Cribado de toxicidad química basada en embriones: evaluación de los efectos en el desarrollo de embriones de pez cebra

- Comience agregando 5 embriones en medio E3 a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y elimine el exceso de medio con una pipeta. Agregue medio E3 que contenga kanamicina en cada pocillo para evitar la contaminación. Deja que los embriones crezcan a 28 grados centígrados.

Diluir el compuesto de interés con un disolvente adecuado, como el DMSO, para preparar varias concentraciones o dosis, y probar el efecto de cada dosis en los embriones en desarrollo. Una vez que los embriones alcancen la etapa deseada, pipetee cada solución madre en pocillos individuales. Cubra el plato con una tapa y gírelo suavemente para mezclar el contenido. Deje que los embriones en la placa de pocillos crezcan a 28 grados centígrados.

En el momento deseado del desarrollo embrionario, coloque la placa de pocillos bajo un microscopio adecuado para examinar el fenotipo de los embriones. Puede observar fenotipos como pérdida de ojos, retraso en el crecimiento o pérdida de melanocitos en los embriones en desarrollo. En el siguiente protocolo, probaremos una biblioteca de compuestos para inhibidores de moléculas pequeñas del desarrollo del prosencéfalo.

- Las bibliotecas de moléculas pequeñas generalmente se suministran en una placa fuente de 96 pocillos con cada compuesto almacenado en DMSO como un stock de 10 milimolares. Aproximadamente 60 minutos antes de que los embriones alcancen la etapa deseada, descongele un número apropiado de placas de 96 pocillos que contengan alícuotas de moléculas pequeñas. Tome nota del número de serie u otro número de identificación de las placas de origen. Para minimizar la condensación en las placas, descongele en una cámara de desecación que contenga drierita.

Gire brevemente las placas en una centrífuga de mesa equipada con un adaptador de placa de pocillos múltiples. Retire la cinta de sellado de aluminio de la placa de origen. Con una pipeta de 12 canales, diluya los compuestos en la placa fuente hasta la concentración deseada con DMSO. En este protocolo, utilizamos una concentración final de 0,5 milimolares y añadimos 4,75 microlitros de DMSO para diluir la placa de culata de 10 milimolares.

Cuando los embriones en la placa de 96 pocillos alcancen la etapa deseada, use una pipeta de 12 canales para transferir 2,5 microlitros de compuestos de las placas de origen a las placas receptoras que contienen los embriones. Cubra las placas que ahora contienen los embriones y los compuestos con tapas y registre el número de identificación de las placas de origen en las placas de embriones. Mezcle las placas girándolas suavemente y colóquelas en una incubadora a 28,5 grados centígrados. Cubra cada placa fuente que contenga moléculas pequeñas sin usar con cinta de sellado de aluminio y colóquela en un congelador a menos 80 grados Celsius para almacenamiento a largo plazo.

Antes de realizar el cribado visual, formule un criterio de acierto específico. Por ejemplo, en una prueba de detección de inhibidores de moléculas pequeñas del desarrollo del prosencéfalo, un golpe puede ser un compuesto que confiere la pérdida del prosencéfalo. La ausencia de ojos es un indicador visual fácil de la pérdida del prosencéfalo y no requiere fluorescencia para su análisis.

En los momentos deseados del desarrollo, retire de la incubadora las placas de 96 pocillos que contienen embriones tratados con compuestos y examine cada pocillo bajo un microscopio estereoscópico. Al detectar inhibidores de moléculas pequeñas del desarrollo del prosencéfalo, examine las placas a las 28 horas para detectar la pérdida del ojo como marcador de inhibición del desarrollo del prosencéfalo. Registre la identidad de la placa y la ubicación del pocillo para cualquier pocillo en el que al menos 3 de 5 embriones exhiban el fenotipo de golpe prescrito.

Vuelva a colocar la placa de 96 pocillos en la incubadora. Reconfirmar la pérdida de ojos y prosencéfalo a las 48 horas. A pesar de que los embriones no tendrán un prosencéfalo, sobrevivirán al menos cuatro días. Vuelva a confirmar un posible golpe volviendo a probar los efectos del compuesto en varias dosis. Para cada dosis, se prueban 10 embriones en 0,5 mililitros de medio E3 en un formato de placa de 48 pocillos.

El momento de la adición de compuestos para la repetición de la prueba debe ser idéntico al del cribado original. Un acierto se confirma cuando el fenotipo provocado se reproduce de forma dependiente de la dosis al volver a analizar el compuesto. Por último, identifique el compuesto golpeado de la base de datos de moléculas pequeñas de la biblioteca química.