2000 U equipado con un objetivo de inmersión de 100 x y X site, una lámpara de 20 y una cámara exon E-M-C-C-D. Primero, coloque una gota de aceite de inmersión sobre el objetivo. Luego, monte la celda de flujo sobre la platina del microscopio utilizando el cubo de filtro trixy.

Enfocar los microtúbulos, luego cambiar al cubo de filtro fitzy para observar las nanosferas. A continuación, abrir el programa and or I exon y configurar el modo de adquisición en cinético. Utilizar un tiempo de exposición de 0,5 segundos, una longitud de serie cinética de 20 y un tiempo de ciclo cinético de seis segundos.

Cambie el microscopio del ocular a la cámara e inicie la adquisición de imágenes. Para las primeras cuatro imágenes, utilice el cubo trixi para visualizar los microtúbulos. Para las siguientes 12 imágenes, cambie al cubo de filtro Fitz para adquirir imágenes de las nanoesferas.

Luego regrese al cubo de filtro trixi. Para las últimas cuatro imágenes, con las que se observan los microtúbulos, estos se visualizan utilizando el cubo de filtro Trissy; el cubo de filtro se cambia a fite para visualizar aquí las nanosferas, las cuales están siendo transportadas por los microtúbulos e identificadas mediante flechas. No todas las nanosferas han sido captadas por los microtúbulos.

Ahora se muestra la ubicación de las nanosferas 36 segundos después, lo que revela que las nanosferas han cambiado de posición. Cuando se vuelven a obtener imágenes de los microtúbulos, queda claro que los microtúbulos también han recorrido el campo de visión. Estas imágenes demuestran que las nanosferas han sido desplazadas debido al transporte por microtúbulos.

Acabamos de mostrarle cómo realizar el ensayo de motilidad invertida. Al realizar este procedimiento, es importante recordar cambiar los cubos de filtro durante la adquisición de imágenes para poder observar tanto los microtúbulos como las nanoesferas. Eso es todo.

Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.