Encyclopedia of Experiments: Biology
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- ضع سمكتين أنثى وسمكتين ذكريتين في خزان تربية مقسم قبل ليلة واحدة من الحقن. وفي صباح اليوم التالي، أزيل الحاجز ودع السمك يتكاثر حتى تلاحظ البيض في قاع الخزان. اجمع البيض واغسله بوسط E3 يحتوي على الميثيلين الأزرق، ومبيد فطريات.
احتفظ ب 10 أجنة في طبق بيتري منفصل كعناصر تحكم غير مقطعة. باستخدام ماصة نقل، قم بمحاذاة الأجنة في حوض لوحة حقن دقيقة في درجة حرارة الغرفة ووضعها تحت المجهر.
بعد الحقن، قم بزراعة الأجنة في وسط E3 مع أزرق الميثيلين عند 28 درجة مئوية.
- أولا، إعداد مواضيع حمار وحشي لتربية الليلة السابقة لأداء الحقن كما هو موضح في بروتوكول النص. ثم الجمع بين البروتين Cas9 وsgRNA في نسبة اثنين إلى واحد. احتضان الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق في حين أن Cas9 وsgRNA تشكل مجمع ريبونوكليوبروتين.
لإعداد إبرة الحقن، استخدم سحب micropipette لسحب الشعيرات الدموية الزجاجية من عيار ملليمتر واحد.
- قبل إجراء الحقن المجهري للجنين، تدرب على إعداد الإبر وحقن أجنة التحكم باستخدام محلول صبغ فقط وسجل البقاء على قيد الحياة بعد 24 ساعة من التطور.
- بعد ذلك، حدد 10 إلى 15 جنينا كسكان مراقبة ووضعها في طبق بيتري منفصل المسمى. خط بعناية الأجنة المتبقية حتى على لوحة حقن درجة حرارة الغرفة. تحت مجهر تشريح, حقن نانولتر واحد من الحل في كيس صفار كل جنين. ثم إعادة الأجنة المحقونة إلى طبق بيتري المسمى وتغطيتها مع وسائل الإعلام 1X E3 مع الميثيلين الأزرق.
