JoVE Encyclopedia of Experiments
Biología
0 vistas • 3:27 min • April 30th, 2023
- Comience con una placa de Petri que contenga embriones en medio E3. Agregue tricaína para anestesiar los embriones y feniltiouria, solución de PTU, para inhibir la formación de pigmento. Con la ayuda de un microscopio de disección, descorionar los embriones.
Utilice una pipeta de vidrio para transferir uno de los embriones decorionados a una pequeña placa de Petri con un pozo de fondo de vidrio poco profundo en el centro y elimine el exceso de medio. A continuación, coloque una solución de agarosa a una concentración óptima para minimizar la distorsión y la motilidad del embrión en un tubo de microfuga y caliéntelo. Bajar la temperatura a 30 grados centígrados para evitar dañar el embrión debido al calor.
Vierta la primera capa de agarosa sobre el embrión, llenando completamente el pozo poco profundo. Coloque otro cubreobjetos sobre el pocillo y agregue un 1% de agarosa encima. La segunda capa mantiene la cubierta de vidrio en su lugar.
Una vez que la agarosa se solidifique, llene la placa de Petri con el medio E3 que contiene tricaína. Esta es la tercera capa y mantiene la agarosa y el embrión hidratados. En el siguiente protocolo, realizaremos el montaje en agar en capas de embriones de pez cebra para obtener imágenes de lapso de tiempo prolongado.
- Justo antes de montar, calienta la solución de agarosa a 65 grados centígrados y luego déjala enfriar a aproximadamente 30 grados centígrados para que el embrión no se vea perjudicado por el calor y añade tricaína a la solución de agarosa. Utilice platos con fondo de vidrio de 35 milímetros con un fondo de vidrio cubierto con el número cero. Coloque suavemente un embrión decorionado con uno de sus lados laterales hacia el fondo de la placa con una pipeta de vidrio o una micropipeta. A continuación, retire con cuidado los restos de E3 con una micropipeta.
Agregue la primera solución de agarosa al pequeño pocillo creado por el cubreobjetos unido al fondo del plato para cubrir el embrión, asegurándose de que la agarosa cubra el pequeño pocillo pero no lo desborde. Cubra el pequeño pocillo con el cubreobjetos para crear un espacio estrecho lleno de agarosa con el embrión entre los dos cubreobjetos. Coloque una capa de solución de agarosa al 1% encima del cubreobjetos en todo el fondo del plato, lo que mantendrá el cubreobjetos en su lugar a medida que se solidifica. A continuación, rellene la porción restante del plato con E3 que contenga un 0,02% de tricaína para mantener el sistema hidratado. Para identificar la concentración óptima de agarosa para la capa uno, monte los embriones en concentraciones crecientes de agarosa y realice imágenes de lapso de tiempo para identificar la concentración que minimice la distorsión y la motilidad del embrión, luego pruebe un rango más fino de concentraciones en función de los resultados.
- El paso más crítico de este protocolo es identificar la concentración óptima de agarosa para la capa uno. Pruebe diferentes concentraciones nano de agarosa, como 0,030%, 0,032%, etc., para encontrar la concentración óptima.