Axotomía láser de dos fotones: un método para dañar los axones en embriones de pez cebra y observar la recuperación axonal

- Colocar los embriones de interés en la solución de fenil tiourea, PTU, Ringer para inhibir la formación de pigmento, que comienza a las 24 horas después de la fertilización. Esto hace que la anatomía en desarrollo sea más visible, lo cual es necesario para este procedimiento. Transferir un embrión anestesiado con tricaína a una cámara de imagen. Coloque un portaobjetos de vidrio en la parte superior y mírelo debajo de su microscopio. Concéntrese en el axón que se va a lesionar, que es visible bajo un láser de 488 nanómetros porque expresa GFP transgenéticamente.

Tome una imagen del antes del sitio. A continuación, observe el axón con un láser de 910 nanómetros que hace que el GFP emita fluorescencia roja. Aumente la intensidad de este láser para lesionar el área objetivo sin afectar el tejido circundante. Este proceso se llama axotomía. Tome una nueva imagen con el primer láser para confirmar la axotomía, que aparece como desechos dispersos. En el siguiente protocolo, realizaremos una axotomía de axones sensoriales periféricos en embriones de pez cebra utilizando un láser de dos fotones.

- Si no dispone de un telescopio de dos fotones hecho a medida en su laboratorio, el microsco