Cultivo rápido de melanocitos y fibroblastos murinos primarios: aislamiento de melanocitos y fibroblastos de muestras de piel murina completa

- La piel está formada por varias células que pueblan sus diferentes capas. Los melanocitos, las células productoras de melanina, se localizan en la unión epidérmico-dérmica, mientras que los fibroblastos, las células generadoras de tejido conectivo, residen en la dermis.

Para aislar rápidamente los melanocitos y los fibroblastos, comience por tomar el tronco de una cría de ratón sacrificada. Corta la piel ventralmente a lo largo del tronco. Retire la piel que contiene la capa epidérmica y dérmica y pique el tejido en trozos pequeños.

Ahora, trate con un tampón para la digestión que contenga tripsina y enzimas colagenasa que degradan la matriz extracelular, liberando las células en suspensión. Centrífuga para peletizar las células y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en medios de melanocitos y transfiera la suspensión a una placa de pocillos múltiples.

Durante el cultivo, la mayoría de los fibroblastos se adhieren al fondo del pocillo, mientras que los melanocitos y otras células epidérmicas permanecen en suspensión. Aspire las células suspendidas y agregue medios específicos de fibroblastos al cultivo de fibroblastos para promover su crecimiento. Transfiera la suspensión aspirada a un pozo fresco recubierto de colágeno para ayudar a la formación de un cultivo adherente.

Complemente con genética, un antibiótico, y agregue medios frescos de crecimiento de melanocitos. La genética elimina selectivamente los fibroblastos restantes, mientras que el medio promueve el crecimiento de los melanocitos sobre otros tipos de células epidérmicas. En el siguiente protocolo, aislaremos melanocitos y fibroblastos de la piel de cachorros murinos.

- En una cabina de flujo laminar, enrolle brevemente la trompa de cada ratón sacrificado en una placa de Petri estéril que contenga etanol al 70%. Retire el ratón del etanol y colóquelo en una placa de Petri estéril vacía. A continuación, esterilice las tijeras quirúrgicas en etanol al 70%. Use estas tijeras para hacer una incisión en la piel en el lado ventral del tronco, comenzando desde el cuello y continuando hasta la cola. Con pinzas estériles, retire la piel del tronco del ratón y elimine el exceso de tejido adiposo del lado dérmico de la piel.

Coloque la piel, con la dermis hacia abajo, en un plato de 6 pocillos que contenga 3 mililitros de 1x solución antibiótica/antimicótica. Incubar a temperatura ambiente durante 2 a 3 minutos. Luego, encienda el picador de pañuelos y ajuste la configuración a los que se muestran aquí.

- Asegúrese de tener cuidado al instalar la cuchilla picadora de pañuelos y al operar la máquina.

- Transfiera la piel, con la dermis hacia abajo, a una placa picadora de pañuelos estéril y pase la piel completamente a través de la picadora de pañuelos tres veces. Después de esto, transfiera la piel homogeneizada a un tubo cónico estéril de 15 mililitros que contenga 3 mililitros de tampón de digestión cutánea.

Con una micropipeta P1000, mezcle la suspensión resultante pipeteando vigorosamente hacia arriba y hacia abajo de diez a quince veces. Tapar el tubo cónico e incubar la muestra en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 15 minutos, asegurándose de invertir el tubo cada 3 a 5 minutos.

A continuación, centrifugar el tubo en un rotor de cubo oscilante a 750 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos para que las células de la piel se homogeneicen. Utilice una micropipeta P1000 para eliminar lenta y completamente el tampón de digestión de la piel, teniendo cuidado de no alterar el pellet.

- Asegúrate de aspirar todo el tampón de digestión de la piel. Si tiene problemas, lave el pellet celular con 2 a 3 mililitros de medio de melanocitos y repita la centrifugación y elimine el exceso de tampón de digestión de la piel.

- A continuación, vuelva a suspender completamente el pellet de células en 1 mililitro de medio de melanocitos pipeteando hacia arriba y hacia abajo de quince a veinte veces con una pipeta P1000. Transfiera la solución celular resultante gota a gota a un pocillo sin recubrimiento en un plato de 6 pocillos que contenga 1 mililitro de medio de melanocitos. Incubar la piel plateada homogeneizada en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 40 minutos.

Después de esto, transfiera el sobrenadante de cultivo de la placa sin recubrimiento a un pocillo de un plato de 6 pocillos prelavado recubierto de colágeno. Agregue G418 al medio de modo que la concentración final sea de 100 nanogramos por mililitro. Agregue 2 mililitros de medios de fibroblastos a un pocillo de la placa sin recubrir, que ahora contiene fibroblastos adherentes. Incubar ambos cultivos durante la noche en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.

Después de 16 a 24 horas de incubación, aspire por separado los medios y cualquier residuo de cada cultivo. Lave cada plato dos veces, usando 1 mililitro de PBS para cada lavado. A continuación, añada 2 mililitros de medios de melanocitos frescos al cultivo de melanocitos y añada 2 mililitros de medios de fibroblastos frescos al cultivo de fibroblastos.