Name: Todo el genoma análisis de Aminoacilación (de carga) Niveles de tRNA utilizando microarrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprende a analizar niveles de aminoacilación de tRNA en Saccharomyces cerevisiae mediante microarrays. Este método permite evaluar cambios en la carga de tRNA bajo diferentes condiciones de estrés celular.

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El trabajo de la levadura en el laboratorio de Pan fue financiado por una beca de Ajinomoto Japan, Inc. y los Institutos Nacionales de Salud de Formación subvención T32GM007183-33. Agradecemos al Dr. Ronald Wek en la Escuela de Medicina de la Universidad de Indiana para la colaboración a largo plazo en los proyectos de la levadura. También agradecemos al Dr. Kimberly Dittmar para el desarrollo del método de carga tRNA microarrays.

Parte 1: Aislamiento de tRNA total con cargo <ol><li> Pellet células en una centrífuga de mesa en 2000 RFC durante 5 minutos. El equivalente de 1 600 OD de las células deben producir por lo menos 1 g de ARN total y un mínimo de 30 mg se recomienda para el procedimiento. </li><li> Resuspender las células en una solución tampón de lisis que consiste en 0,3 M tampón Na +-acetato (pH 4,5) y 10 mM EDTA. Vortex con un volumen igual de Na +-saturada de acetato de fenol / cloroformo (pH 4,5) tres veces cada uno por 30 s. Asegúrese de mantener siempre en hielo entre los vórtices. Acetato de buffer puede ser preparado a partir de NaOAc y HOAc mientras acetato saturado con fenol / cloroformo se puede preparar mezclando 1 parte 5 M tampón acetato (pH 4,5) con 9 partes de fenol / cloroformo. Nota: el total aislamiento de ARN se lleva a cabo bajo condiciones ligeramente ácidas y hielo para evitar la desacilación de tRNA cargos. </li><li> Centrifugar a 18.600 RFC durante 15 minutos a 4 ° C. Eliminar la capa acuosa y realizar otra extracción saturada de acetato de fenol / cloroformo. </li><li> Después de la segunda extracción precipitar el ARN mediante la adición de volúmenes de 2.7x de etanol y centrifugación a 18.600 RFC durante 30 minutos a 4 ° C. </li><li> Resuspender pellets de ARN en solución tampón de lisis y precipitado con etanol por segunda vez. </li><li> Por último, volver a suspender el ARN en una solución que contenía 10 mM de acetato tamponado (pH 4,5) y 1 mM EDTA para su posterior tratamiento. La muestra puede ser almacenada de forma estable a -80 ° C durante unas dos semanas. Un almacenamiento más prolongado, no se recomienda ya que algunos tRNA cargado comenzará a deacylate. </li></ol> Parte 2: Preparación de las normas tRNA <ol><li> Calor E. coli normas tRNA en 10,5 M a 85 ° C en 45 mM Tris-Cl pH 7,5 durante 2 minutos. Tome el tubo y dejar a temperatura ambiente durante 3 minutos. </li><li> Añadir MgCl2 a una concentración final de 20 mM y se incuba a 37 ° C durante 5 minutos. </li><li> Añadir la mezcla de reacción sintetasa por lo que la reacción final contiene 5 M tRNA, 60 mM Tris-HCl (pH 7,5), 12,5 mM de MgCl2, 10 mM KCl, 3 mM ditiotreitol, 1,5 mM de ATP, 1 mM espermina, 1 mM de los respectivos aminoácidos, y las unidades de 4,2 / l E. coli aminoacil-tRNA-sintetasa mezcla. Se incuba a 37 ° C durante 15 minutos. </li><li> Añadir un volumen equivalente de 0,5 M de acetato de buffer (pH 4.5) y extraer con acetato de fenol saturado / CHCl 3 a pH 4,5. </li><li> Precipitar las normas tRNA con volúmenes de 2.7x de etanol y centrifugación a 18.600 RFC durante 30 minutos a 4 ° C. </li><li> Volver a suspender las normas en acetato 50 mM tampón (pH 4,5) con 1 mM EDTA y almacenar a -80 ° C durante un máximo de un mes. </li></ol> Parte 3: Cy3/Cy5 etiquetado de los tRNA <ol><li> Para la muestra se incuba tRNA cargado ARN total a una concentración de 0,1 mg / ml con 0,066 M de cada E. coli tRNA normas (es decir, 0,67 pmoles de cada estándar por g de ARN total) y 100 mM de acetato tamponado (pH 4,5) en presencia de 50 mM NaIO4 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Para el control del uso total de la muestra tRNA 50 mM de NaCl en lugar de NaIO4. Recuerde que para diluir el ARN sólo con las soluciones tampón para conservar la carga. </li><li> Para detener la reacción añadir glucosa a 100 mM e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. </li><li> Con el fin de eliminar cualquier resto de NaIO4 de la muestra de realizar un intercambio de buffer usando una columna de centrifugación G25. Para obtener los mejores resultados de la primera columna se equilibre mediante la ejecución de 200 mM tampón tampón de acetato (pH 4,5) a través de él antes de aplicar la muestra. </li><li> Precipitar la muestra mediante la adición de acetato de buffer (pH 4.5) a una concentración final de 133 mM y NaCl a una concentración final de 66 mM y el volumen de 2.7x de etanol. De vez en cuando una segunda precipitación puede ser necesaria para las muestras oxidadas. Esto es necesario sólo si la bolita parece significativamente diferente de la pastilla de control de la misma muestra. Por ejemplo, una significativamente mayor o más difusa de pellets. Si una segunda precipitación con etanol es necesario volver a suspender el pellet en 50 mM pH 4,5 y acetato de 200 mM NaCl antes de la adición de etanol. </li><li> Para desacilación las muestras tRNA se resuspendió en 50 mM Tris-HCl (pH 9) y se incuba a 37 ° C durante 30 min. La reacción es neutralizada por la adición de un volumen igual de acetato 50 mM buffer (pH 4.5) y 100 mM NaCl. Precipitado con volúmenes de 2.7x de etanol. Después de la precipitación, el ARN se vuelve a suspender en agua a aproximadamente 1 mg / l. Tanto el control y las muestras oxidadas se debe ejecutar en geles de agarosa para comprobar la calidad del ARN. </li><li> Para colocar etiquetas fluorescentes oligo en el tRNA 0,1 mg / l desacilada ARN se incuba en 1x tampón ligasa, el 15% DMSO, 4 M-Cy3 o Cy5 que contienen oligonucleótidos, unidades de 0,5 / l de ADN ligasa T4, y la levadura de exo-fosfatasa (5.000 unidades / l) a 16 ° C durante la noche (más de 16 h). La exo-fosfatasa es necesaria sólo para las muestras obtenidas de la levadura y se puede omitted si se utiliza este protocolo para E. coli o muestras humanas. </li><li> Después de la ligadura de las muestras se mezclan con 4 volúmenes de 50 mM KOAc (pH 7), 200 mM KCl, y se extrae con un volumen igual de fenol / cloroformo. Tras la extracción de la fase acuosa, preparaciones de ARN se precipitó con etanol y se resuspendió en agua a aproximadamente 0,1 mg / l. </li><li> La eficiencia de la ligadura puede ser evaluado mediante la ejecución de un 5-10% de las muestras en geles de poliacrilamida al 12% con urea 7M y se visualizaron con un escáner de gel fluorescente. Este análisis de página es también útil para determinar la cantidad de oxidación y las muestras de control necesarias para la hibridación de microarrays. El resultado debería mostrar una buena ligadura alrededor del 10% o más de los oligonucleótidos que contienen Cy3/Cy5 se ligó con el tRNA. Para muestras con el etiquetado de eficiencia bueno, 0,1-0,5 mg de ARN total por muestra se utiliza para la hibridación de la matriz. </li></ol> Parte 4: Hibridación y análisis de los microarrays <ol><li> Antes de diapositivas de microarrays de hibridación se hierven en agua destilada durante 1-2 minutos para eliminar los oligonucleótidos no consolidados. </li><li> Cy3/Cy5 muestras etiquetadas se combinan con 140 l de tampón de hibridación de ADN de esperma de salmón a una concentración final de 140 mg / ml y de poli (A) a una concentración final de 70 microgramos / ml. </li><li> Un programa de hibridación, (tabla 1), se ejecuta en una serie de híbridos automática. Para el trabajo de tRNA, es altamente recomendable que una máquina automática de la hibridación se utiliza desde la hibridación manual de fabrica de fondo elevado. </li><li> Después de que el programa se completa manualmente este lavado con solución de lavado 3 por lo menos dos veces agitando suavemente en un tubo cónico de 50 ml durante 3-5 minutos. </li><li> Las diapositivas se pueden secar por centrifugación a baja velocidad, a menos de 200 RFC, durante 5-10 minutos. Es importante mantener las diapositivas de la luz ya la exposición a la luz de lejía los fluoróforos. </li><li> Después de las diapositivas se secan que deben analizarse de inmediato para obtener resultados óptimos, si es necesario se pueden guardar por varios días en un lugar oscuro y seco a temperatura ambiente. Las diapositivas se pueden escanear 2-3 veces sin degradación perceptible en la calidad de imagen. </li></ol> Parte 5: Resultados de Representante Cuando se aíslan adecuadamente el total de la muestra de ARN debe producir un espectro muy limpio, con un 260 OD: OD 280 ratio de cerca de 2. No debe haber ninguna proteína detectable o la contaminación de fenol. Cuando se ejecuta en un 1% en geles de agarosa, una fuerte banda de tRNA deben ser observados con otros posibles bandas de ácidos nucleicos que oscilan entre los organismos. Después de la oxidación de una banda limpia tRNA deben ser observados. Si una muestra es notablemente más débil que otras muestras o manchas que se observa, las muestras no deben ser utilizados para microarrays. Microarrays debe tener de fondo muy bajo, lo que es un orden de magnitud menor que el más débil de la sonda tRNA. De fondo de alta suele ser debido a problemas durante las etapas de lavado. Esto generalmente se puede arreglar mediante la elaboración de nuevas soluciones de lavado y cuidado de lavar todo el equipo y la tubería para eliminar los restos y se precipitó SDS. <table border="1"><tbody><tr><td> Paso </td><td> Detalles </td></tr><tr><td> O-ring acondicionado </td><td> 75 ° C, 2 min </td></tr><tr><td> Introducir la muestra </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> Desnaturalizar la muestra </td><td> 90 ° C, 5 min </td></tr><tr><td> Hibridación </td><td> 60 ° C, 16h </td></tr><tr><td> Lavado 1 </td><td> 50 ° C, 10 segundos de flujo de celebrar 20 años </td></tr><tr><td> Lavado 2 </td><td> 42 ° C, 10 segundos de flujo de celebrar 20 años </td></tr><tr><td> Lavar 3 </td><td> 42 ° C, 10 segundos de flujo de celebrar 20 años </td></tr></tbody></table> Tabla 1: La hibridación de protocolo

<ol><li>Zaborske, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+tRNA+charging+and+activation+of+the+eIF2+kinase+Gcn2p%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p.</a> J Biol Chem. 284 (37), 25254-25267 (2009).</li>
<li>Wek, S. A., Zhu, S., Wek, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histidyl-tRNA+synthetase-related+sequence+in+the+eIF-2+alpha+protein+kinase+GCN2+interacts+with+tRNA+and+is+required+for+activation+in+response+to+starvation+for+different+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The histidyl-tRNA synthetase-related sequence in the eIF-2 alpha protein kinase GCN2 interacts with tRNA and is required for activation in response to starvation for different amino acids.</a> Mol Cell Biol. , 4497-4506 (1995).</li>
<li>Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+Regulation+of+GCN4+and+the+General+Amino+Acid+Control+of+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Translational Regulation of GCN4 and the General Amino Acid Control of Yeast.</a> Annual Review of Microbiology. 59 (1), 407-450 (2005).</li>
<li>Braeken, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+horizons+for+%28p%29ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).</li>
<li>Dong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncharged+tRNA+Activates+GCN2+by+Displacing+the+Protein+Kinase+Moiety+from+a+Bipartite+tRNA-Binding+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Uncharged tRNA Activates GCN2 by Displacing the Protein Kinase Moiety from a Bipartite tRNA-Binding Domain.</a> Molecular Cell. 6 (2), 269-279 (2000).</li>
<li>Cashel, M. The Stringent Response. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCashel%2C+M+%22Escherichia+coli+and+Salmonella%3A+cellular+and+molecular+biology%22">Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology</a>. Neidhardt, F. C. , ASM Press. Washington DC. 1458-1496 (1996).</li>
<li>Dittmar, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino-acid+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation.</a> EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).</li>
<li>Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+tRNA+abundance+and+alteration+of+tRNA+charging+by+bortezomib+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">High levels of tRNA abundance and alteration of tRNA charging by bortezomib in multiple myeloma.</a> Biochem Biophys Res Commun. 385 (2), 160-164 (2009).</li>
</ol>

Se presenta un método para determinar simultáneamente los niveles relativos de carga de todos los tRNAs en la escala genómica. El protocolo que aquí se presenta ha sido optimizado para S. cerevisiae, y también se ha utilizado con éxito para medir los perfiles de tRNA de carga en E. coli y cultivos de células humanas. Puede ser modificado para adaptarse a cualquier organismo con las secuencias genéticas conocidas (que permite la anotación de todos los genes tRNA), siempre y cuando tRNA total con cargo puede ser obtenida.

<table><tbody><tr><td>Columnas Microspin G-25</td><td>GE Healthcare</td><td>25-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA&lt;sup&gt;Phe&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3143</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA&lt;sup&gt;Tyr&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0258</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA&lt;sup&gt;Lys&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6018</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; aminoacil-tRNA sintetasas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3646</td><td></td></tr><tr><td>Ligasa T4 de ADN</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>70042X</td><td></td></tr><tr><td>PerfectHyb Plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-7033</td><td></td></tr><tr><td>Estación Hyb4</td><td>Digilab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escáner GenePix 4000B</td><td>Axon instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GenePix 6.0</td><td>Axon instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

todo el genoma análisis de aminoacilación (de carga) niveles de trna utilizando microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

aminoacilación del tRNA, o de carga, los niveles pueden cambiar con rapidez dentro de una célula en respuesta al medio ambiente [1]. Cambios en el tRNA niveles de carga tanto en las células procariotas y eucariotas llevar a la regulación de traducción que es un importante mecanismo de respuesta al estrés celular. Ejemplos conocidos son la respuesta estrictas en<em&gt; E. coli</em&gt; Y la vía de la tensión GCN2 respuesta en la levadura ([2-6]). Trabajos recientes en<em&gt; E. coli</em&gt; Y<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Han demostrado que los patrones de tRNA de carga son muy dinámico y depende del tipo de estrés experimentado por las células [1, 6, 7]. El altamente dinámico, la naturaleza variable de tRNA de carga hace que sea esencial para determinar los cambios en los niveles de tRNA de carga a escala genómica, con el fin de esclarecer plenamente la respuesta celular a las variaciones ambientales. En esta revisión se presenta un método para medir simultáneamente los niveles relativos de carga de todos los tRNAs en<em&gt; S. cerevisiae</em&gt;. Mientras que el protocolo que aquí se presenta para la levadura, este protocolo se ha aplicado con éxito para determinar los niveles relativos de carga en una amplia variedad de organismos incluyendo<em&gt; E. coli</em&gt; Y cultivos de células humanas [7, 8].

Se describe un método para el análisis de microarrays para determinar los niveles relativos de todos los tRNAs aminoacilación de<em&gt; S. cerivisiae.</em

Todo el genoma análisis de Aminoacilación (de carga) Niveles de tRNA utilizando microarrays

Los niveles de aminoacilación del ARNt, o carga, pueden cambiar rápidamente dentro de una célula en respuesta al entorno[1]. Los cambios en los niveles de carga del ARNt tanto en...

El objetivo general del siguiente experimento es determinar los cambios relativos en los niveles de carga de ARNt. Esto se logra aislando ARN a pH bajo antes y después del tratamiento, con el fin de obtener ARNt con niveles de carga intactos. Como segundo paso, el ARN se somete a un tratamiento de oxidación con peryodato, que permite la determinación de los niveles relativos de carga. A continuación, ligue las muestras a un oligonucleótido fluorescente e híbrideles en un microarreglo para medir los cambios en los niveles de ligación debidos a la carga de A-T-R-N-A; se obtienen los resultados. Los cambios a nivel genómico en la carga de TRNA en CHO basados en la tecnología de microarreglos de TRNA. Hola, soy John Zai del laboratorio del DRT Pan en el departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Chicago.Hoy les mostraré un procedimiento para aislar y medir el ARNt cargado a nivel genómico. Utilizamos este método para medir los cambios en la carga del ARNt durante estímulos de estrés en nuestro laboratorio. Así que comencemos.Para aislar la carga total de ARNt, comience cultivando como mínimo el equivalente de 30 OD 600 de células de levadura, lo que debería producir 30 microgramos de ARN total. Pelote las células en una centrífuga de mesa. Re suspenda las células en una solución de tampón de lisis. Añada un volumen igual de acetato de sodio, fenol cloroformo saturado y vortexee durante 30 segundos, seguido de enfriamiento en hielo durante al menos 30 segundos.Repita la agitación por vórtex y el picado otras dos veces. Centrifugue la muestra a 18.600 RFC durante 15 minutos a cuatro grados Celsius. Luego elimine la capa acuosa y realice otra extracción con fenol cloroformado saturado con acetato tras la segunda extracción.Precipite el ARN añadiendo 2,7 volúmenes de etanol y centrifugando a 18.600 ×g durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Reuspenda los pellet de ARN en solución tampón de lisis y luego precípitese con etanol por segunda vez. Finalmente, re suspenda el ARN en una solución que contenga acetato tampón 10 milimolar y EDTA 1 milimolar para el tratamiento posterior.La muestra se puede almacenar de forma estable a menos 80 grados Celsius durante aproximadamente dos semanas más. No se recomienda el almacenamiento, ya que algunos ARNt cargados comenzarán a desacilarse antes de la marcación con las sondas oligonucleotídicas fluorescentes S3 o SCI cinco. El ARNt total se somete a un tratamiento de oxidación con parahidroximercuribenzoato, que permite la determinación de los niveles relativos de carga. Se mezcla el ARN total con 0,066 micromolar de cada estándar de eco ARNi y acetato tamponado 100 milimolar en presencia de parahidroximercuribenzoato de sodio 50 milimolar. Para la muestra de ARNt control que no será oxidada, se utiliza cloruro de sodio 50 milimolar en lugar del parahidroximercuribenzoato de sodio.Incube las reacciones durante 30 minutos a temperatura ambiente; transcurridos 30 minutos, detenga la reacción agregando glucosa hasta una concentración final de 100 milimolar e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. Una vez detenida la reacción, realice un intercambio de tampón utilizando una columna giratoria G 25 para eliminar todo el prorato de sodio remanente en las muestras. Precipite las muestras agregando acetato tamponado hasta una concentración final de 133 milimolar de cloruro de sodio, hasta una concentración final de 66 milimolar y 2,7 volúmenes de etanol.A continuación, aísle las muestras de ARNt mediante Resus, suspendiéndolas en clorhidrato de tris 50 milimolar e incubando a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Después de 30 minutos, neutralice la reacción añadiendo un volumen igual de acetato tamponado 50 milimolar y cloruro de sodio 100 milimolar, y precipite con 2,7 x volúmenes de etanol. Resuspenda el pellet de ARN en agua a aproximadamente un microgramo por microlitro.Una vez que se haya verificado la calidad del ARN de las muestras control y oxidadas mediante electroforesis en geles de agarosa, se puede proceder con la marcación fluorescente para unir etiquetas oligonucleotídicas fluorescentes al ARNt. Combine 0,1 microgramos por microlitro de ARN con oligonucleótidos que contengan tampón para ligasa, DMSO al 15 %, cuatro micromoles de SI tres o SI cinco, 0,5 unidades por microlitro de ligasa de ADN T4 y fosfatasa de levadura, e incube a 16 grados Celsius durante más de 16 horas. Después de la ligación, mezcle las muestras con cuatro volúmenes de acetato de potasio y cloruro de potasio, y luego extraiga con un volumen igual de fenol-cloroformo. Tras la extracción de la fase acuosa, precipite las preparaciones de ARN con etanol. Finalmente, resuspenda los pellet de ARN en agua hasta una concentración aproximada de 0,1 microgramos por microlitro antes de la hibridación. Sumerja las laminillas para microarreglos y agua destilada durante uno o dos minutos para eliminar los oligonucleótidos no unidos.A continuación, combine las cinco muestras etiquetadas de S3 o SCI con 140 microlitros de tampón de hibridación con ADN de esperma de salmón hasta una concentración final de 140 microgramos por mililitro y poli A hasta una concentración final de siete D microgramos por mililitro, y ejecute un programa de hibridación en un hibridizador automático de matrices. Recomendamos encarecidamente el uso de una máquina automática de hibridación para trabajos con ARNt, ya que la hibridación manual produce un fondo elevado. Cuando finalice el programa de hibridación, lave manualmente las laminillas con la solución de lavado tres agitando suavemente en un tubo cónico de 50 mililitros durante tres a cinco minutos.Lave las laminillas al menos dos veces en tubos previamente envueltos con papel de aluminio. Seque las laminillas centrifugándolas a baja velocidad durante cinco a 10 minutos para obtener resultados óptimos. Las laminillas deben escanearse inmediatamente después de secarse.Las láminas pueden escanearse dos o tres veces sin una degradación notable en la calidad de la imagen. Aquí se muestran resultados representativos de una muestra de ARN total aislada adecuadamente y su análisis. Esta muestra presenta un espectro muy limpio con una relación de OD 260 a OD 280 cercana a 2, sin contaminación detectable de proteínas o fenol cuando se analiza en geles de agarosa al 1%. Tanto las muestras oxidadas como las de control deben mostrar una banda fuerte de ARN, con otras posibles bandas de ácidos nucleicos que varían entre organismos.Si una muestra es notablemente más débil que otras muestras, o si se observa difusión, no se deben utilizar las muestras para microarreglos. Los microarreglos deben tener un fondo muy bajo, que es un orden de magnitud inferior al de la sonda de ARNt más débil. Acabo de mostrarle cómo aislar y determinar los niveles relativos de carga del ARNt al realizar este procedimiento.Es importante recordar mantener sus reactivos libres de nucleasas, especialmente durante los pasos de oxidación y dilatación. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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