Drosophila Ensayo de excavación y tunelización: un método para evaluar la hipoxia tisular en larvas de mosca

- Para montar la jaula de recolección de embriones, utilice placas de agar zumo de uva suplementadas con pasta de levadura fresca y coloque las placas en jaulas que contengan moscas Drosophila macho y hembra del genotipo adecuado. El olor de la levadura y el jugo de uva es atractivo y promueve la puesta de huevos por parte de las hembras. Permita la puesta de huevos durante un período cronometrado. A continuación, retire los adultos e incube las placas embrionarias durante 24 horas para obtener las larvas del primer estadio. Luego, transfiera suavemente algunas larvas individuales del plato de jugo de uva a una placa de prueba de solo agar donde se cortó un agujero en el agar en el centro del plato y se llenó con pasta de levadura.

Las larvas jóvenes deben alimentarse para ganar peso corporal y desarrollarse, por lo que excavan en la fuente de alimento, la pasta de levadura. A medida que se desarrollan, las larvas entran en una fase de deambulación y se alejan de la comida para buscar un sitio para la pupa. Para evaluar la hipoxia, examine los patrones de tunelización que forman las larvas en el sustrato. La falta o insuficiencia de túneles es un signo de privación de oxígeno. En el protocolo de ejemplo, veremos cómo configurar el ensayo de excavación y tunelización.

- Establecer los cruces genéticos de control y experimentales en las placas de puesta de huevos como se describe en el protocolo de texto. Mantenga las moscas en la oscuridad durante al menos dos días antes de comenzar las recolecciones de huevos cronometradas. Para la recolección de huevos cronometrada, transfiera a los adultos a nuevos platos de agar uva decorados con una mancha fresca de pasta de levadura temprano en el día y permita que los adultos pongan huevos en los platos durante cuatro horas. Después de cuatro horas, transfiera a los adultos a platos de agar uva fresca.

A continuación, incube las placas de recolección de cuatro horas durante la noche a 25 grados centígrados. A la tarde siguiente, la mayoría de las larvas habrán eclosionado. Planee tener al menos 50 para cada grupo experimental.

Para una sola ejecución del ensayo, prepare al menos cinco placas de ensayo por grupo experimental. Añadir 16 gramos de agar mosca en 700 mililitros de agua desionizada por calentamiento. Prepare 17,5 mililitros de Nipagen en etanol al 95%. Caliente la solución de agar hasta que se disuelva casi por completo. Luego agregue la solución de Nipagen a la solución de agar y caliente hasta que el agar se disuelva por completo. Enfríe brevemente la solución de agar, luego cargue placas de 10 centímetros con 15 mililitros de la solución de agar. Una vez que el agar se gelifique, coloque tapas en los platos y déjelos secar a temperatura ambiente durante unas horas o toda la noche.

El agar curado debe ser firme al tacto y resistir el desmoronamiento cuando se cortan pedazos. Una vez que el agar se haya curado, use un barrenador de corcho de 1,5 centímetros para hacer un agujero central en el gel de agar en cada placa. A continuación, rellene los agujeros cuidadosamente con pasta de levadura fresca.

Para transferir las larvas a la placa de ensayo, haga una herramienta simple. Dobla una curva en la punta de una microespátula de plástico y sumerge la punta en pasta de levadura para hacerla adhesiva a las larvas. Ahora recoja las primeras larvas del primer estadio individualmente y colóquelas en la placa de agar cerca del montículo de comida. Para cada grupo experimental, prepare al menos cinco platos con 10 larvas cada uno.

Para garantizar la reproducibilidad entre las repeticiones de ensayo, es fundamental que solo se coloquen 10 larvas en cada placa de ensayo. Asegúrese de revisar cuidadosamente la placa de ensayo para determinar que solo se transfiere una larva cada vez que entrega una larva con la punta de la microespátula.

Una vez que la placa esté cargada, etiquétela, cúbrala y luego colóquela en la oscuridad con la tapa hacia arriba a temperatura ambiente. Examine cada placa diariamente hasta que todas las larvas hayan muerto o pupado. A continuación, se muestran ejemplos de placas para una cepa de tipo salvaje desde el segundo día hasta el octavo día del ensayo. En el segundo día, las larvas se entierran en la comida y no se produce ningún túnel. La excavación del túnel comienza el tercer día y alcanza un máximo entre los días cinco y ocho, cuando las larvas dejan de deambular y pupan en sus túneles.

Transfiera con cuidado las pupas con una aguja de burla doblada a un plato de uva y, si lo desea, cuente cuántas pupas contienen. Tome nota de la formación de pupas y evalúe las pupas en busca de anomalías.