Axotomía láser de dos fotones: un método para dañar los axones en embriones de pez cebra y observar la recuperación axonal

- Colocar los embriones de interés en la solución de fenil tiourea, PTU, Ringer para inhibir la formación de pigmento, que comienza a las 24 horas después de la fertilización. Esto hace que la anatomía en desarrollo sea más visible, lo cual es necesario para este procedimiento. Transferir un embrión anestesiado con tricaína a una cámara de imagen. Coloque un portaobjetos de vidrio en la parte superior y mírelo debajo de su microscopio. Concéntrese en el axón que se va a lesionar, que es visible bajo un láser de 488 nanómetros porque expresa GFP transgenéticamente.

Tome una imagen del antes del sitio. A continuación, observe el axón con un láser de 910 nanómetros que hace que el GFP emita fluorescencia roja. Aumente la intensidad de este láser para lesionar el área objetivo sin afectar el tejido circundante. Este proceso se llama axotomía. Tome una nueva imagen con el primer láser para confirmar la axotomía, que aparece como desechos dispersos. En el siguiente protocolo, realizaremos una axotomía de axones sensoriales periféricos en embriones de pez cebra utilizando un láser de dos fotones.

- Si no dispone de un telescopio de dos fotones hecho a medida en su laboratorio, el microscopio confocal de dos fotones Zeiss 510 también se puede utilizar para cortar axones. Comenzamos colocando el embrión montado en el escenario y enfocándolo con un objetivo de agua 25x. A continuación, encienda los dos láseres de fotón y argón en una configuración multipista para que sea posible cambiar de uno a otro.

Aunque ambos láseres se utilizan para detectar GFP, la emisión de dos fotones se visualiza con rojo y la emisión del láser de argón con verde para diferenciar los dos. Utilice el láser de argón para identificar un axón que se va a lesionar. En Configuración Z, marque la primera y la última sección óptica, tome una imagen confocal y cree una proyección máxima de la pila Z.

Apague el láser de argón y encienda el láser de dos fotones. Escanee a una intensidad de transmisión de aproximadamente el 9% para asegurarse de que el axón todavía esté enfocado. Haga clic en el botón Detener para que la herramienta Recortar esté disponible. Utilice Recortar para acercar el área de interés. Por lo general, hacemos zoom a unos 70x. Elija la región del axón que se va a lesionar y foque esta región. El zoom se puede comprobar en la pestaña Modo.

A continuación, en la pestaña Canales, cambie la intensidad de los dos fotones de aproximadamente el 9% de transmisión a 15% a 30% de transmisión. Para activar la nueva configuración, haga clic en el botón Fast XY y luego haga clic en Detener rápidamente para evitar daños excesivos. El axón debe verse como un residuo disperso si el procedimiento funcionó. Finalmente, para asegurarse de que el axón estaba realmente dañado, vuelva al láser de argón de 488 nanómetros. Tome otra imagen confocal y cree una proyección máxima de las pilas Z.