Respuesta quimiotáctica de los microorganismos marinos a escala micro nutrientes Capas

Hola, mi nombre es Marcos. Estoy trabajando con el profesor Roman Stalker en MIT Civil Environmental Engineering y les voy a mostrar cómo hacer un micro canal usando la técnica de autofotografía. Y para empezar, tenemos que diseñar una mascarilla.

Así que esta es la máscara, que es básicamente el diseño final del microcanal que pretendemos hacer. Este es un diseño de un inyector, por lo que podemos hacer una capa delgada de nutriente donde ponemos microorganismos nadando a su alrededor y vemos cómo la quimioterapia cobra, y este es un canal de una cavidad lateral para generar un micro vórtice dentro de la cavidad, que son, habrá un video que lo mostrará más adelante después de obtener una mascarilla, Llevamos las obleas a la sala limpia y las ponemos en la placa de Petri. Y vamos a ir a la sala limpia ahora.

Bien, después de tener nuestra mascarilla impresa y lista, ahora estamos en la sala limpia para hacer las microfabricaciones reales. Y lo que voy a hacer ahora, estoy tomando un pedazo de la oblea limpia que acabo de comprar y solo quiero asegurarme de que esté extra limpia usando los siguientes solventes de árbol. El primer paso es limpiar con acetona y luego inmediatamente con metanol.

Y luego el paso final es el isopropanol. Y estamos trabajando en el lado brillante de la oblea, que está preparado para el recubrimiento. Y ahora voy a secarlo con nitrógeno.

Después de secar la oblea, ahora ponemos la oblea dentro de un horno a unos 130 grados centígrados y la horneamos durante cinco a 10 minutos. Mientras tanto, mientras esperamos la cocción de la oblea, podemos preparar las dos placas calientes, 1 7 65 centígrados y las otras 1 95 centígrados. Entonces, después de hornear durante cinco minutos, sacamos una oblea del horno y la dejamos reposar a temperatura ambiente durante unos cinco minutos.

Y luego estamos listos para el recubrimiento por centrifugado. Antes de verter la fotorresistencia, debemos asegurarnos de que no haya ninguna partícula de polvo encima, usamos nitrógeno para rociarla encima de la oblea. El movimiento de chorro es del centro hacia afuera.

Ahora voy a verter la resistencia fotográfica encima de esta oblea. Echamos la cantidad de unos tres mililitros. Intenta poner la botella lo más baja posible para que no genere burbujas mientras viertes la fotorresistencia encima de la oblea.

Así que ahora deje que la resistencia fotográfica se asiente en la oblea durante aproximadamente un minuto antes de que comencemos a girarla. Y como mencioné, voy a hacer un recubrimiento de cien micras de espesor. Así que establecemos el tiempo total de giro en 55 segundos y podemos comenzar a girar.

En primer lugar, intentamos aumentar la velocidad de giro de cero a 500 RPM en cinco segundos y dejarla girar durante unos 10 segundos para que pueda ver que la fotorresistencia está cubriendo toda la oblea y luego aumentarla a 3000 RPM durante unos siete segundos y dejarla girar durante 30 segundos. Entonces, después de cubrir la oblea con la fotorresistencia, ahora coloco la oblea encima de la placa caliente y la hornearé suavemente a 65 grados centígrados durante cinco minutos y a 95 grados centígrados durante 20 minutos. Una vez que se completa la cocción suave a 95 grados, lo enfriamos a temperatura ambiente, pero antes de eso, lo enfriamos a 65 grados centígrados durante unos dos o tres minutos para que no tenga una disminución rápida de la temperatura.

Y luego lo ponemos a temperatura ambiente para que se enfríe durante unos cinco minutos. Y ahora voy a exponerlo con luz ultravioleta para que la parte que está expuesta se endurezca y la parte que no está expuesta se lave más tarde. Así que esta es la parte en la que usamos la máscara y como puedes ver, la máscara tiene dos partes, la parte donde es transparente y la otra parte que es completamente opaca o negra en esta, en este escenario.

Así que voy a poner esta mascarilla encima de la oblea recubierta. Por lo tanto, la máscara que obtiene de la imprenta tiene dos lados. Uno es aquel con el que imprimen con la tinta.

Y este es un sitio que quieres poner en contacto con la oblea. Ahora voy a exponer la oblea a través de la mascarilla con luz ultravioleta. Y por motivos de seguridad, voy a usar estas gafas de seguridad.

La cantidad de tiempo de exposición depende del SUA que estés utilizando y también del grosor que estés tratando de lograr. Ahora, después de exponer, pongo la oblea en la placa caliente a 65 grados y la horneo nuevamente durante cinco minutos y luego a 95 grados centígrados durante 20 minutos. Y solo recuerde que este tiempo de horneado varía según el grosor deseado y también varía según la forma que esté utilizando.

Siguiendo este punto, vamos a desarrollar la oblea. Revelar significa que eliminamos la parte de la fotorresistencia que no es deseada para que solo quede la región expuesta en la oblea. Para revelar la oblea y lavar la parte no deseada de la fotorresistencia, estamos utilizando el revelador.

En este caso, estoy usando acetato de pomonal como revelador y voy a verter este solvente en este vaso de precipitados y colocar la oblea y sumergirla en el vaso de precipitados durante unos 10 minutos. De nuevo, el tiempo varía en función del grosor y del disolvente que utilices. Ahora, 10 minutos después se puede ver que lo que queda en esta oblea es el diseño del canal que se desea y, y toda la porción no deseada se ha lavado solo para darle un enjuague.

Usamos el mismo solvente, uno nuevo, el mismo acetato de polión, y simplemente rociamos encima de la oblea solo para enjuagarla. Y finalmente, para lavar el solvente, usamos iso propanol y simplemente lo enjuagamos. Y ahora lo secamos con nitrógeno.

Y ahora tienes una oblea limpia con el patrón deseado. Y a esto lo llamamos el maestro. Ahora vamos a volver a nuestro laboratorio para verter PDMS sobre él y continuar con el resto del procedimiento.

Así que ahora estamos de vuelta de la sala limpia y tenemos, tenemos el maestro, que es básicamente el molde para lo que vamos a hacer este molde. Lo que vamos a hacer a continuación es verter PDMS, que es un polímero y va a curar. Como puedes ver, si vertimos un polímero encima de este molde, el polímero tendrá alguna ranura y, finalmente, si nos unimos a una luz de vidrio, ese polímero será el canal.

Así que ahora vamos a preparar el PDMS. Así que este es el PDMS, que es el polímero, el polietileno Sloane PDMS. Y este es un agente de curación.

Lo que voy a hacer es verter este agente de curado en esta taza y voy a verter este PDMS en esta taza y mezclarlo con una proporción de uno a 10. Por lo tanto, generalmente queremos usar un para removerlo de manera homogénea. A medida que removemos, generamos mucha burbuja, y la burbuja es una especie de indicación que nos dice si la hemos removido o no.

Ahora, después de mezclar el PDMS con el agente de curado, estamos listos para verter esta mezcla encima del maestro, que es una oblea. Y solo para asegurarnos de que la oblea no se vaya a ninguna parte durante el vertido, pegamos la oblea con una cinta. Antes de verter la mezcla PDMS sobre la oblea, queremos intentar que la oblea esté lo más limpia posible del polvo que pueda haber caído sobre ella.

Así que encendemos el compresor para desempolvar la oblea. Bien, puedes ver que el PDMS tiene mucha burbuja. Así que vamos a eliminar la burbuja poniéndola dentro de una cámara de vacío.

Por lo tanto, la aspiradora tarda unos 30 minutos en eliminar todas las burbujas. Y una vez que terminamos de quitar las burbujas, sacamos esto y lo metemos en el horno a 65 grados centígrados y lo horneamos durante al menos 12 horas. Y una vez que estemos 12 horas después, tendremos la oblea lista para cortar.

Voy a usar este cuchillo para cortar el PDMS y quitar el PDMS de la oblea y luego usar todo este perforador para perforar el agujero para las entradas y salidas de la tubería. Entonces, cuando cortes, quieres cortar, pon tu cuchillo hasta que golpee la oblea, pero no apliques demasiada presión para que no rompas la oblea y cortes alrededor de tu canal. Ahora quítalo.

¿Tienes?, así que ahora puedes ver que este es el canal, que es el patrón de la oblea. Así que puedes ver que son lo mismo. Y ahora este patrón ha sido grave en este polímero, este PDMS.

Y una vez que se unan a una luz de vidrio, este será el canal para nuestro experimento. El siguiente paso, que es importante, es recordar perforar agujeros para que podamos insertar entradas y salidas en los micro canales después de perforar los agujeros en los micro canales en el PDMS. Así que usamos la cinta adhesiva para pegar en el lado del canal, donde está la ranura y pegarla con cinta adhesiva.

Y la razón por la que estamos pegando este canal con la cinta adhesiva es para eliminar todas las partículas de polvo. Así que el siguiente paso es la unión por plasma. Y antes de la unión del plasma, que vamos a hacer en el otro laboratorio, vamos a quitar la cinta y exponer la superficie que queremos unir, que es esta superficie y el vidrio se deslizan juntos y luego lo exponemos en el plasma de oxígeno y luego, los juntamos y se unirán.

Hola, mi nombre es Justin Seymour y soy investigador postdoctoral en el laboratorio Roman Stockers en el MIT. Y mi investigación se centra en la ecología microbiana, más concretamente en cómo los microbios marinos son capaces de encontrar parches de comida en el océano. Y estamos utilizando técnicas de microfluídica para observar este tipo de patrones.

Así que vamos a usar el canal que Marcus demostró cómo producir antes y después de la unión por plasma. Entonces somos libres de usar esto en un experimento microfluídico. Antes de este experimento, tenemos que preparar los sustratos que vamos a utilizar en el experimento.

Y en el experimento de hoy vamos a ver cómo el fitoplancton marino donella tur electro es capaz de encontrar parches de alimento a microescala. En este caso es amonio y le vamos a proporcionar una concentración de cien micromolares de amonio. Por lo tanto, en estos experimentos, podemos visualizar los parches de comida agregando una tinción fluorescente a los contras de los nutrientes que les proporcionamos.

Así que usamos tinte de fluoresceína. Así que aquí estoy pipeteando fluoresceína a una concentración final de 100 micromolares por el amonio, que usamos como nutriente. Y luego podemos visualizar ese nutriente bajo microscopía de fluorescencia y que nos permite ver cómo se difunde un parche de nutrientes, y luego observar la respuesta de los organismos a ese parche de nutrientes.

Así que en los experimentos de microfluídica, usamos jeringas de vidrio. Así que lo primero que queremos hacer es añadir nuestros sustratos y organismos a las jeringas que vamos a utilizar. El siguiente paso es insertar el tubo en la configuración microfluídica.

Y lo hacemos en la etapa del microscopio. Por lo tanto, colocamos nuestro canal de microfluídica en la platina del microscopio y luego insertamos tubos en las entradas y salidas. A continuación, introducimos un depósito de residuos y nos aseguramos de que el depósito se llene hasta la mitad con fluido para que la tubería del depósito de residuos quede completamente sumergida.

Esto nos permite tener una presión constante dentro del canal. A continuación, conectamos jeringas en el tubo que alimenta el canal microfluídico que contiene los organismos, que en este caso es la donella, el lector, y el sustrato nutritivo, que en este caso es el amonio. A continuación, configuramos el microscopio y observamos el canal de microfluídica en la posición adecuada antes de comenzar los experimentos.

Una vez que el canal está en posición, cambiamos para ver el canal con la cámara y podemos visualizarlo en la computadora. Ahora podemos realizar ajustes más finos con el foco y ahora podemos visualizar el inyector desde el que inyectamos nutrientes. Y esto consiste en una punta de aguja cableada de 100 micrómetros incorporada en el canal de microfluídica.

Y podemos producir un gradiente de nutrientes inyectándolos. A partir de este punto, antes de comenzar los experimentos, debemos eliminar las burbujas que puedan haber entrado en el sistema microfluídico. Y lo hacemos utilizando una jeringa llena de agua de mar artificial en este caso, que podemos conectar al canal de microfluídica a través de una válvula.

Y luego empujamos esta jeringa para eliminar las burbujas del canal. Podemos eliminar las burbujas de una de dos maneras, ya sea forzándolas a salir a través de la presión producida por la jeringa fuera de la salida, o también podemos eliminar las burbujas forzándolas a través de las paredes del material PDMS, que es permeable a los gases. Una vez que se eliminan las burbujas y estamos listos para comenzar el experimento, establecemos los caudales apropiados para la inyección y los materiales en el canal utilizando una bomba de jeringa.

En este caso, utilizamos un caudal de dos microlitros por minuto, lo que equivale a un caudal en el canal de 266 micrómetros por segundo. Una vez que hemos establecido el caudal adecuado, podemos comenzar el experimento comenzando, comenzando el flujo, lo que crea una banda delgada de nutrientes. Por lo tanto, podemos visualizar los nutrientes a medida que se inyectan en el canal desde el punto de inyección agregando tinte de fluoresceína a los nutrientes y visualizándolo bajo microscopía de fluorescencia APF, luego podemos observar la dinámica del parche deteniendo el flujo en el canal de microfluídica y visualizando la banda de nutrientes difundidos lateralmente desde su posición original.

Luego cambiamos a la microscopía de contraste de fase para visualizar los organismos nadando dentro del canal y observando sus posiciones en relación con el parche de nutrientes. Somos capaces de hacer esto tomando una secuencia de fotogramas a una velocidad de fotogramas de 10 por segundo, lo que produce una película en la que podemos visualizar estos organismos. A continuación, podemos visualizar los organismos nadadores tomando las diferencias de tiempo entre dos fotogramas individuales en los que un fotograma se resta del anterior, por lo que se visualizan los únicos objetos en movimiento.

Así podemos eliminar el ruido de fondo de las imágenes. A continuación, grabamos películas a intervalos regulares durante 10 a 20 minutos después de la liberación inicial del parche de nutrientes. Y mediante el uso del software de análisis de imágenes para superponer las posiciones de los organismos de un cuadro de la secuencia a otro, podemos observar los cambios en la posición de estos organismos para obtener información sobre sus trayectorias de natación, a partir de la cual podemos obtener información más detallada sobre sus estadísticas de natación, incluidas las velocidades y los cambios de dirección.

Por lo tanto, estos experimentos nos han permitido, por primera vez, examinar directamente cómo los microbios marinos pueden encontrar y aprovechar los parches de nutrientes a microescala. Esto podría tener implicaciones importantes para la dinámica trófica y el ciclo de nutrientes en el océano. Entonces, siguiendo con lo que mencionó Justin, la forma en que los microorganismos, especialmente las bacterias, interactúan con su comida en el océano puede tener muchos efectos en los ciclos bioquímicos.

Sin embargo, el océano está muy en acero, no se abordan y hay muchas condiciones de flujo, como la turbulencia, que es generada por el viento o la superficie. Y en la escala de los microorganismos, lo que están experimentando no es realmente la gran turbulencia, sino que es la pura y los restos más pequeños de turbulencia se conocen como el gráfico de Coog Eddie. Y lo que estamos tratando de hacer aquí es cómo, lo que queremos estudiar, cuáles son los efectos de este Eddie en el comportamiento asumido de los microorganismos.

Y para hacer eso, estamos haciendo otro canal usando esta masa que les mostré antes. Y hay una cavidad en el centro. Y permítanme dibujarlo para ampliar el diagrama.

Así es como se ve el canal, tenemos una, esta es la vista que vemos desde la parte superior, e inyectamos el flujo de izquierda a derecha y, debido al cizallamiento, genera una región de recirculación dentro de esta cavidad. Y esta cavidad es una representación de un grafo Addis. Podemos usar la misma configuración que Justin ya ha explicado anteriormente cuando la bomba de jeringa está apagada, y no encendí ningún flujo, se puede ver que las bacterias nadan casi al azar y felizmente dentro de esta cavidad de la cavidad.

Y no hay una orientación preferida. Y la película que estás viendo es una película de diferencia de tiempo, que es exactamente la misma técnica que Justin está usando. Entonces, cuando el flujo es muy rápido, como se puede ver, las bacterias están siendo vectorizadas por el vórtice.

Y la trayectoria de las propias bacterias sigue la línea de corriente del vórtice. Y lo que en realidad es más interesante, es lo siguiente cuando encendemos la bomba de jeringa. Pero la velocidad no es tan rápida.

No es demasiado rápido que las bacterias, las bacterias no son capaces de combatirlo. Pero en cierto modo, todavía se puede ver un parecido de vórtice en esta película. Así que de este experimento, hemos aprendido que, en presencia de un grupo muy fuerte, las bacterias turbulentas están a merced del flujo, no son capaces de luchar contra el flujo.

Sin embargo, en una región de turbulencia leve, todavía pueden nadar por su cuenta.