Estimulación ex vivo de células T en el tumor de páncreas: un método para aumentar la producción de citocinas en las células T

- Las células T activadas se trasladan al microambiente del tumor pancreático, donde liberan citocinas como el interferón gamma (IFN gamma) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF alfa), que ayudan a mediar una respuesta antitumoral eficaz. A medida que las citocinas se mueven rápidamente fuera de la célula T, los niveles intracelulares pueden ser indetectables. Por lo tanto, el linfocito T requiere estimulación para aumentar la producción de citoquinas basales para estudiar su papel terapéutico en el tumor.

Comience tomando una suspensión de células tumorales del páncreas del ratón. Ahora, trate las células T presentes en la suspensión celular con un cóctel de estimulación de citoquinas e incube la mezcla durante el tiempo deseado. Este cóctel facilita la liberación de iones de calcio desde el retículo endoplásmico al citoplasma. Los niveles altos de calcio, a su vez, activan ciertos factores de transcripción nuclear, lo que conduce a un aumento en la producción de citocinas en las células T.

A continuación, trate las células con un cóctel de inhibidores del transporte de proteínas e incube el tubo. Este cóctel bloquea el transporte de citocinas desde el retículo endoplásmico hasta el complejo de Golgi, lo que resulta en la acumulación de citocinas dentro de la célula. Por último, teñir las células utilizando marcadores intracelulares adecuados para el análisis de citometría de flujo. En el siguiente protocolo, realizaremos la estimulación de células T para aumentar la concentración intracelular de citoquinas.

- Para comenzar, use fórceps para transferir el tumor a una placa de Petri. Guarde 5 mililitros de medio de digestión en un tubo de 50 mililitros con hielo para evitar que comience la actividad enzimática. Tome una pequeña alícuota de esta solución para cubrir el tumor en la placa de Petri. Use un bisturí estéril y fórceps para cortar el tumor en pedazos pequeños, de aproximadamente menos de 3 milímetros de largo. Raspe los pedazos del tumor en el tubo e invierta suavemente el tubo hasta que todos los pedazos estén sumergidos en el medio de digestión. Transfiera el tubo a un dispositivo de agitación durante 20 minutos a 37 grados centígrados para digerir. Asegúrese de que todas las piezas del tumor estén sumergidas y no pegadas al borde del tubo.

Inmediatamente después del paso de digestión, coloque el tubo en hielo para disminuir la actividad enzimática. Agregue EDTA para lograr una concentración final de 20 milimolares y agite brevemente la muestra para mezclarla con el fin de disminuir aún más la actividad enzimática. Abra el tubo y enjuague cualquier digestión tumoral de la tapa del tubo con medio RPMI fresco. Luego, prepare un colador de 70 micras. Colócalo en un tubo abierto de 50 mililitros con hielo. Humedezca previamente el filtro con medio. Vuelva a suspender las células digeridas y lave los lados del tubo con una tira de 25 mililitros o más. La abertura más ancha de la tira permite que el digesto espeso pase fácilmente.

Transfiera todo el digesto al colador con la tira de 25 mililitros. Tritura el tumor hacia arriba y hacia abajo en la parte superior del filtro con un émbolo de jeringa de 1 mililitro. Lave continuamente las celdas a través del colador con RPMI. Asegúrate de lavar con suficiente fuerza para empujar las celdas. Continúe lavando hasta que todas las células hayan pasado por el colador. Centrifugar el tubo durante cinco minutos a 300 veces g y 4 grados centígrados.

Vuelva a suspender con cuidado el pellet de celda y complete el RPMI, y páselo directamente a través de otro filtro para eliminar cualquier matriz extracelular o grupos de células grandes que no se puedan resuspender adecuadamente. Si no se requiere estimulación, tiñir inmediatamente las células aisladas para el análisis de citometría de flujo o volver a suspenderlas en medio de congelación de DMSO al 10% en FBS y almacenar a menos 80 grados Celsius.

Para realizar la estimulación, primero, cuente las células. Diluir las células en medio completo para lograr una concentración de 2 veces 10 a 6 por 100 microlitros. Coloque 100 microlitros de células en cada pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en U. Añadir 100 microlitros de medio completo que contenga una preparación 2X de PMA e ionomicina. Coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante una hora. A continuación, añada 20 microlitros de una preparación 10X de Brefeldina-A y Monensina y complete el medio para lograr una concentración final de 1,06 micromolares y 2,0 micromolares, respectivamente. Vuelva a colocar la placa en la incubadora durante otras cuatro horas.