Todo el genoma análisis de Aminoacilación (de carga) Niveles de tRNA utilizando microarrays

El objetivo general del siguiente experimento es determinar los cambios relativos en los niveles de carga de ARNt. Esto se logra aislando ARN a pH bajo antes y después del tratamiento, con el fin de obtener ARNt con niveles de carga intactos. Como segundo paso, el ARN se somete a un tratamiento de oxidación con peryodato, que permite la determinación de los niveles relativos de carga.

A continuación, ligue las muestras a un oligonucleótido fluorescente e híbrideles en un microarreglo para medir los cambios en los niveles de ligación debidos a la carga de A-T-R-N-A; se obtienen los resultados. Los cambios a nivel genómico en la carga de TRNA en CHO basados en la tecnología de microarreglos de TRNA. Hola, soy John Zai del laboratorio del DRT Pan en el departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Chicago.

Hoy les mostraré un procedimiento para aislar y medir el ARNt cargado a nivel genómico. Utilizamos este método para medir los cambios en la carga del ARNt durante estímulos de estrés en nuestro laboratorio. Así que comencemos.

Para aislar la carga total de ARNt, comience cultivando como mínimo el equivalente de 30 OD 600 de células de levadura, lo que debería producir 30 microgramos de ARN total. Pelote las células en una centrífuga de mesa. Re suspenda las células en una solución de tampón de lisis. Añada un volumen igual de acetato de sodio, fenol cloroformo saturado y vortexee durante 30 segundos, seguido de enfriamiento en hielo durante al menos 30 segundos.

Repita la agitación por vórtex y el picado otras dos veces. Centrifugue la muestra a 18.600 RFC durante 15 minutos a cuatro grados Celsius. Luego elimine la capa acuosa y realice otra extracción con fenol cloroformado saturado con acetato tras la segunda extracción.

Precipite el ARN añadiendo 2,7 volúmenes de etanol y centrifugando a 18.600 ×g durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Reuspenda los pellet de ARN en solución tampón de lisis y luego precípitese con etanol por segunda vez. Finalmente, re suspenda el ARN en una solución que contenga acetato tampón 10 milimolar y EDTA 1 milimolar para el tratamiento posterior.

La muestra se puede almacenar de forma estable a menos 80 grados Celsius durante aproximadamente dos semanas más. No se recomienda el almacenamiento, ya que algunos ARNt cargados comenzarán a desacilarse antes de la marcación con las sondas oligonucleotídicas fluorescentes S3 o SCI cinco. El ARNt total se somete a un tratamiento de oxidación con parahidroximercuribenzoato, que permite la determinación de los niveles relativos de carga. Se mezcla el ARN total con 0,066 micromolar de cada estándar de eco ARNi y acetato tamponado 100 milimolar en presencia de parahidroximercuribenzoato de sodio 50 milimolar. Para la muestra de ARNt control que no será oxidada, se utiliza cloruro de sodio 50 milimolar en lugar del parahidroximercuribenzoato de sodio.

Incube las reacciones durante 30 minutos a temperatura ambiente; transcurridos 30 minutos, detenga la reacción agregando glucosa hasta una concentración final de 100 milimolar e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. Una vez detenida la reacción, realice un intercambio de tampón utilizando una columna giratoria G 25 para eliminar todo el prorato de sodio remanente en las muestras. Precipite las muestras agregando acetato tamponado hasta una concentración final de 133 milimolar de cloruro de sodio, hasta una concentración final de 66 milimolar y 2,7 volúmenes de etanol.

A continuación, aísle las muestras de ARNt mediante Resus, suspendiéndolas en clorhidrato de tris 50 milimolar e incubando a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Después de 30 minutos, neutralice la reacción añadiendo un volumen igual de acetato tamponado 50 milimolar y cloruro de sodio 100 milimolar, y precipite con 2,7 x volúmenes de etanol. Resuspenda el pellet de ARN en agua a aproximadamente un microgramo por microlitro.

Una vez que se haya verificado la calidad del ARN de las muestras control y oxidadas mediante electroforesis en geles de agarosa, se puede proceder con la marcación fluorescente para unir etiquetas oligonucleotídicas fluorescentes al ARNt. Combine 0,1 microgramos por microlitro de ARN con oligonucleótidos que contengan tampón para ligasa, DMSO al 15 %, cuatro micromoles de SI tres o SI cinco, 0,5 unidades por microlitro de ligasa de ADN T4 y fosfatasa de levadura, e incube a 16 grados Celsius durante más de 16 horas. Después de la ligación, mezcle las muestras con cuatro volúmenes de acetato de potasio y cloruro de potasio, y luego extraiga con un volumen igual de fenol-cloroformo. Tras la extracción de la fase acuosa, precipite las preparaciones de ARN con etanol. Finalmente, resuspenda los pellet de ARN en agua hasta una concentración aproximada de 0,1 microgramos por microlitro antes de la hibridación. Sumerja las laminillas para microarreglos y agua destilada durante uno o dos minutos para eliminar los oligonucleótidos no unidos.

A continuación, combine las cinco muestras etiquetadas de S3 o SCI con 140 microlitros de tampón de hibridación con ADN de esperma de salmón hasta una concentración final de 140 microgramos por mililitro y poli A hasta una concentración final de siete D microgramos por mililitro, y ejecute un programa de hibridación en un hibridizador automático de matrices. Recomendamos encarecidamente el uso de una máquina automática de hibridación para trabajos con ARNt, ya que la hibridación manual produce un fondo elevado. Cuando finalice el programa de hibridación, lave manualmente las laminillas con la solución de lavado tres agitando suavemente en un tubo cónico de 50 mililitros durante tres a cinco minutos.

Lave las laminillas al menos dos veces en tubos previamente envueltos con papel de aluminio. Seque las laminillas centrifugándolas a baja velocidad durante cinco a 10 minutos para obtener resultados óptimos. Las laminillas deben escanearse inmediatamente después de secarse.

Las láminas pueden escanearse dos o tres veces sin una degradación notable en la calidad de la imagen. Aquí se muestran resultados representativos de una muestra de ARN total aislada adecuadamente y su análisis. Esta muestra presenta un espectro muy limpio con una relación de OD 260 a OD 280 cercana a 2, sin contaminación detectable de proteínas o fenol cuando se analiza en geles de agarosa al 1%. Tanto las muestras oxidadas como las de control deben mostrar una banda fuerte de ARN, con otras posibles bandas de ácidos nucleicos que varían entre organismos.

Si una muestra es notablemente más débil que otras muestras, o si se observa difusión, no se deben utilizar las muestras para microarreglos. Los microarreglos deben tener un fondo muy bajo, que es un orden de magnitud inferior al de la sonda de ARNt más débil. Acabo de mostrarle cómo aislar y determinar los niveles relativos de carga del ARNt al realizar este procedimiento.

Es importante recordar mantener sus reactivos libres de nucleasas, especialmente durante los pasos de oxidación y dilatación. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.