0 visualizaciones • 3:58 min. • April 30th, 2023
- Coloque dos peces hembra y dos machos en un tanque de cría dividido una noche antes de la inyección. A la mañana siguiente, retire el divisor y deje que los peces se reproduzcan hasta que observe huevos en el fondo del tanque. Recoge los huevos y lávalos con un medio E3 que contenga azul de metileno, un fungicida. Observe los huevos bajo un microscopio y extraiga los huevos no fertilizados. Los huevos no fertilizados tienen una membrana vitelino transparente, mientras que los huevos fertilizados tienen una membrana vitelino oscura.
Mantenga 10 embriones en una placa de Petri separada como controles sin inyectar. Con una pipeta de transferencia, alinee los embriones en el canal de una placa de microinyección a temperatura ambiente y colóquela bajo el microscopio. Empuje suavemente la aguja de microinyección a través del corion hacia la yema e inyecte lentamente un compuesto de interés que contenga un marcador como el rojo de fenol. El flujo citoplasmático permite que el compuesto se difunda en las células embrionarias.
Después de la inyección, cultive los embriones en medio E3 con azul de metileno a 28 grados centígrados. Sigue controlando la salud de los embriones. Retire los embriones muertos o en desarrollo anormal y cambie el medio a diario. En el siguiente protocolo, utilizaremos la microinyección para administrar una ribonucleoproteína, o complejo RNP, en embriones de pez cebra.
- Primero, prepare a los sujetos de pez cebra para la reproducción la noche anterior a realizar las inyecciones como se describe en el protocolo de texto. A continuación, combine la proteína Cas9 y el sgRNA en una proporción de dos a uno. Incubar la solución a temperatura ambiente durante cinco minutos mientras el Cas9 y el sgRNA forman un complejo de ribonucleoproteínas. A continuación, añada 0,5 microlitros de soluciones de rojo de fenol al 2,5% en suficiente agua libre de RNasa para alcanzar un volumen final de cinco microlitros.
Para preparar la aguja de inyección, utilice un extractor de micropipetas para extraer un capilar de vidrio de un milímetro. A continuación, corte la punta de la aguja de vidrio resultante con una cuchilla de afeitar para obtener una abertura en ángulo. Coloque la aguja en un micromanipulador conectado a un microinyector. Con un microscopio óptico, ajuste la presión de inyección hasta que la aguja inyecte constantemente un nanolitro de solución en la placa de Petri.
- Antes de realizar la microinyección de embriones, practique la preparación de agujas e inyecte embriones de control con una solución de solo colorante y registre la supervivencia después de 24 horas de desarrollo. Debería ser capaz de obtener más del 90% de supervivencia en comparación con un control no inyectado.
- A continuación, seleccione de 10 a 15 embriones como población de control y colóquelos en una placa de Petri etiquetada por separado. Con una pipeta de transferencia, alinee cuidadosamente los embriones restantes en una placa de inyección a temperatura ambiente. Bajo un microscopio de disección, inyecte un nanolitro de la solución en el saco vitelino de cada embrión. A continuación, devuelva los embriones inyectados a una placa de Petri etiquetada y cúbralos con 1X E3 medio con azul de metileno. Colocar los embriones inyectados en una incubadora a 28 grados centígrados durante 24 horas. A continuación, inspeccione los embriones inyectados para eliminar los individuos muertos o con un desarrollo anormal.