Respuesta quimiotáctica de los microorganismos marinos a escala micro nutrientes Capas

Hola, me llamo Marcos. Estoy trabajando con el profesor Roman Stalker en Ingeniería Civil y Ambiental del MIT y voy a mostrarles cómo fabricar un microcanal utilizando la técnica de autografía. Para comenzar, debemos diseñar una máscara.

Entonces, esta es la máscara, que es básicamente el diseño final del microcanal que pretendemos realizar. Este es un diseño de un inyector, de modo que podemos crear una capa delgada de nutriente donde colocamos microorganismos nadando alrededor y observamos cómo realizan quimiotaxis, y este es un canal lateral con una cavidad para generar un microvórtice dentro de la cavidad. Habrá un video que lo mostrará más adelante. Después de obtener la máscara, llevamos las obleas a la sala limpia y las colocamos en la placa de Petri. Y ahora nos dirigimos a la sala limpia.

Vale, después de tener nuestra máscara impresa y lista, ahora estamos en la sala limpia para realizar las microfabricaciones reales. Lo que voy a hacer ahora es tomar un trozo de oblea limpia que acabo de comprar y quiero asegurarme de que esté especialmente limpia utilizando los siguientes tres disolventes. El primer paso consiste en limpiar con acetona y luego inmediatamente con metanol.

Y luego, el paso final es el isopropanol. Y estamos trabajando sobre el lado brillante del oblea, que está preparado para el recubrimiento. Ahora lo secaré con aire de nitrógeno.

Después de secar la oblea, ahora la colocamos dentro de un horno apagado a unos 130 °C y la horneamos durante cinco a 10 minutos. Mientras tanto, mientras esperamos el horneado de la oblea, podemos preparar las dos placas calefactoras, una a 165 °C y la otra a 195 °C. Después de hornear durante cinco minutos, sacamos la oblea del horno y la dejamos reposar a temperatura ambiente durante unos cinco minutos.

Luego estamos listos para el recubrimiento por centrifugado. Antes de verter la resina fotosensible, debemos asegurarnos de que no haya partículas de polvo sobre ella; utilizamos nitrógeno para rociarlo sobre la oblea. El movimiento de rociado va desde el centro hacia afuera.

Ahora voy a verter el fotoresistente sobre esta oblea. Vertemos una cantidad de aproximadamente tres mililitros. Traten de colocar el frasco lo más bajo posible para que no se generen burbujas al verter el fotoresistente sobre la oblea.

Dejen ahora que el fotoresistente repose sobre la oblea durante aproximadamente un minuto antes de comenzar a girarlo. Y como mencioné, voy a obtener un recubrimiento de cien micrones de espesor. Por lo tanto, establecemos el tiempo total de centrifugado en 55 segundos y podemos comenzar a girar.

En primer lugar, intentamos aumentar la velocidad de rotación de cero a 500 RPM en cinco segundos y dejarla girar durante unos 10 segundos, de modo que se pueda observar que la resistencia fotosensible recubre completamente la oblea, y luego aumentamos la velocidad hasta 3000 RPM durante aproximadamente siete segundos y la dejamos girar durante 30 segundos. Después de recubrir la oblea con la resistencia fotosensible, ahora coloco la oblea sobre la placa calefactora y la someto a un prehorneado a 65 grados Celsius durante cinco minutos y a 95 grados Celsius durante 20 minutos. Una vez finalizado el prehorneado a 95 grados, la enfriamos hasta la temperatura ambiente, pero antes de eso, la enfriamos nuevamente a 65 grados Celsius durante unos dos o tres minutos para que no se produzca una disminución rápida de la temperatura.

Luego lo colocamos a temperatura ambiente para que se enfríe durante aproximadamente cinco minutos. Ahora voy a exponerlo a la luz UV, de modo que la parte expuesta se endurezca y la parte no expuesta se pueda eliminar por lavado más adelante. Esta es la etapa en la que utilizamos la máscara; como pueden ver, la máscara tiene dos partes: una parte transparente y otra completamente opaca o negra en esta configuración.

Así que voy a colocar esta máscara encima de la oblea recubierta. La máscara que obtienes de la empresa de impresión tiene dos lados. Uno es el lado donde imprimen con tinta.

Y este es un sitio que desea poner en contacto con la oblea. Ahora voy a exponer la oblea a través de la máscara con luz UV. Y por motivos de seguridad, voy a usar estas gafas de seguridad.

La cantidad de tiempo de exposición depende del SUA que esté utilizando y también del espesor que intente lograr. Ahora, después de la exposición, coloco la oblea sobre una placa caliente de 65 grados y la horneo nuevamente durante cinco minutos y luego a 95 grados Celsius durante 20 minutos. Y solo recuerde que este tiempo de horneado varía según el espesor deseado y también según el método que esté utilizando.

A partir de este punto, vamos a revelar la oblea. Revelar significa que eliminamos la parte no deseada del fotoresistente para que solo quede en la oblea la región expuesta. Con el fin de revelar la oblea y lavar la parte no deseada del fotoresistente, utilizamos el revelador.

En este caso, estoy utilizando acetato de pomonal como revelador y voy a verter este disolvente en este vaso de precipitados, colocar la oblea e introducirla en el vaso durante aproximadamente 10 minutos. Nuevamente, el tiempo varía según el espesor y el disolvente que esté utilizando. Ahora, después de 10 minutos, puede observarse que lo que queda en la oblea es el diseño del canal deseado, y toda la porción no deseada ha sido eliminada; solo queda enjuagarlo.

Utilizamos el mismo disolvente, uno nuevo, el mismo acetato de polivinilo, y simplemente lo rociamos sobre la oblea para enjuagarla. Finalmente, para eliminar el disolvente, utilizamos isopropanol y simplemente la enjuagamos. Ahora la secamos con aire de nitrógeno.

Y ahora tiene un oblea limpia con el patrón deseado sobre ella. Y a esto lo llamamos el molde maestro. Ahora regresamos a nuestro laboratorio para verter PDMS sobre él y continuar con el resto del procedimiento.

Ahora regresamos de la sala limpia y tenemos el molde maestro, que es esencialmente el modelo para crear este molde. Lo que haremos a continuación es verter PDMS, que es un polímero, y este se curará. Como pueden ver, si vertemos un polímero sobre este molde, el polímero presentará una ranura y, eventualmente, si lo unimos a un vidrio, el propio polímero formará el canal.

Ahora vamos a preparar el PDMS. Esto es el PDMS, que es el polímero, el poli(dimetilsiloxano) PDMS. Y este es el agente de curado.

Lo que voy a hacer es verter este agente de curado en este vaso y verter este PDMS en este vaso y mezclarlo en una proporción de uno a 10. Por lo general, queremos usar una varilla para mezclarlo de forma homogénea. Al agitar, generamos muchas burbujas, y las burbujas son una especie de indicador que nos dice si ya hemos mezclado o no.

Ahora, después de mezclar el PDMS con el agente de curado, estamos listos para verter esta mezcla sobre el molde maestro, que es una oblea. Y simplemente para asegurarnos de que la oblea no se mueva durante el vertido, la fijamos con cinta adhesiva. Antes de verter la mezcla de PDMS sobre la oblea, queremos tratar de limpiarla lo más posible del polvo que podría haber caído sobre ella.

Así que encendemos el compresor para limpiar la oblea. Bien, pueden ver que el PDMS tiene muchas burbujas. Por lo tanto, vamos a eliminar las burbujas colocando esto dentro de una cámara de vacío.

Por lo tanto, la aspiración tarda aproximadamente 30 minutos en eliminar todas las burbujas. Una vez que hayamos terminado de eliminar las burbujas, retiramos esto y lo colocamos en el horno a 65 grados Celsius, horneándolo durante al menos 12 horas. Y tras transcurridas 12 horas, tendremos la oblea lista para cortar.

Voy a usar este cuchillo para cortar el PDMS y retirar el PDMS del oblea, y luego usaré este punzón para hacer el orificio de las entradas y salidas del tubo. Así que cuando cortes, debes colocar tu cuchillo hasta que toque el oblea, pero no apliques demasiada presión para no romper el oblea, y corta alrededor de tu canal. Ahora, despréndelo.

¿Tiene usted, entonces ahora puede ver que este es el canal, que es el patrón proveniente de la oblea? Así puede ver que son iguales. Y ahora este patrón ha sido grabado en este polímero, este PDMS.

Y una vez que se une esto a un vidrio, esto será el canal para nuestro experimento. El siguiente paso, que es importante, consiste en recordar perforar orificios para poder insertar entradas y salidas en los microcanales después de hacer los orificios en los microcanales del PDMS. Por lo tanto, utilizamos cinta adhesiva para pegarla sobre el lado del canal, es decir, donde está la ranura, y fijarla con cinta.

Y la razón por la que estamos sellando este canal con cinta adhesiva es para eliminar todas las partículas de polvo. Así que el siguiente paso es la unión por plasma. Y antes de la unión por plasma, que realizaremos en otro laboratorio, vamos a retirar la cinta y exponer la superficie que deseamos unir, es decir, esta superficie junto con la lámina de vidrio, y luego exponerla al plasma de oxígeno; posteriormente, las colocaremos juntas y se unirán.

Hola, mi nombre es Justin Seymour y soy investigador posdoctoral en el laboratorio de Roman Stocker en el MIT. Mi investigación se centra en la ecología microbiana, más específicamente en cómo los microorganismos marinos logran encontrar zonas con alimento en el océano. Para estudiar estos patrones, utilizamos técnicas de microfluídica.

Así que vamos a utilizar el canal que Marcus demostró cómo producir anteriormente y después de la unión por plasma. Luego, quedamos libres para usarlo en un experimento de microfluídica. Antes de este experimento, necesitamos preparar los sustratos que vamos a utilizar en el experimento.

Y en el experimento de hoy vamos a observar cómo la fitoplancton marina Donella tur electro es capaz de localizar parches de alimento a microescala. En este caso, se trata de amonio, y le proporcionaremos una concentración de cien micromoles por litro de amonio. Así, en estos experimentos, podemos visualizar los parches de alimento añadiendo un colorante fluorescente a los nutrientes que les proporcionamos.

Así que utilizamos el colorante fluoresceína. Aquí estoy pipeteando fluoresceína hasta una concentración final de 100 micromolar en el amonio, que usamos como nutriente. Luego podemos visualizar ese nutriente mediante microscopía de fluorescencia, lo que nos permite observar cómo un parche de nutrientes se difunde y analizar la respuesta de los organismos a ese parche de nutrientes.

En los experimentos de microfluídica, utilizamos jeringas de vidrio. Por lo tanto, lo primero que queremos hacer es agregar nuestros sustratos y organismos a las jeringas que vamos a utilizar. El siguiente paso consiste en insertar el tubo en el sistema microfluídico.

Y hacemos esto sobre la platina del microscopio. Así, colocamos nuestro canal de microfluídica sobre la platina del microscopio y luego insertamos tubos en las entradas y salidas. A continuación, insertamos un depósito de desecho y nos aseguramos de que el depósito esté lleno hasta la mitad con fluido para que el tubo en el depósito de desecho quede completamente sumergido.

Esto nos permite mantener una presión constante dentro del canal. A continuación, conectamos jeringas al tubo que alimenta el canal de microfluidos que contiene los organismos, que en este caso son donella, lector, y el sustrato nutricional, que en este caso es amonio. Luego preparamos el microscopio y observamos el canal de microfluidos en la posición adecuada antes de comenzar los experimentos.

Una vez que el canal está en posición, cambiamos a la vista del canal mediante la cámara y podemos visualizarlo en la computadora. Ahora podemos realizar ajustes más finos con el enfoque y ya podemos visualizar el inyector del cual inyectamos nutrientes. Este consta de una punta de aguja alambrada de 100 micrómetros integrada en el canal de microfluídica.

Y podemos producir un gradiente de nutrientes inyectándolos. A partir de este momento, antes de comenzar los experimentos, debemos eliminar cualquier burbuja que pueda haber ingresado al sistema de microfluídica. Para ello, utilizamos una jeringa llena de agua de mar artificial en este caso, que podemos conectar al canal de microfluídica mediante una válvula.

Luego empujamos esta jeringa para eliminar las burbujas del canal. Podemos eliminar las burbujas de dos maneras: ya sea forzándolas a salir mediante la presión generada por la jeringa a través de la salida, o también podemos eliminarlas forzándolas a través de las paredes del material PDMS, que es permeable a los gases. Una vez eliminadas las burbujas y cuando estemos listos para comenzar el experimento, establecemos las tasas de flujo adecuadas para la inyección y los materiales en el canal utilizando una bomba de jeringa.

En este caso, utilizamos un caudal de dos microlitros por minuto, lo que equivale a un flujo en el canal de 266 micrómetros por segundo. Una vez que hemos establecido el caudal adecuado, podemos comenzar el experimento iniciando el flujo, lo que crea una banda delgada de nutrientes. Así, podemos visualizar los nutrientes mientras se inyectan en el canal desde el punto de inyección mediante la adición de colorante de fluoresceína a los nutrientes y su observación mediante microscopía de fluorescencia APF. Luego, podemos analizar la dinámica de los parches deteniendo el flujo en el canal de microfluídica y visualizando cómo la banda de nutrientes se difunde lateralmente desde su posición original.

Luego cambiamos a microscopía de contraste de fase para visualizar los organismos nadando dentro del canal y observar sus posiciones en relación con el parche de nutrientes. Podemos hacer esto tomando una secuencia de cuadros a una velocidad de 10 por segundo, lo que produce una película en la que podemos visualizar estos organismos. Luego podemos visualizar los organismos en movimiento tomando las diferencias temporales entre dos cuadros individuales, en los que se resta un cuadro del anterior, de modo que solo se visualicen los objetos en movimiento.

De este modo, podemos eliminar el ruido de fondo de las imágenes. Luego grabamos películas a intervalos regulares durante 10 a 20 minutos después de la liberación inicial del parche de nutrientes. Y mediante el uso de software de análisis de imágenes para superponer las posiciones de los organismos de un cuadro a otro en la secuencia, podemos observar los cambios en la posición de estos organismos para obtener información sobre sus trayectorias de nado, a partir de la cual podemos obtener datos más detallados sobre sus estadísticas de nado, incluyendo velocidades y cambios de dirección.

Así, estos experimentos nos han permitido, por primera vez, examinar directamente cómo los microorganismos marinos son capaces de encontrar y aprovechar parches de nutrientes a escala microscópica. Esto podría tener implicaciones importantes para la dinámica trófica y el ciclo de nutrientes en el océano. Siguiendo lo mencionado por Justin, la forma en que los microorganismos, especialmente las bacterias, interactúan con su alimento en el océano puede tener muchos efectos sobre los ciclos bioquímicos.

Por lo tanto, sin embargo, el océano está, es muy dinámico, y estos aspectos no se han abordado, existiendo muchas condiciones de flujo como la turbulencia, que es generada por el viento o en la superficie. Y a la escala de los microorganismos, lo que ellos perciben, lo que experimentan no es realmente la turbulencia a gran escala, sino el esfuerzo cortante y los restos más pequeños de la turbulencia, conocidos como los remolinos de escala de Kolmogorov. Y lo que estamos tratando de hacer aquí es investigar cómo, qué queremos estudiar, cuáles son los efectos de estos remolinos sobre el comportamiento de agregación de los microorganismos.

Y para hacer eso, estamos creando otro canal usando esta masa que les mostré anteriormente. Y hay una cavidad en el centro. Déjenme simplemente dibujarla para ampliar el diagrama.

Así es como se ve el canal: tenemos esta vista que observamos desde arriba, y se inyecta el flujo desde la izquierda hacia la derecha; debido al esfuerzo cortante, se genera una zona de recirculación dentro de esta cavidad. Esta cavidad representa una gráfica de Addis. Podemos usar exactamente la misma configuración que Justin ya explicó anteriormente: cuando la bomba de jeringa está apagada y no he encendido ningún flujo, se puede ver que las bacterias nadan de forma bastante aleatoria y activa dentro de esta cavidad.

Y no existe ninguna orientación preferida. Y la película que están viendo es una película de diferencia temporal, que es exactamente la misma técnica que está utilizando Justin. Por lo tanto, cuando el flujo es muy rápido, como pueden ver, las bacterias son desplazadas por el vórtice.

Y la trayectoria de las bacterias mismas sigue la línea de corriente del vórtice. Y lo que en realidad es más interesante es lo siguiente, cuando encendemos la bomba de jeringa. Pero la velocidad no es tan rápida.

No es demasiado rápido como para que las bacterias no puedan combatirlo. Pero de alguna manera, aún se puede apreciar claramente un parecido con un vórtice en esta película. Por tanto, a partir de este experimento, hemos aprendido que, en presencia de un flujo muy fuerte y turbulento, las bacterias están a merced del flujo y no pueden oponerse a él.

Sin embargo, en una región de turbulencia leve, aún son capaces de nadar por propia voluntad.