0 visualizaciones • 3:39 min. • April 30th, 2023
- Disuelva el metronidazol en agua de huevo que contenga DMSO, un solvente, y agregue feniltiourea, que evita la formación de pigmento en los embriones. Transfiera algunas larvas de la edad adecuada a las placas de tratamiento y control. A continuación, agregue la concentración deseada de la solución de metronidazol a la placa de prueba y agua de huevo que contenga DMSO a la placa de control.
Deje que las larvas de ambas placas crezcan a 28 grados centígrados. Las larvas transgénicas producen nitroreductasa solo en los hepatocitos, lo que convierte el metronidazol en un fármaco citotóxico, lo que resulta en la muerte de los hepatocitos objetivo. Después del tratamiento, retire la solución de metronidazol de la placa de tratamiento y lave los embriones con agua de huevo.
Agregue tricaína para anestesiar las larvas y examínelas bajo un microscopio de epifluorescencia para la ablación grave de hepatocitos, la destrucción de las células hepáticas. Observará un hígado mucho más pequeño en los individuos tratados que en los individuos del grupo de control. En el protocolo de ejemplo, utilizaremos metronidazol para la ablación de hepatocitos en larvas de pez cebra transgénicas para estudiar la regeneración hepática.
- Transfiera hasta 100 embriones a una placa de Petri de 100 milímetros que contenga 25 mililitros de agua de huevo y coloque la placa a 28 grados centígrados. Para inhibir la pigmentación, agregue PTU al cultivo hasta 10 horas después de la fertilización. A las 80 horas después de la fertilización, anestesiar las larvas con tricaína y usar un microscopio de epifluorescencia para recolectar las larvas positivas para CFP, manteniendo solo los animales con hígados de tamaño similar
A continuación, sustituya el agua de huevo tricaína por agua de huevo fresca suplementada con PTU y devuelva las larvas de pez cebra positivas para CFP a la incubadora a 28 grados centígrados. Para tratar las larvas de pez cebra con MTZ, primero, divida el número apropiado de larvas en dos recipientes de cultivo diferentes. Mantener el grupo de larvas experimentales en una solución de MTZ recién preparado y el grupo de control en agua de huevo suplementada con DMSO.
Cubra el grupo experimental con papel de aluminio para evitar la fotoinactivación de la MTZ e incube ambos grupos de larvas de pez cebra a 28 grados centígrados. Al final del período de ablación, retire la solución de MTZ de las placas y lave las lavas tratadas con MTZ dos o tres veces con 25 mililitros de agua de huevo y remolino, desechando el agua de huevo después de cada lavado. Después del último lavado, inmovilizar las larvas con la mitad de la concentración de tricaína utilizada anteriormente para evitar el edema cardíaco y la muerte en las larvas tratadas con MTZ. A continuación, utilice el filtro CFP en un microscopio de epifluorescencia para evaluar los niveles de ablación de los hepatocitos en función del tamaño relativo del hígado de las lavas tratadas con MTZ. Considere el pez cebra con hígados grandes que representan del 0% al 5% de las larvas que no están ablacionadas, aquellos con hígados de tamaño mediano que representan del 10% al 20% de las larvas que se ablacionan parcialmente, y aquellos con hígados muy pequeños que representan del 80% al 90% de las larvas que se ablacionan por completo.