Aislamiento de queratinocitos de piel humana: un método para cultivar queratinocitos primarios a partir de muestras de piel

- Los queratinocitos son las células más prominentes presentes en la epidermis, o la capa más externa de la piel. Se organizan en múltiples capas sobre la dermis, asociadas con otros tipos de células como los melanocitos, las células dendríticas y las células de Merkel.

Para aislar los queratinocitos, comience tomando el tejido epidérmico de la piel humana. A continuación, tratar con un tampón enzimático para la digestión. Las enzimas del tampón degradan las proteínas de la matriz extracelular presentes en el tejido epidérmico, iniciando así la disociación celular. Ahora, agregue un medio adecuado y altere mecánicamente el tejido.

Para liberar las células disociadas en suspensión, filtre la suspensión de células epidérmicas a través de un colador para eliminar cualquier grupo de células o desechos. Centrífuga para peletizar las células epidérmicas y separarlas del sobrenadante que contiene enzimas. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células utilizando un medio de crecimiento de queratinocitos preferido. Cultive las células durante el tiempo deseado.

Durante el cultivo, los medios optimizados enriquecen la expansión de los queratinocitos al promover su crecimiento selectivo sobre los otros tipos de células epidérmicas. En el siguiente protocolo, mostraremos el aislamiento de queratinocitos a partir de tejido de piel humana adulta.

- Recolecte muestras de piel de 10 centímetros por 15 centímetros de voluntarios adultos sanos que se sometan a cirugía plástica. Mantenga la piel fresca transportando las muestras de piel en una caja de espuma de poliestireno que contenga un elemento refrigerante. Si es necesario, almacene la muestra de piel a 4 grados centígrados durante la noche. Con tijeras, bisturíes y pinzas esterilizados, retire la grasa de debajo de la sección de la piel.

Luego, con agujas, abroche la sección de piel sobre una cubierta estéril encima de un plato. Con una gasa seca y esterilizada, limpie la piel. Luego, siga con etanol al 70% en una gasa esterilizada. A continuación, con una cepilladora de pies, corte la capa epidérmica superior de la sección de piel y transfiérala a una placa de Petri de 9 centímetros.

A continuación, añada inmediatamente 25 mililitros de la solución de DPBS/tripsina/glucosa previamente preparada a la placa de Petri. Incubar las muestras a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Con una pipeta, retire la solución de DPBS/tripsina/glucosa de la placa de Petri y agregue 10 mililitros de RPMI-1640 más 2% de FBS para inactivar la tripsina.

Ahora, con dos pinzas, libere las células epidérmicas en el medio raspando y agitando suavemente tanto el compartimento epidérmico como el dérmico de las secciones de piel. Filtre la suspensión de células epidérmicas a través de un filtro metálico y recoja el filtrado en un tubo de 50 mililitros. Agregue las secciones de piel restantes a un tubo de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de RPMI-1640 sin FBS y vórtice durante 10 segundos.

Filtre esta suspensión a través del filtro de metal en un tubo de 50 mililitros que contiene la suspensión de células epidérmicas. Luego, agregue DPBS hasta un volumen total de 50 mililitros. Centrifugar la suspensión celular a 450 x g a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego, retire el sobrenadante y, dependiendo del tamaño del pellet de celda, vuelva a suspender el pellet de celda epidérmica en aproximadamente 10 mililitros de 37 grados Celsius KSFM.

Usando el método de tinción de azul de tripano, cuente las células bajo un microscopio. Luego, a cada matraz de cultivo de 75 centímetros cuadrados, transfiera 8 veces 10 a las sextas celdas junto con 12 mililitros de KSFM de 37 grados centígrados. Agite suavemente los matraces de cultivo para asegurar una distribución uniforme de las células. Incubar los queratinocitos en una incubadora a 37 grados centígrados con 100% de humedad y 5% de CO₂. Cambie el medio después de dos días, y luego, 3 veces por semana.