Name: Láser microdisección de captura de Drosophila Neuronas periféricas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Aprende a aislar neuronas periféricas de Drosophila mediante microdisección por láser de captura. Este método permite obtener ARN de alta calidad para análisis de expresión génica como qRT-PCR.

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Agradecemos a los Dres. Yuh-Nung Jan y Grueber Wes para proporcionar poblaciones de moscas utilizadas en este estudio, y Virginia Espina, el Dr. Emanuel Petricoin y el Dr. Lance Liotta para obtener ayuda con LCM. Los autores agradecen la F. Thomas y Kate Miller Jeffress Memorial Trust para el apoyo de esta investigación (DNC) y la Universidad George Mason Provost Oficina s (EPRI).

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<li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 5199-5204 (2007).</li>
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</ol>

El protocolo presentado en este documento se describe nuestro método optimizado para el aislamiento de las neuronas de Drosophila periféricos a través de LCM. Aunque este protocolo de LCM fue diseñado para el aislamiento específico de neuronas individuales, específicos de la clase o múltiples Drosophila da a partir de la tercera fase estadio larval de desarrollo, modificaciones menores del protocolo podría ser fácilmente adaptado para la captura de otros tipos de células de todo el desarrollo de Dr...

Equipos: <ul><li> Criostato </li><li> Tubo de 50 ml cónicos para la fijación de diapositivas, lavado, tratamiento con tripsina y etanol / deshidratación xileno </li><li> -80 ° C congelador </li><li> Incubadora </li><li> PixCell IIe Instrumento LCM con Fluor 300 óptica de epifluorescencia optimizado para EGFP (Molecular Devices, Molecular Devices) </li></ul>

láser microdisección de captura de drosophila neuronas periféricas

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

La arborización dendrítica (da), las neuronas del sistema de Drosophila nervioso periférico (SNP) proporcionan un excelente sistema modelo en el que investigar los mecanismos moleculares que subyacen a la clase específica de 1,2 morfogénesis dendrita. Para facilitar el análisis molecular de la clase específica de desarrollo da las neuronas, es vital para obtener estas células en una población pura. Aunque una variedad de células, tejidos y técnicas específicas de aislamiento de ARN de las células de Drosophila existen, incluyendo la purificación magnética cordón celular basado en 3,4, fluorescente clasificación de células activadas (FACS) 5-8, y la proteína de unión a ARN estrategias basadas en 9, ninguno de estos métodos se pueden utilizar fácilmente para el aislamiento de una o varias clases específicas de Drosophila neuronas da con un alto grado de precisión espacial. Láser captura microdissection (LCM) se ha convertido en una herramienta extremadamente poderosa que puede ser usado para aislar determinados tipos de células a partir de secciones de tejido con un alto grado de resolución espacial y precisión. ARN obtenido a partir de células aisladas puede ser utilizado para los análisis incluidos QRT-PCR y microarrays de perfiles de expresión en un tipo de célula 10-16. Hasta la fecha, LCM no ha sido ampliamente aplicado en el análisis de los tejidos y las células de Drosophila 17,18, incluyendo las neuronas da en la etapa larval tercer estadio de desarrollo. Aquí les presentamos nuestro protocolo optimizado para el aislamiento de las neuronas de Drosophila da con los rayos infrarrojos (IR) clase de LCM. Este método permite la captura de las neuronas individuales, da clases específicas o múltiples, con una alta especificidad y resolución espacial. La misma edad larvas tercer estadio que expresa una UAS-mCD8:: GFP 19 transgén bajo el control de cualquiera de la clase IV da neurona específica PPK-GAL4 20 driver o el pan-da neurona específica 21-7 21-GAL4 conductor fueron utilizados para estos experimentos. ARN obtenido a partir del aislado neuronas da es de muy alta calidad y se pueden usar directamente para las aplicaciones posteriores, incluida la QRT-PCR o microarrays de análisis. Además, este protocolo de LCM se pueden adaptar fácilmente para capturar otros tipos de células Drosophila una las distintas etapas de desarrollo depende del tipo específico de célula, GAL4 impulsada por el patrón de expresión de GFP.

En este video-artículo se presenta un método para aislar uno o varios<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuronas da a partir de larvas de tercer estadio con la captura de infrarrojos (IR) de la clase Laser Microdisección Captura (LCM). ARN obtenido de las neuronas aisladas puede ser fácilmente utilizada para aplicaciones posteriores como QRT-PCR o microarrays de análisis.

Láser microdisección de captura de Drosophila Neuronas periféricas

Las neuronas de arborización dendrítica (da) del sistema nervioso periférico (SNP) de Drosophila proporcionan un sistema modelo excelente para investigar el...

La MICRODISSECCIÓN LÁSER o LCM ha surgido como una herramienta extremadamente poderosa que puede utilizarse para aislar tipos celulares específicos de secciones de tejido con un alto grado de resolución espacial y precisión. Aquí, la LCM se utiliza para disecar neuronas periféricas de larvas de oph de tercer estadio. Las larvas de tercer estadio se incluyen en un molde criogénico y se congelan, luego se utiliza un criostato para cortar secciones seriadas de tejido, que se colocan sobre portaobjetos, se descongelan y se fijan en etanol al 70 %.A continuación, se incuban las laminillas con tripsina para eliminar los cutículos larvales residuales y se someten a deshidratación mediante un gradiente de etanol y aclarado con xileno. Luego, se coloca un casquete de microdisección láser sobre la sección de tejido y se capturan células neuronales fluorescentes selectivas utilizando un láser pulsado. Finalmente, se aísla el ARN de las células capturadas para aplicaciones posteriores, como análisis de R-T-P-C-R cuantitativa o microarreglos.Hola, soy Dan Cox del Departamento de Biología Molecular y Microbiología y del Instituto Krasnow para Estudios Avanzados en la Universidad George Mason. Hola, soy Ish AER del laboratorio del Dr. Dan Cox. Hoy les mostraremos un procedimiento para el aislamiento celular y la purificación de ARN de neuronas periféricas individuales o múltiples de Drosophila utilizando microdisección láser con captura. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar los mecanismos moleculares que median la morfogénesis de la tasa DIN específica de clase. Así que comencemos. Todos los procedimientos mostrados en este video se llevan a cabo en condiciones estrictamente libres de RNAsis, siguiendo procedimientos estándar.Inicie este protocolo recolectando 30 a 40 larvas adultas de tercera etapa. Lave las larvas con agua doblemente destilada.Lave brevemente para eliminar los ARN, luego lave una vez más con agua doblemente destilada. Para eliminar los ARN, utilice una toallita limpia de kimwipes para absorber completamente cualquier exceso de agua. A continuación, tome un molde limpio para inclusión de tejidos y agregue una capa delgada de OCT.Coloque el molde sobre un bloque de hielo para enfriarlo hasta cero grados Celsius. Utilizando pinzas, coloque las larvas limpias y el OCT frío. La baja temperatura del OCT ayudará a reducir el movimiento larval.Durante el proceso de inclusión, coloque las larvas paralelas entre sí. Una vez dispuestas las larvas, llene lentamente el molde con OCT sin moverlas. A continuación, congele rápidamente.Congele el molde colocándolo sobre hielo seco. Esto asegurará que la larva quede dispuesta a lo largo de un solo plano, lo que maximizará el número de células disponibles por corte. Utilizando un criostato.Corte secciones congeladas de cinco a ocho micrómetros de grosor sobre portaobjetos de vidrio microscópicos sin carga, libres de RNAsas y etiquetados. Almacene los portaobjetos sobre hielo seco y luego transfiéralos a menos 80 grados Celsius hasta que estén listos para la microdisección. Todas las soluciones para deshidratación deben prepararse frescas antes de cada sesión de LCM.La deshidratación completa de secciones de tejido larval congelado es esencial para lograr una eficiencia óptima de microdisección. Retire las laminillas que contienen las secciones de tejido larval congelado del congelador a menos 80 grados Celsius y colóquelas sobre hielo seco. Retire una sola laminilla de la caja de laminillas e inmediatamente colóquela en un tubo cónico de 50 mililitros lleno con etanol al 70 % durante tres a diez segundos.Luego, enjuague el portaobjetos en un tubo cónico de 50 mililitros lleno con agua doblemente destilada libre de RNAsas durante cinco a 10 segundos para eliminar la cutícula de las secciones de tejido, la cual podría interferir con la captura mediante LCM. Pipetee suavemente 50 microlitros de tripsina al 2,5 % directamente sobre la sección de tejido e incube durante cinco a 30 segundos a temperatura ambiente. Enjuague brevemente las secciones en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga agua doblemente destilada libre de RNAsas para eliminar la tripsina y cualquier fragmento suelto de cutícula. Complete el proceso de deshidratación sumergiendo los portaobjetos secuencialmente en las siguientes soluciones.Etanol al 70 %, etanol al 95 %, etanol al 100 %, etanol al 100 %, xileno al 100 %. Y finalmente, una vez más en xileno al 100 %. Tras la deshidratación, seque completamente las laminillas bajo una corriente suave de aire durante 60 a 120 segundos a temperatura ambiente.Si es posible, realice la microdisección en una sala con humedad controlada para evitar cualquier reducción en la eficiencia debida al aumento de la humedad. Primero encienda la alimentación del microscopio y de la caja de control del láser. Cargue las tapas en su ensamblaje de portatapas con tapas H-S-L-C-M.Cada tapa es capaz de capturar numerosos cuerpos celulares. A continuación, abra el software de dispositivos moleculares e ingrese los detalles del experimento, incluidos el número del portaobjetos y los números de lote de las tapas. Coloque el portaobjetos con las secciones de tejido larval sobre la platina del microscopio para la microdisección.Cargue una nueva tapa de LCM térmica desde el cartucho en el instrumento ELCM en la celda P dos y colóquela correctamente con respecto al joystick para asegurar una posición adecuada de la tapa en relación con el área de captura; localice las células marcadas con fluorescencia en las líneas transgénicas reporteras PPK GAL cuatro U-A-S-M-C-D ocho GFP o 21 7 G cuatro UASM CD ocho GFP. Las neuronas sensoriales periféricas, o neuronas DA, con arborización dendrítica pueden identificarse fácilmente mediante la fluorescencia GFP. Para maximizar la especificidad, seleccione células con una señal fluorescente intensa y un mínimo traslape celular.A continuación, ajuste los parámetros de potencia y duración del pulso láser para lograr un punto preciso de polímero fundido cuyo tamaño corresponda al tamaño del punto láser seleccionado para microdiseccionar neuronas DA de clase única. Se recomiendan los siguientes ajustes: diámetro del punto de 7,5 micrómetros, intensidad láser de 30 a 50 milivatios, tiempo láser de dos a cuatro milisegundos y de uno a dos disparos por célula.La configuración del láser puede variar según el tipo de tejido, el grosor del tejido y el tipo de cubierta para MAC utilizado. En última instancia, la configuración del láser requiere pruebas empíricas para obtener resultados óptimos de captura. A continuación, someta el tejido a MAC.Durante la MAC, la cubierta se coloca sobre el área de interés y un láser infrarrojo de baja potencia. Un pulso se dirige a través de la cubierta hacia una fina película de polímero termolábil situada por encima de la célula o células de interés. Cuando se emite el pulso láser, la película se ablanda, se adhiere a las células diana y vuelve a solidificarse con las células de interés unidas a ella.Cuando se levanta la tapa del corte de tejido, la célula o células se microdiseccionan del tejido circundante para capturar más células en un nuevo campo y repetir el proceso. Una vez que se han capturado las células de interés, levante la tapa de LCM y colóquela sobre un portaobjetos limpio para confirmar la presencia de las células capturadas y la ausencia de células no deseadas o restos. Observe la tapa de LCM HS mediante fluorescencia e iluminación con luz transmitida.Coloque la tapa que contiene las células microdiseccionadas en su dispositivo de extracción. A continuación, agregue 12 microlitros de tampón de extracción de ARN sobre la superficie de la tapa y conecte un tubo de reacción invertido de pared delgada como se muestra aquí. Coloque el conjunto sobre una bandeja de alineación y cúbralo con un bloque de incubación precalentado.Luego, coloque la bandeja en un incubador a 42 grados Celsius durante 30 minutos tras la centrifugación de incubación. Centrifugue los tubos que contienen los extractos a 800 veces la gravedad durante dos minutos. Después de retirar los tubos del centrifugador, ciérrelos y almacene los extractos celulares a menos 80 grados Celsius hasta el momento de purificar el extracto de ARN y realizar la purificación por columna del ARN.Según las instrucciones del kit de extracción de ARN pico puro, el tratamiento del ADN es opcional y puede realizarse en columna durante la purificación del ARN según sea necesario. Una vez que el ARN ha sido purificado, almacénelo a menos 80 grados Celsius. Se utilizó microdisección por captura láser para aislar neuronas dopaminérgicas específicas de una sola clase o múltiples de Drosophila a partir de larvas de tercer estadio.La MAC permite un alto grado de precisión y especificidad en el aislamiento de los cuerpos celulares de las neuronas D de Drosophila. Aquí se muestra una imagen representativa de una sección de tejido de ocho micrones deshidratada y tratada con tripsina. Antes de realizar la MAC, dos neuronas DA de clase cuatro están marcadas con GFP.La flecha indica la neurona que se resalta para su captura. El cuerpo celular de la neurona resaltada se microdisecciona limpiamente con alta especificidad a partir de la sección de tejido. El insecto muestra una vista endona de una única neurona DA de clase cuatro capturada en la cubierta de LCM.El ARN total purificado de las neuronas DA aisladas resultó ser de excelente calidad, como lo indica la presencia de picos nítidos de ARN ribosomal 5.8S y 28S al analizarse en un bioanalizador Agilent 2100. Se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real con transcripción inversa del marcador específico de gen neuronal Lev para evaluar el enriquecimiento específico neuronal de las células aisladas mediante el método delta delta CT. Se observó un enriquecimiento superior a 2,5 veces en los niveles de Lev en las neuronas DA capturadas por microdisección láser en comparación con el animal entero.Acabamos de mostrarle cómo aislar y purificar ARN de neuronas Joss o periféricas mediante microdisección láser. Al realizar este procedimiento, es importante optimizar la concentración de tripsina y el tiempo de digestión según el tejido que se vaya a microdiseccionar y el grosor de la sección. Tiempos de incubación más largos pueden provocar la pérdida de las células de interés de las secciones de tejido, mientras que un tiempo de incubación corto puede ser insuficiente para eliminar la cutícula larval, lo que resulta en una microdisección láser ineficaz.Es importante que todas las soluciones de deshidratación de tejidos se preparen frescas. Asimismo, para evitar daños al polímero de la cubierta de microdisección láser, el xileno debe evaporarse por completo antes de la microdisección láser. Finalmente, para preservar la integridad del ARN de las células purificadas, es esencial mantener condiciones libres de ARNasas durante todo el procedimiento.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Aquí, presentamos un protocolo detallado para visualizar las redes de microtúbulos en las uniones neuromusculares y las células musculares. Combinado con las potentes herramientas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita enormemente el cribado genético y el análisis de la dinámica de los microtúbulos para determinar el papel de las proteínas reguladoras de la red de microtúbulos en el sistema nervioso.

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Este protocolo demuestra la ablación celular con láser de neuronas individuales en larvas intactas de Drosophila . El método permite estudiar el efecto de la reducción de la competencia entre neuronas en el sistema nervioso en desarrollo.

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Aprende a aislar neuronas periféricas de Drosophila mediante microdisección por láser de captura. Este método permite obtener ARN de alta calidad para análisis de expresión génica como qRT-PCR.

Láser microdisección de captura de Drosophila Neuronas periféricas

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