0 visualizaciones • 3:02 min. • April 30th, 2023
- Un enfoque para determinar la función de un gen es reducir su expresión y observar el efecto. Los oligómeros de morfolino se utilizan a menudo en estudios de derribo en peces cebra. Un morfolino es una molécula sintética similar al ADN de alrededor de 25 bases de largo, que inhibe la expresión génica objetivo.
Para el tratamiento con morfolino, coloque un pez anestesiado con una aleta caudal parcialmente amputada en una placa de inyección y coloque la placa bajo un microscopio estereoscópico. Solo inyecte el lado dorsal mientras que el lado ventral no inyectado actúa como control. Los morfolinos pueden funcionar de dos maneras dependiendo de la secuencia a la que se dirigen. En primer lugar, se combinan con el sitio de inicio de la traducción en un ARNm e impiden la síntesis de proteínas al bloquear la traducción.
En segundo lugar, puede unirse a la unión intrón-exón en un pre-ARNm e impedir el empalme adecuado, lo que resulta en una transcripción defectuosa que será degradada por la célula. Más tarde, examina las aletas caudales en busca de excrecencias. Las diferencias entre el rebrote de las regiones tratadas con morfolino y las no tratadas indican que la proteína objetivo desempeña un papel en la regeneración de las aletas. En este protocolo, utilizaremos morfolinos como parte de un ensayo de regeneración de la aleta caudal.
- El día antes de la inyección de morfolino, haga una placa de inyección con agarosa al 2% que tenga una muesca cortada en un extremo del pocillo, lo que ayudará a estabilizar el pez para el procedimiento de inyección. Justo antes de inyectar, diluya el morfolino marcado con fluorosceína en agua libre de ARNasa y ADNasa a la concentración adecuada e incube en un baño de agua a 65 grados centígrados durante cinco minutos. Cargue una aguja de inyección previamente preparada y corte la punta en ángulo.
A continuación, anestesia al pez y colócalo en la placa de inyección. Retire todo el exceso de líquido y coloque la placa en la platina de un microscopio estereoscópico. Oriente la aguja justo distal al radio óseo.
Inserte la aguja suavemente en el tejido regenerativo justo distal a cada radio óseo y empuje distalmente hasta que se localice en el blastema. Cuando la aguja esté correctamente localizada, siga las instrucciones del sistema de microinyección e inyecte una gota de cinco nanolitros del morfolino por inyección. Con cada inyección, se puede ver una borla amarilla de solución de morfolino, que ayuda a localizar la inyección en el blastema. Trabajando dorsalmente desde la línea media, inyecte aproximadamente 75 nanolitros de morfolino por radio óseo en el lado dorsal, dejando el lado ventral como un control de electroporación solamente.