Ensayo de formación de esferas: un método in vitro para identificar células madre de cáncer de páncreas y terapias de detección

- El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) contiene un subconjunto de células madre cancerosas (CSC) exclusivamente tumorigénicas. Las CSC son autorrenovables, pluripotentes y capaces de formar tumores. Expresan proteínas antiapoptóticas y también contienen genes multirresistentes, lo que los hace resistentes a la quimioterapia. Para identificar las células madre cancerosas y estudiar el efecto de los fármacos sobre ellas, realizamos un ensayo de formación de esferas.

Primero, suspenda las células madre cancerosas extraídas en el medio de cultivo celular deseado. A continuación, siembre la suspensión celular en una placa de pocillos múltiples e incube durante el tiempo deseado. Agregue una cantidad requerida de medicamento de interés en algunos pocillos y placebo en otros pocillos como control negativo. Incuba las células durante el tiempo deseado. Las células madre cancerosas forman colonias en forma de esfera en un entorno de cultivo no adherente.

Después de la incubación, pipetee una pequeña cantidad de suspensión celular en un hemocitómetro y colóquelo en un contador de células automatizado. Ahora, cuenta el número de esferas formadas. Las células tratadas con fármacos suelen mostrar una reducción sustancial en el tamaño y el número de esferas. En el siguiente protocolo, realizaremos un ensayo de formación de esferas para identificar las células madre del cáncer de páncreas y evaluar el efecto de la metformina.

- Para facilitar la formación de la esfera tumoral para el enriquecimiento de las células madre cancerosas, diluya las células en el volumen adecuado de medio de células madre cancerosas hasta una concentración final de 2 veces 10 a las 3 células por mililitro y enfríelas en hielo durante unos minutos. Luego, después de agregar 500 microlitros de PBS a la primera y última fila de una placa de celdas de fijación ultra baja de 24, vuelva a suspender las celdas con una pipeta y siembre 1 mililitro de celdas por pocillo en los pocillos vacíos de la placa.

Trate cuatro pocillos de células con el fármaco de interés y al menos cuatro pocillos de control negativo con vehículo. A continuación, incubar las células a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante una semana. Cada dos días, agregue tratamiento fresco o vehículo a cada uno de los pozos.

En el día 5 o 7, evalúe el número de esferas tumorales formadas con un contador de células automatizado que permita la identificación de estructuras más grandes. Para el paso en serie de las esferas tumorales, el día 7, use un colador de células de 40 micrómetros para cosechar las esferas. A continuación, gire las esferas e incube en 1 mililitro de tripsina durante 20 minutos a 37 grados centígrados para disociar el pellet en una suspensión de una sola célula. A continuación, expanda las células durante otros siete días, como se acaba de demostrar.