Name: Láser microdisección de captura de Drosophila Neuronas periféricas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Aprende a aislar neuronas periféricas de Drosophila mediante microdisección por láser de captura. Este método permite obtener ARN de alta calidad para análisis de expresión génica como qRT-PCR.

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Agradecemos a los Dres. Yuh-Nung Jan y Grueber Wes para proporcionar poblaciones de moscas utilizadas en este estudio, y Virginia Espina, el Dr. Emanuel Petricoin y el Dr. Lance Liotta para obtener ayuda con LCM. Los autores agradecen la F. Thomas y Kate Miller Jeffress Memorial Trust para el apoyo de esta investigación (DNC) y la Universidad George Mason Provost Oficina s (EPRI).

<ol><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li>
<li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+that+regulate+establishment%2C+maintenance%2C+and+remodeling+of+dendritic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Annu. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li>
<li>Wang, X., Starz-Gaiano, M., Bridges, T., Montell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+populations+from+Drosophila+tissues+by+magnetic+bead+sorting%2C+for+use+in+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell populations from Drosophila tissues by magnetic bead sorting, for use in gene expression profiling.</a> Nature Protocols. , (2008).</li>
<li>Iyer, E. P. R., Iyer, S. C., Sulkowski, M. J., Cox, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+Drosophila+peripheral+neurons+by+magnetic+bead+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of Drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting.</a> J Vis Exp. 34, 2912-2917 (2004).</li>
<li>Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A., Tirouvanziam, R., Tirouvanziam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-activated+cell+sorting+%28FACS%29+of+Drosophila+hemocytes+reveals+important+functional+similarities+to+mammalian+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 2912-2917 (2004).</li>
<li>Shigenobu, S., Arita, K., Kitadate, Y., Noda, C., Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+germline+cells+from+Drosophila+embryos+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Isolation of germline cells from Drosophila embryos by flow cytometry.</a> Dev. Growth Differ. 48, 49-57 (2006).</li>
<li>Reeves, N., Posakony, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+programs+activated+by+proneural+proteins+in+the+developing+Drosophila+PNS%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic programs activated by proneural proteins in the developing Drosophila PNS.</a> Dev. Cell. 8, 413-425 (2005).</li>
<li>Jinushi-Nakao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knot%2FCollier+and+Cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knot/Collier and Cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56, 963-978 (2007).</li>
<li>Yang, Z., Edenberg, H. J., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mRNA+from+specific+tissues+of+Drosophila+by+mRNA+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation of mRNA from specific tissues of Drosophila by mRNA tagging.</a> Nucl. Acids Res. 33, (2005).</li>
<li>Appay, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+Gene+Expression+Profiling+of+Human+T+Cell+Subsets+Reveals+Parallel+Post-Thymic+Differentiation+for+CD4%2B+and+CD8%2B+Lineages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sensitive Gene Expression Profiling of Human T Cell Subsets Reveals Parallel Post-Thymic Differentiation for CD4+ and CD8+ Lineages.</a> J. Immunol. 179, 7406-7414 (2007).</li>
<li>Ginzinger, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+quantification+using+real-time+quantitative+PCR%3A+An+emerging+technology+hits+the+mainstream%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Gene quantification using real-time quantitative PCR: An emerging technology hits the mainstream.</a> Exp. Hematol. 30, 503-512 (2002).</li>
<li>Keays, K. M., Owens, G. P., Ritchie, A. M., Gilden, D. H., Burgoon, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+and+single-cell+RT-PCR+without+RNA+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection and single-cell RT-PCR without RNA purification.</a> J. Immunol. Methods. 302, 90-98 (2005).</li>
<li>Volgin, D. V., Swan, J., Kubin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RT-PCR+gene+expression+profiling+of+acutely+dissociated+and+immunocytochemically+identified+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell RT-PCR gene expression profiling of acutely dissociated and immunocytochemically identified central neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 136, 229-236 (2004).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li>
<li>Xiao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+in+embryonic+mouse+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling in embryonic mouse lenses.</a> Mol. Vis. 12, 1692-1698 (2006).</li>
<li>Scharschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+human+osteoarthritic+connective+tissue+by+laser+capture+microdissection+and+QRT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Connect.+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of human osteoarthritic connective tissue by laser capture microdissection and QRT-PCR.</a> Connect. Tissue Res. 48, 316-323 (2007).</li>
<li>Spletter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((regulates+Drosophila+olfactory+projection+neuron+identity+and+targeting+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">regulates Drosophila olfactory projection neuron identity and targeting specificity.</a> Neural Dev. 2, 14-14 (2007).</li>
<li>Hoopfer, E. D., Penton, A., Watts, R. J., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+Drosophila+neuronal+remodeling%3A+a+role+for+the+RNA-binding+protein+Boule+as+a+negative+regulator+of+axon+pruning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of Drosophila neuronal remodeling: a role for the RNA-binding protein Boule as a negative regulator of axon pruning.</a> J. Neurosci. 28, 6092-6103 (2008).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 5199-5204 (2007).</li>
<li>Espina, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Prot%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Nat. Prot. 1, 586-603 (2006).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li>
</ol>

El protocolo presentado en este documento se describe nuestro método optimizado para el aislamiento de las neuronas de Drosophila periféricos a través de LCM. Aunque este protocolo de LCM fue diseñado para el aislamiento específico de neuronas individuales, específicos de la clase o múltiples Drosophila da a partir de la tercera fase estadio larval de desarrollo, modificaciones menores del protocolo podría ser fácilmente adaptado para la captura de otros tipos de células de todo el desarrollo de Dr...

Equipos: <ul><li> Criostato </li><li> Tubo de 50 ml cónicos para la fijación de diapositivas, lavado, tratamiento con tripsina y etanol / deshidratación xileno </li><li> -80 ° C congelador </li><li> Incubadora </li><li> PixCell IIe Instrumento LCM con Fluor 300 óptica de epifluorescencia optimizado para EGFP (Molecular Devices, Molecular Devices) </li></ul>

láser microdisección de captura de drosophila neuronas periféricas

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

La arborización dendrítica (da), las neuronas del sistema de Drosophila nervioso periférico (SNP) proporcionan un excelente sistema modelo en el que investigar los mecanismos moleculares que subyacen a la clase específica de 1,2 morfogénesis dendrita. Para facilitar el análisis molecular de la clase específica de desarrollo da las neuronas, es vital para obtener estas células en una población pura. Aunque una variedad de células, tejidos y técnicas específicas de aislamiento de ARN de las células de Drosophila existen, incluyendo la purificación magnética cordón celular basado en 3,4, fluorescente clasificación de células activadas (FACS) 5-8, y la proteína de unión a ARN estrategias basadas en 9, ninguno de estos métodos se pueden utilizar fácilmente para el aislamiento de una o varias clases específicas de Drosophila neuronas da con un alto grado de precisión espacial. Láser captura microdissection (LCM) se ha convertido en una herramienta extremadamente poderosa que puede ser usado para aislar determinados tipos de células a partir de secciones de tejido con un alto grado de resolución espacial y precisión. ARN obtenido a partir de células aisladas puede ser utilizado para los análisis incluidos QRT-PCR y microarrays de perfiles de expresión en un tipo de célula 10-16. Hasta la fecha, LCM no ha sido ampliamente aplicado en el análisis de los tejidos y las células de Drosophila 17,18, incluyendo las neuronas da en la etapa larval tercer estadio de desarrollo. Aquí les presentamos nuestro protocolo optimizado para el aislamiento de las neuronas de Drosophila da con los rayos infrarrojos (IR) clase de LCM. Este método permite la captura de las neuronas individuales, da clases específicas o múltiples, con una alta especificidad y resolución espacial. La misma edad larvas tercer estadio que expresa una UAS-mCD8:: GFP 19 transgén bajo el control de cualquiera de la clase IV da neurona específica PPK-GAL4 20 driver o el pan-da neurona específica 21-7 21-GAL4 conductor fueron utilizados para estos experimentos. ARN obtenido a partir del aislado neuronas da es de muy alta calidad y se pueden usar directamente para las aplicaciones posteriores, incluida la QRT-PCR o microarrays de análisis. Además, este protocolo de LCM se pueden adaptar fácilmente para capturar otros tipos de células Drosophila una las distintas etapas de desarrollo depende del tipo específico de célula, GAL4 impulsada por el patrón de expresión de GFP.

En este video-artículo se presenta un método para aislar uno o varios<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuronas da a partir de larvas de tercer estadio con la captura de infrarrojos (IR) de la clase Laser Microdisección Captura (LCM). ARN obtenido de las neuronas aisladas puede ser fácilmente utilizada para aplicaciones posteriores como QRT-PCR o microarrays de análisis.

Láser microdisección de captura de Drosophila Neuronas periféricas

Las neuronas de arborización dendrítica (da) del sistema nervioso periférico (SNP) de Drosophila proporcionan un sistema modelo excelente para investigar el...

La MICRODISSECCIÓN LÁSER o LCM ha surgido como una herramienta extremadamente poderosa que puede utilizarse para aislar tipos celulares específicos de secciones de tejido con un alto grado de resolución espacial y precisión. Aquí, la LCM se utiliza para disecar neuronas periféricas de larvas de oph de tercer estadio. Las larvas de tercer estadio se incluyen en un molde criogénico y se congelan, luego se utiliza un criostato para cortar secciones seriadas de tejido, que se colocan sobre portaobjetos, se descongelan y se fijan en etanol al 70 %.A continuación, se incuban las laminillas con tripsina para eliminar los cutículos larvales residuales y se someten a deshidratación mediante un gradiente de etanol y aclarado con xileno. Luego, se coloca un casquete de microdisección láser sobre la sección de tejido y se capturan células neuronales fluorescentes selectivas utilizando un láser pulsado. Finalmente, se aísla el ARN de las células capturadas para aplicaciones posteriores, como análisis de R-T-P-C-R cuantitativa o microarreglos.Hola, soy Dan Cox del Departamento de Biología Molecular y Microbiología y del Instituto Krasnow para Estudios Avanzados en la Universidad George Mason. Ho

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Microdisección láser se aplicó para analizar perfiles de expresión génica en compartimentos específicos de Drosophila disco ala sometida a localizado...

Microdisección láser aplicada a perfiles de expresión génica de subconjunto de las células de la Drosophila Ala Disco

Células neuroprogenitoras Humanos (CPN) se ampliaron en condiciones proliferantes. NPC se diferenciaron en cultivos de neuronas-rica en la presencia de una combinación de neurotrofinas. Marcadores neuronales se detectaron por tinción de inmunofluorescencia. Para aislar una población pura de las neuronas, NPCs se diferenciaron en láminas de membrana PEN y se realizó con láser captura microdissection.

Microdisección de captura por láser de neuronas a partir de células diferenciadas neuroprogenitoras humanas en cultivo

Aquí se describe un protocolo para la manipulación optogenética de la actividad motoneuronal mientras monitoriza los cambios en la salida del motor (contracción muscular) en...

Optogenética perturbación de la actividad neuronal con la iluminación láser en semi-intacta<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas in Motion

Larvas de Drosophila son un sistema modelo atractivo para imágenes en vivo debido a su cutícula translúcida y la genética de gran alcance. Este protocolo describe cómo utilizar un dispositivo de PDMS de una sola capa, llamada el 'chip de larva' para imágenes en vivo de procesos celulares dentro de las neuronas de 3 º estadio las larvas de Drosophila.

El uso de chips de microfluídica para imágenes en vivo y de estudio de las respuestas de lesiones en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

El aislamiento de las neuronas de dopamina individuales o el área tegmental ventral con inmunohistoquímica directa o indirecta se demuestra utilizando láser captura microdissection. Se discuten los parámetros para el aislamiento de tejido de un portaobjetos de vidrio usando un láser de infrarrojos y a partir de diapositivas membrana utilizando la combinación de un láser infrarrojo y ultravioleta.

Microdisección de captura por láser - Una demostración del aislamiento individual de dopamina neuronas y el Área ventral tegmental completo

Aquí ilustramos cómo sola molécula de microscopía de localización foto-activado puede llevarse a cabo en la terminal del nervio motor de un vivo Drosophila melanogaster tercer instar de la larva.

En Vivo Una sola molécula de seguimiento en la Terminal presináptica del nervio Motor del Drosophila

Aquí, describimos el método que empleamos para crear imágenes de filopodia dendrítica altamente móviles en una preparación en vivo del cerebro larvario Drosophila, y el protocolo que desarrollamos para cuantificar conjuntos de datos de imágenes 3D de lapso de tiempo para evaluaciones cuantitativas de la dendrita dinámica en el desarrollo de neuronas.

Imágenes en vivo de lapso de tiempo y cuantificación de la dinámica de ramas dendríticas rápidas en el desarrollo de neuronas drosophila

Describimos un método para el rastreo retrógrado de las neuronas motoras embrionarias Drosophila utilizando colorantes fluorescentes lipofílicos.

Seguimiento retrógrado de las neuronas motoras embrionarias de Drosophila utilizando colorantes fluorescentes lipofílicos

Aquí, presentamos un protocolo detallado para visualizar las redes de microtúbulos en las uniones neuromusculares y las células musculares. Combinado con las potentes herramientas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita enormemente el cribado genético y el análisis de la dinámica de los microtúbulos para determinar el papel de las proteínas reguladoras de la red de microtúbulos en el sistema nervioso.

Uso de la unión neuromuscular de las larvas de Drosophila y células musculares para visualizar la red de microtúbulos

Este protocolo demuestra la ablación celular con láser de neuronas individuales en larvas intactas de Drosophila . El método permite estudiar el efecto de la reducción de la competencia entre neuronas en el sistema nervioso en desarrollo.

La ablación celular con láser en larvas intactas de Drosophila revela una competencia sináptica

Aprende a aislar neuronas periféricas de Drosophila mediante microdisección por láser de captura. Este método permite obtener ARN de alta calidad para análisis de expresión génica como qRT-PCR.

Láser microdisección de captura de Drosophila Neuronas periféricas

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