Eliminación mecánica de coriones y membranas vitelinas: un método para preparar ovocitos de Drosophila para la observación directa

- Comience con ovocitos maduros de ovarios fijos en una solución salina. Los ovocitos maduros tienen cáscaras de huevo que consisten en un corion externo y una membrana vitelina interna.

Para extraer mecánicamente el corion y la membrana vitelina, coloque los ovocitos entre las partes esmeriladas de dos portaobjetos pretratados. Mueva el portaobjetos superior con movimientos rectos hacia adelante y hacia atrás para crear una fricción que haga rodar los ovocitos.

Ahora, mueve la corredera superior en un ligero ángulo para hacer rodar los ovocitos en otra dirección. Evitando el movimiento circular, aumente este ángulo en incrementos cortos hasta que la corredera superior se mueva perpendicular a la diapositiva inferior. Este movimiento elimina mecánicamente los coriones y las membranas vitelinas, permitiendo el acceso de sondas o tinciones al ovocito.

Los ovocitos sin coriones tendrán un aspecto largo y delgado, y los que no tienen membranas vitelina tendrán los extremos puntiagudos. Para separar los ovocitos aclarados de los desechos circundantes, transfiera la mezcla de muestra a un tubo y permita que los ovocitos se asienten en el fondo mientras los desechos flotan en la parte superior y se pueden eliminar.

En este protocolo, eliminaremos las membranas de corion y vitelina de los ovocitos maduros de Drosophila.

- Para separar los ovocitos en etapa tardía, primero, agregue 1 mililitro de PBSBTx a una placa de disección poco profunda. Luego, use un P200 con una punta recubierta de BSA para transferir los ovarios fijos al plato poco profundo. Pipetear los ovarios hacia arriba y hacia abajo con la punta de pipeta recubierta de BSA para desalojar los ovocitos maduros de los ovocitos menos maduros.

Cuando los ovocitos en etapa tardía estén suficientemente separados, transfiera todo el tejido a un tubo de microfuga de 500 microlitros. Retire el exceso de líquido con una pipeta Pasteur tirada, dejando entre 150 y 200 microlitros en el tubo.

Para preparar el rodado de ovocitos, humedezca previamente un plato de pocillos profundos con 200 microlitros de PBSBTx, cubra el plato y déjelo a un lado.

Obtenga tres portaobjetos de vidrio esmerilado y deje tres portaobjetos a un lado. A continuación, frote suavemente las regiones de vidrio esmerilado de las diapositivas uno y dos. Enjuáguelos con agua desionizada para eliminar los fragmentos de vidrio y séquelos con una toallita desechable. Cubra las regiones esmeriladas de los portaobjetos uno y dos con PBSBTx añadiendo 50 microlitros de PBSBTx a un portaobjetos y frotando esta región con el otro portaobjetos. Retire el líquido con una toallita desechable y coloque los portaobjetos bajo un microscopio de disección. Mantenga las regiones esmeriladas de los portaobjetos uno y dos en contacto con el portaobjetos tres que soporta el portaobjetos dos.

Para hacer rodar los ovocitos, primero humedezca previamente una punta de pipeta P200 en PBSBTx y disperse los ovocitos en el tubo de microfuga pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Transfiera 50 microlitros de líquido que contiene los ovocitos al centro de la parte de vidrio esmerilado de la diapositiva uno. Levante la corredera dos para hacer esto.

Baje lentamente la corredera dos hasta que la tensión superficial del líquido cree un sello entre las dos regiones de vidrio esmerilado. Debe haber suficiente líquido para cubrir el área helada, pero no debe filtrarse nada. Luego, sostenga la corredera inferior en su lugar con una mano y use la otra mano para mover la diapositiva superior dos hacia adelante y hacia atrás en dirección horizontal, manteniendo la diapositiva dos nivelada y apoyada en la diapositiva tres.

Se realiza bajo un microscopio para una fácil visualización de los movimientos y el progreso de los ovocitos. Después de algunos movimientos en la dirección horizontal, cambie ligeramente el ángulo de movimiento. En incrementos múltiples, aumente gradualmente este ángulo a 90 grados hasta que el movimiento de la corredera superior dos sea perpendicular a la dirección inicial. Tenga en cuenta que los coriones vacíos serán visibles en el líquido, y los ovocitos que carecen de coriones aparecerán más largos y delgados.

- Al rodar los ovocitos, asegúrese de que la dirección de rodadura sea siempre en línea recta y nunca en un movimiento circular.

- Repita el rodado de 7 a 10 veces hasta que la solución se vuelva ligeramente turbia. Deja de rodar cuando la mayoría de los ovocitos parecen haber perdido sus membranas vitelinas.

Levante suavemente la diapositiva superior dos, arrastrando una de sus esquinas al centro de la región esmerilada en la diapositiva inferior una para que los ovocitos enrollados se acumulen en el centro de la región esmerilado. Enjuague los ovocitos de ambos portaobjetos con PBSBTx en el plato de pocillos profundos que contiene PBSBTx.

Limpie los portaobjetos uno y dos con agua ultrapura. Secar con una toallita desechable y reiniciar. Repita estos pasos hasta que todos los ovocitos del mismo genotipo hayan rodado. Por lo general, esto requiere de tres a cuatro rondas de laminación por genotipo.

Para eliminar los residuos después de enrollar, agregue 1 mililitro de PBSBTx a un tubo cónico de 15 mililitros. Agita el líquido para cubrir los lados del tubo. Con una punta de pipeta P1000 recubierta de PBSBTx, transfiera los ovocitos enrollados de la placa de pocillos profundos al tubo cónico que contiene 1 mililitro de PBSBTx. Añada 2 mililitros adicionales de PBSBTx al tubo cónico que contiene los ovocitos.

Sostenga el tubo cónico sobre un fondo oscuro para ver los ovocitos opacos a medida que se hunden. Después de dejar que los ovocitos se asienten en el fondo, use un P1000 para eliminar los 2 mililitros superiores de la solución que contiene desechos y deséchelos.

Después de repetir el paso para un total de tres rondas de eliminación de residuos, utilice una punta de pipeta P1000 recubierta de PBSBTx para transferir los ovocitos de vuelta al tubo de microfuga original de 500 microlitros. De 20 a 25 hembras deben producir aproximadamente 50 microlitros de ovocitos maduros enrollados.