Name: El destino de la asignación de células estaminales embrionarias humanas mediante la formación de teratoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-01T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprende a diferenciar células estaminales embrionarias humanas in vivo mediante la formación de teratomas bajo la cápsula renal de ratones inmunocomprometidos. Este protocolo permite rastrear el destino celular.

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Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación integral en el Instituto de Medicina Regenerativa de California (RC1-00104), un Servicio de Salud Pública Grant (HL085377) del NHLBI, y un regalo de la Fundación Pollin de HSB

El protocolo escrito a continuación se basa en los parámetros publicados reportados por los autores, con algunas modificaciones. El protocolo se lleva a cabo con la aprobación de la UCSF Cuidado de Animales Institucional y Uso (IACUC) y de células madre de Supervisión de Investigación (SCRO) Comités. I. Cultura de células madre embrionarias humanas (hESCs) <ol><li> HESCs crecer en la norma 6-y (3,5 cm de diámetro, pozos) placas. </li><li> Por lo menos 12 horas antes de pases células de fibroblastos de embriones de ratón de semillas (MEF, obtenido a partir CF1 día E12.5 ratones tiempo-acoplado, irradiados en 1000 Ci) células alimentadoras en placas recubiertas con 1% de gelatina (6,7). MEFs debe ser plateado en la confluencia 50-60%, o 4 x 10 5 células por 3,5 cm de diámetro (véase figura 1). </li><li> Las células de paso cuando las colonias han llegado a la confluencia ~ 70% (Figura 2). </li><li> Al paso de las células, se aspira KSR medio de crecimiento (6) de los pozos y reemplazar con el medio de 0,5 ml que contiene colagenasa IV en KSR a una concentración de 1 mg / ml. </li><li> Incubar las placas con colagenasa IV a 37 ° C / 5% CO 2 durante 5 minutos o hasta que los bordes de las colonias empiezan a levantar de la placa. </li><li> Quitar colagenasa IV de la placa, añadir 0,5 ml de KSR a cada pocillo, y raspar las células de forma manual para eliminar por completo de la placa. </li><li> Recoger la suspensión de células de cada lugar, así, en un tubo cónico de 15 ml, y permiten que las células de resolver por la gravedad durante 5 minutos. </li><li> Eliminar el sobrenadante del tubo, dejando a las células y medianas empresas en un volumen total de ~ 300μl. </li><li> El uso de un 200 l micro-pipeta conjunto a todo volumen, suavidad pipeta de la suspensión de células 5-6 veces para romper las colonias. </li><li> Traiga la suspensión celular a un volumen total de 9 ml por pozo original de las células utilizando un medio de KSR (es decir, si un bien se cosecha, el tubo debe contener 9 ml). Complementar el medio con recombinante humano factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF) a una concentración de 12,5 ng / ml. </li><li> Después de lavar los nuevos pozos que contienen células MEF (ver paso 2) con fosfato de Dulbecco buffer salino (DPBS) para eliminar todo el suero, añadir 3 ml de la suspensión celular a cada pocillo e incubar las placas a 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Cambio de medio KSR con bFGF 24 horas después de su paso, y cada 24-48 horas hasta que las células están listas para pasarse otra vez. </li></ol> II. Preparación de células madre de pellets para injertar <ol><li> A las 24 horas antes del injerto, agregar inhibidor de rock en el medio de KSR a una concentración final de 10μM para aumentar la viabilidad celular (8). Un pocillo de células en la confluencia ~ 70% (5 x 10 5 células) creará dos pastillas, con dos bolitas que se adhieren por cápsula renal. </li><li> Para preparar gránulos de las células para el injerto (9), se incuba la ROCA tratados con inhibidores de la colagenasa IV culturas durante 5 minutos a 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Aspirar la colagenasa IV del pozo y reemplazarlo con un DPBS ml con 10% de penicilina / estreptomicina (penicilina / estreptomicina). </li><li> Raspar manualmente las colonias de la placa, enjuague el bien con un adicional de 1 ml DPBS con penicilina / estreptomicina, y la transferencia de cada alícuota de 1 ml de suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Girar los tubos de microcentrífuga brevemente a 8.000 x g, aspirar el sobrenadante y se resuspenden las pastillas en DPBS 500μl con penicilina / estreptomicina. </li><li> Para ayudar a unir las células en conjunto para el trasplante, añadir 100μl de 1 mg / ml de lectina Phaseolus vulgaris (PHA) en DPBS a cada tubo. </li><li> Se incuban las células / suspensión PHA a temperatura ambiente durante 5 minutos, luego girar durante 2 minutos a 8000 x g. Gire los tubos de 180 º dentro de sus pozos de rotor y girar de nuevo durante 2 minutos a 8000 x g. </li><li> Con cuidado, aspirar el sobrenadante dejando el sedimento intacto. </li><li> Desalojar a los gránulos de las células de los tubos pipeteando suavemente KSR 200μl junto al borde de la pastilla hasta que lentamente se levanta. </li><li> Una vez desalojados, transferir inmediatamente los pellets de 0.4μm inserta Millicell colocados en los pozos de 3,5 cm de diámetro que contiene 3 ml KSR, y se incuba durante 2 horas a la noche a 37 ° C / 5% CO 2. </li></ol> III. Cápsula renal injerto <ol><li> Realizar todos los procedimientos con animales, de acuerdo con las directrices institucionales utilizando una técnica aséptica apropiada. </li><li> Anestesiar a los ratones SCID beige (CB17.Cg-Prkdc scid Lyst bg / Crl), con edades entre 8-12 semanas, utilizando una combinación de O2 inhalado 3% isoflurane/0.5% y tribromoetanol intraperitoneal (Avertin, 25 mg / kg recién preparada). Dos gránulos de las células por ratón será implantada utilizando las técnicas descritas (10). </li><li> Después de colocar el ratón sobre una almohadilla de calefacción para prevenir la hipotermia, afeitar el área de la incisión, y luego desinfectar con clorhexidina. Haga una incisión de 2,5 cm a través de la piel junto al centro, pero en paralelo a la columna vertebral. </li><li> Mantener la humedad del área de la incisión con agua estéril saline, hacer una pequeña incisión a través del músculo, justo debajo de las costillas y ~ 1 cm de la columna vertebral. La incisión debe ser lo suficientemente grande como para sacar el riñón a través de, pero lo suficientemente pequeño que el riñón no se deslice hacia la cavidad abdominal sin fuerza. </li><li> Tire suavemente el riñón a través de la incisión de los músculos con una pipeta Pasteur de vidrio que ha sido puesto en la forma de un gancho romo, ligeramente curvada. </li><li> Mojar el riñón con DPBS estéril para evitar la cápsula se seque. Esto puede ser necesario repetir todo el procedimiento, como la cápsula es muy frágil. </li><li> Utilizando unas pinzas Dumont n º 5, tire suavemente de la cápsula desde el riñón y hacer una incisión de 2 mm con unas tijeras Vannas primavera. </li><li> Con otra pipeta de vidrio que ha sido puesto en una muy fina, la sonda roma, hacer un pequeño hueco entre la cápsula y el riñón. </li><li> Usando una pipeta de gran orificio colocado en una pipeta de transferencia disponibles, tomar una sola célula de pellets a partir de la inserción Millicell. Asegúrese de tomar tan poco los medios de comunicación adicional a lo largo como sea posible, ya que el exceso de material puede interferir con la transferencia de pellets. </li><li> Mientras se mantiene hasta el borde de la incisión para crear el bolsillo, coloque suavemente el pellet al lado de la apertura y empuje en el bolsillo hacia un polo del riñón con la pipeta tiró. </li><li> Repita el proceso con una segunda pastilla. Lugar esta bajo la cápsula del riñón mismo, pero hacia el polo opuesto. </li><li> Con cuidado, coloque la cápsula de vuelta a las pastillas. Los gránulos deben permanecer dentro de la bolsa, y no las suturas son necesarias para cerrar la cápsula. </li><li> Empuje suavemente el riñón en la cavidad abdominal y cierre de la pared muscular con suturas de seda 4-0 (o menor) con adjuntos inversa corte aguja. La incisión debe ser lo suficientemente pequeño que sólo una única sutura es necesario. </li><li> Cerca de la piel con una serie de 4-5 puntos sueltos, utilizando el mismo material de sutura. </li><li> Antes de colocar el ratón de nuevo en su jaula, administrar 0,05 mg / kg de buprenorfina (11,12) y 5 mg / kg de ketoprofeno (12,13) ​​como analgésico a corto plazo y largo plazo, respectivamente. Sustancias controladas sólo se utiliza de acuerdo con las directrices institucionales. </li><li> La transferencia de los animales de vuelta a su jaula y se permite que se recupere de la anestesia en una manta eléctrica. Esto debe tomar alrededor de 20-30 minutos. </li><li> Una vez que el ratón es totalmente ambulatoria, que pueden ser devueltos a las instalaciones de alojamiento de los animales. </li></ol> IV. Cosecha teratoma, la fijación y seccionamiento <ol><li> En 8-12 semanas después de la cirugía, debe haber un teratoma apenas palpable cerca del riñón. Grandes, quistes llenos de líquido a menudo se desarrollan, así, a partir de las 6-8 semanas. Estos pueden requerir una cosecha más temprana si causan trastornos a los animales. Desde teratomas creciendo a un ritmo más lento que los quistes, sin embargo, tendrá que esperar el mayor tiempo posible para obtener un teratoma de tamaño suficiente para el análisis (es decir, por lo menos 8 semanas). </li><li> Extirpar el riñón, el teratoma, y ​​cualquier quiste rodea como un bloque de tejido de la cavidad abdominal utilizando el mismo método quirúrgico mediante el cual se accede al riñón original (véase la sección III, los pasos 1-4 arriba). </li><li> Coloque el bloque de tejido extraído en un tubo que contiene 10% de formol. </li><li> Deje que el teratoma para arreglar la noche a 4 ° C. </li><li> Al día siguiente, retire el teratoma del tubo. Diseccionar los quistes y los riñones tanto como sea posible sin dañar el teratoma en sí mismo (Figura 3). Mayor teratomas pueden ser cortados por la mitad para facilitar la disección y la inclusión. </li><li> Proceso del teratoma utilizando un estándar de parafina fijación técnica. Unidades automatizadas están disponibles (por ejemplo, hipercentro Shandon): <table border="0"><tbody><tr><td> I. </td><td> 80% de Flex alcohol </td><td> 2 horas </td></tr><tr><td> II. </td><td> 80% de Flex alcohol </td><td> 1 hora </td></tr><tr><td> III. </td><td> 85% de Flex alcohol </td><td> 1,5 horas </td></tr><tr><td> IV. </td><td> 95% de Flex alcohol </td><td> 1 hora </td></tr><tr><td> V. </td><td> Flex 100% alcohol </td><td> 1 hora </td></tr><tr><td> VI. </td><td> Flex 100% alcohol </td><td> 1 hora </td></tr><tr><td> VII. </td><td> Flex 100% alcohol </td><td> 1 hora </td></tr><tr><td> VIII. </td><td> Claro-Rite 3 </td><td> 1 hora </td></tr><tr><td> IX. </td><td> Claro-Rite 3 </td><td> 1 hora </td></tr><tr><td> X. </td><td> Claro-Rite 3 </td><td> 1 hora </td></tr><tr><td> XI. </td><td> Parafina (TissuePrep) </td><td> 2 horas </td></tr><tr><td> XII. </td><td> Parafina (TissuePrep) </td><td> 2 horas </td></tr></tbody></table></li></ol> V. La inmunohistoquímica y análisis <ol><li> Una vez incluidos en parafina, la sección de teratoma en 5μm cortes seriados con un micrótomo rotatorio, y las secciones de flotar en las diapositivas. </li><li> Antes de la tinción, los portaobjetos para cocer al menos una hora. </li><li> Tinción de las láminas con hematoxilina y eosina con los métodos estándar para identificar las estructuras de tejido representante de cada una de las tres capas germinales embrionarias (Figura 4): <table border="0"><tbody><tr><td> I. </td><td> Lavado de xileno </td><td> 3-5 minutos </td></tr><tr><td> II. </td><td> Xileno </td><td> 3-5 minutos </td></tr><tr><td> III. </td><td> 100% de alcohol </td><td> 3-5 minutos </td></tr><tr><td> IV. </td><td> 100% de alcohol </td><td> 3-5 minutos </td></tr><tr><td> V. </td><td> 95% de alcohol </td><td> 3-5 minutos </td></tr><tr><td> VI. </td><td> 80% de alcohol </td><td> 3-5 minutos </td></tr><tr><td> VII. </td><td> Agua de lavado (varios cambios) </td><td> 2 minutos </td></tr><tr><td> VIII. </td><td> Hematoxilina de Gill # 3 </td><td> 2-5 minutos </td></tr><tr><td> IX. </td><td> Agua de lavado (varios cambios) </td><td> hasta que el agua salga clara </td></tr><tr><td> X. </td><td> Agua de Scott (a los núcleos azules) </td><td> 3 minutos o más </td></tr><tr><td> XI. </td><td> Agua de lavado (varios cambios) </td><td> 1-2 minutos </td></tr><tr><td> XII. </td><td> Eosina </td><td> 1 minuto </td></tr><tr><td> XIII. </td><td> Agua de lavado (varios cambios) </td><td> 30 segundos </td></tr><tr><td> XIV. </td><td> 80% de alcohol </td><td> 1 minuto </td></tr><tr><td> XV. </td><td> 95% de alcohol </td><td> 2 minutos </td></tr><tr><td> XVI. </td><td> 95% de alcohol </td><td> 2 minutos </td></tr><tr><td> XVII. </td><td> 100% de alcohol </td><td> 3 minutos </td></tr><tr><td> XVIII. </td><td> 100% de alcohol (limpia) </td><td> 3 minutos </td></tr><tr><td> XIX. </td><td> Xileno </td><td> 2 minutos o más </td></tr><tr><td> XX. </td><td> Xileno </td><td> 2 minutos o más </td></tr></tbody></table></li><li> Montar un cubreobjetos sobre cada diapositiva con Permount. </li></ol> VI. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Revestimiento de elementos combustibles irradiados CF1 fibroblastos embrionarios de ratón como una capa de conexión para el cultivo de hESCs indiferenciada. MEFs se colocan en la confluencia de ~ 50%, como se muestra aquí, o 4 x 10 5 células por 3,5 cm de diámetro y en una placa de cultivo de 6 pocillos. Bar, 100 micras. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. HESCs ejemplo de la cultura subconfluentes de hESCs indiferenciadas en una capa de alimentación MEF. Se cultivan en las capas de alimentación MEF hasta ~ 70% de confluencia, como se muestra aquí, como se describe pasajes. Bar, 100 micras. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Ejemplo de teratomas explantados. Después de la explantación, el teratoma, el riñón y los tejidos accesorio se fija como un bloque en formol, el riñón y el tejido de accesorios son cuidadosamente recortada antes de inclusión en parafina. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Los teratomas derivados de hESCs indiferenciada contienen representante de los tejidos de todas las tres capas germinales en vivo. Un teratoma, como una muestra en la Figura 3, se seccionó y se tiñó con hematoxilina y eosina para identificar los tejidos embrionarios. hESCs dar lugar a tejidos derivados de las tres capas germinales embrionarias (ectodermo (A, B), el mesodermo (C), endodermo (D). (A) la estructura naciente del tubo neural. (B) epitelio escamoso primitivo. (C) El cartílago rodeado por una cápsula de mesénquima condensado. (D) la estructura glandular intestinal. Bar, 100 micras. Imágenes reimpreso con el permiso del autor. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Análisis de teratoma puede ser utilizado para trazar el destino de los etiquetados, hESCs indiferenciada. Como ya se ha publicado (9), una mezcla de hESCs específicamente etiquetados con hESCs sin etiqueta se puede utilizar para trazar el destino de las células marcadas en un ensayo de formación de teratoma. Como se muestra aquí, hESCs indiferenciadas que expresan el marcador de superficie, CD133, y etiquetada con el aumento de proteína verde fluorescente (EGFP), se mezclaron con hESCs sin etiquetar, indiferenciado. Estos fueron utilizados para formar teratomas por la cápsula renal del injerto. El análisis inmunohistoquímico de hematoxilina y eosina secciones teñidas con teratoma con anti-eGFP anticuerpos demuestra el destino neuroectodérmico de la CD133 + hESCs. Los teratomas fueron procesados ​​como en la Figura 4 y contrastados con anticuerpos anti-eGFP (marrón) para localizar los derivados de células CD133 + GFP + dentro de los tejidos. CD133 + derivadas de las células (flechas) se observaron en los tejidos derivados del ectodermo embrionario, el epitelio neural específica (izquierda) y de la naciente neural, como estructuras tubulares (derecha). Bar, 100 micras. Imágenes reimpreso con el permiso del autor. Gelatina <ul><li> 0,1% de gelatina porcina </li><li> DPBS 99,9% <ul><li> Agregue la gelatina a DPBS, se incuba a 37 ° C durante una hora o hasta que la gelatina se disuelve, y esterilizar filtro (0.22μm) antes de su uso. </li></ul></li></ul> MEF medio <ul><li> 10% de suero fetal bovino (calificados) </li><li> 90% de Dulbecco modificado del medio esenciales (D-MEM) </li><li> 1x L-Glutamina </li><li> 1x penicilina / estreptomicina <ul><li> Filtro de esterilización antes de su uso. </li></ul></li></ul> KSR (sustitución de golpe de gracia en suero) medio <ul><li> 20% de sustitución de suero golpe de gracia </li><li> 80% golpe de gracia D-MEM </li><li> 1x L-Glutamina </li><li> 1x aminoácidos no esenciales </li><li> 0,1 mM β-mercaptoetanol / </li><li> 12.5 ng / ml de bFGF <ul><li> Filtro de esterilización. </li><li> Almacenar a 4 ° C, pero cálido a 37 ° C antes de añadir a las células. </li><li> Añadir bFGF inmediatamente antes del uso. </li></ul></li></ul> Colagenasa IV <ul><li> Disolver 1 mg / ml en medio de KSR, colocando a 37 ° C durante 1-2 horas o hasta que todo el polvo se disuelve. </li><li> Filtro de esterilización. </li></ul> Avertin <ul><li> 0,25 g de 2,2,2-tribromoetanol </li><li> 0,25 ml de 2-metil-2-butanol <ul><li> Se incuba a 37 ° C durante la noche para formar 100% de la solución. </li><li> Varias horas antes de la cirugía, solución diluida al 2,5% de trabajo con DPBS y se incuba a 37 ° C durante al menos 1 hora. </li><li> Filtro de esterilización y alícuota. </li><li> Tribromoetanol es altamente sensible a la luz, por lo que protegerlo de la luz en todas las etapas de preparación y uso. </li><li> Preparar no más de 12-24 horas antes de su uso. </li></ul></li></ul> La buprenorfina <ul><li> 1 mg / ml de solución stock en metanol <ul><li> Diluir a 0,015 mg / ml de solución estéril de trabajo utilizando H 2 O. </li><li> Almacenar a -20 ° C hasta por 1 mes. </li></ul></li></ul> Ketoprofeno <ul><li> 0,5 mg / ml de solución de trabajo en DPBS <ul><li> Añadir DPBS, incubar durante la noche a 37 ° C durante 1-2 horas o hasta que todo el polvo se disuelve. </li><li> Filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C. </li></ul></li></ul>

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Hemos adaptado un ensayo de formación de teratomas altamente eficiente para la elaboración de mapas de la suerte de diferenciar hESCs en un entorno en vivo. Un pequeño número de hESCs específicamente seleccionados se mezcla con indiferenciado hESCs de tipo salvaje y lectina de Phaseolus vulgaris para formar un pellet de células. Esto es injertado debajo de la cápsula renal en un ratón inmunodeficiente. El destino de la hESCs seleccionado originalmente, se puede determinar mediante técnicas de inmunohistoquímica (Figura 5), como se informó anteriormente (9). Este método proporciona una valiosa herramienta para la identificación y la generación de tejidos reactivos específicos para la terapia basada en células.

<table><tbody><tr><td>2-metil-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240486</td><td>Avertin</td></tr><tr><td>2,2,2-tribromo&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td>Avertin</td></tr><tr><td>Suturas de seda 4-0</td><td>Ethicon Inc.</td><td>641G</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233FB</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7536</td><td></td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046-341</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dupont n.º 5</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500233</td><td>Cápsula renal</td></tr><tr><td>Eosina Y</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245-658</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino fetal (calificado)</td><td>Invitrogen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol Flex</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046344</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina Gill&amp;rsquo;s n.º 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-204</td><td></td></tr><tr><td>Hemostato recto</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501241</td><td>Cirugía general</td></tr><tr><td>Pinzas de iris</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>15914</td><td>Cirugía general</td></tr><tr><td>Ketoprofeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2012</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut D-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>Sustituto de suero KnockOut</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25020-081</td><td></td></tr><tr><td>Insertos MILLICELL</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Ácidos aminoácidos no esenciales</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501754</td><td>Cirugía general</td></tr><tr><td>Parafina (TissuePrep)</td><td>Fisher Scientific</td><td>8002-74-02</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>PHA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1668</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina porcina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6144</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor ROCK</td><td>Calbiochem</td><td>Y-27632</td><td></td></tr><tr><td>Ratones SCID beige</td><td>Charles River Laboratories</td><td>250</td><td></td></tr><tr><td>Scott&amp;rsquo;s Wash</td><td>Fisher Scientific</td><td>6697-32</td><td>Ricca Chemicals</td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Vannas</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>14003</td><td>Cápsula renal</td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercapto&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr></tbody></table>

el destino de la asignación de células estaminales embrionarias humanas mediante la formación de teratoma

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation 

Células madre embrionarias humanas (hESCs) tienen una capacidad ilimitada para la auto-renovación, y la capacidad de diferenciarse en células derivadas de las tres capas germinales embrionarias (1). Diferenciación dirigida de hESCs en tipos celulares específicos ha generado mucho interés en el campo de la medicina regenerativa (por ejemplo, (2-5)), y los métodos para determinar la<em&gt; In vivo</emDestino&gt; de hESCs seleccionar ni manipular son esenciales para este esfuerzo. Hemos adaptado un ensayo de formación de teratomas altamente eficiente para este propósito. Un pequeño número de hESCs específicamente seleccionados se mezcla con indiferenciado hESCs de tipo salvaje y lectina de Phaseolus vulgaris para formar un pellet de células. Esto es injertado debajo de la cápsula renal en un ratón inmunodeficiente. Tan sólo 2,5 x 10<sup&gt; 5</supHESCs&gt; se necesitan para formar una de 16 cm<sup&gt; 3</sup&gt; Teratoma en 8-12 semanas. El destino de la hESCs seleccionado originalmente, se puede determinar mediante técnicas de inmunohistoquímica. Este método proporciona una valiosa herramienta para la caracterización de los tejidos reactivos específicos para la terapia basada en células.

Diferenciación dirigida de células embrionarias humanas en específico ha generado mucho interés en la medicina regenerativa. Ofrecemos una concisa, paso a paso el protocolo para determinar la<em&gt; In vivo</em&gt; Suerte de hESCs seleccionado que proporciona una valiosa herramienta para la caracterización de los tejidos reactivos específicos para la terapia basada en células.

El destino de la asignación de células estaminales embrionarias humanas mediante la formación de teratoma

Las células madre embrionarias humanas (hESC) poseen una capacidad ilimitada de autorrenovación y la habilidad de diferenciarse en células derivadas de las tres...

El objetivo general de este procedimiento es diferenciar células madre embrionarias humanas in vivo y determinar sus destinos específicos en los tejidos. Esto se logra primero creando un pellet a partir de células de interés con etiquetado genético. El segundo paso del procedimiento consiste en colocar quirúrgicamente el pellet bajo la cápsula renal de un ratón inmunocomprometido.El tercer paso del procedimiento consiste en permitir que el sedimento celular se diferencie durante ocho a doce semanas debajo de la cápsula del riñón de ratón. El paso final del procedimiento es cosechar el teratoma resultante, fijarlo con formalina y analizar el destino de las células marcadas mediante inmunohistoquímica. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren el desarrollo de las células marcadas en una o más de las tres capas germinales mediante histología e inmunohistoquímica de los teratomas resultantes.Hola, soy Carissa Ritner del laboratorio del Dr. Harold Bernstein en el Instituto de Investigación Cardiovascular de la Universidad de California en San Francisco. Hoy les mostraremos un procedimiento para desarrollar teratomas mediante el injerto en la cápsula renal. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la diferenciación de células madre embrionarias, tanto para asegurar que cada línea con la que trabajamos pueda desarrollarse en cada una de las tres capas germinales como para rastrear el destino de células madre marcadas genéticamente in vivo.Todos los procedimientos que le mostraremos se realizan con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de UCSF. Asimismo, todo trabajo con células madre embrionarias humanas se lleva a cabo con la aprobación del Comité de Supervisión de Investigación con Células Madre de UCSF. Comencemos.Para preparar cultivos de células madre embrionarias humanas, consulte la sección de texto de este protocolo. Para las notas en una cabina de flujo laminar, trate los cultivos de células madre embrionarias humanas tratados con inhibidor de rock con un miligramo por mililitro de colagenasa cuatro e incube durante cinco minutos a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono; aspire la colagenasa cuatro del pocillo. Reemplácela con un mililitro de DPBS a temperatura ambiente suplementado con 10% de penicilina-estreptomicina.Utilice un levantador de células plano para raspar las colonias de la placa y transfiera 0,5 mililitros de la suspensión celular a cada uno de dos tubos de microcentrífuga. Enjuague el pocillo con un mililitro de DPBS y transfiera 0,5 mililitros del enjuague a cada tubo. Centrifugue los tubos durante 20 segundos a 8.000 × g, aspire el sobrenadante y re suspenda cada pellet en 500 microlitros de DPBS fresco con 100 microlitros de un miligramo por mililitro.Lectina de Fasi vulgaris en DPBS a cada tubo para ayudar a unir las células durante el trasplante. Incube la suspensión celular a temperatura ambiente durante cinco minutos. Centrifugue las células a 8.000 × g durante dos minutos para homogenizar el precipitado.Gire los tubos 180 grados dentro de sus pozos en el rotor. Luego, centrifugue nuevamente a 8.000 veces la gravedad durante dos minutos.Aspire cuidadosamente el sobrenadante, dejando los pellet intactos para desalojar los pellet del tubo. Pipetee suavemente 200 microlitros de medio KSR junto al borde del pellet hasta que este se eleve lentamente. Una vez que el pellet se haya desprendido, aspire inmediatamente el medio hacia una celda milimétrica de 0,4 micrómetros.Coloque en un pocillo que contenga tres mililitros de medio KSR. Incube de dos horas a toda la noche a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Coloque un ratón inmunodeficiente anestesiado sobre una almohadilla calefactora para prevenir la hipotermia.Utilice tijeras quirúrgicas y fórceps de iris para realizar una incisión de 2,5 centímetros a través de la piel, paralela a la columna vertebral, pero ligeramente desviada del centro. Haga una incisión más pequeña a través del músculo justo debajo de las costillas y aproximadamente a un centímetro de la columna vertebral.La incisión debe ser lo suficientemente grande como para extraer el riñón, pero lo suficientemente pequeña como para que el riñón no se deslice nuevamente hacia la cavidad abdominal sin aplicar fuerza. Utilizando una pipeta de pasta que ha sido moldeada en forma de gancho romo, extraiga suavemente el riñón a través de la incisión muscular. Humedezca periódicamente el riñón con DPBS estéril para evitar que la cápsula frágil se seque, usando pinzas finas.Extraiga suavemente la cápsula del riñón. Utilice tijeras de primavera de Venecia para hacer una incisión de dos milímetros en la cápsula. En el centro del riñón, inserte una pipeta de pasta que se ha estirado hasta formar una sonda fina y romuda entre la cápsula y el riñón, y mueva suavemente para crear un pequeño bolsillo; repita en el otro lado del riñón de modo que queden dos bolsillos.Uno en cada polo del riñón. Utilizando una punta de pipeta de gran calibre en un dispositivo de transferencia desechable, levante con la pipeta un solo pellet del inserto de la celda milli.Tome la menor cantidad posible de medio, ya que el exceso de medio puede interferir con la transferencia del pellet. Use pinzas para sostener el borde del bolsillo en el riñón. Coloque suavemente el pellet junto a la abertura y utilice la punta de pipeta estirada para empujarlo dentro del bolsillo hacia uno de los polos del riñón.Coloque un segundo gránulo en el bolsillo hacia el polo opuesto. Vuelva a colocar cuidadosamente la cápsula sobre los gránulos. No se necesitan suturas para cerrar la cápsula.Utilice una pipeta con gancho para empujar suavemente el riñón de vuelta hacia la cavidad abdominal. La incisión muscular debe ser lo suficientemente pequeña como para poder sellarla con una sola sutura de seda. Cierre la piel con una serie de cuatro a cinco puntos separados y permita que el animal se recupere de la cirugía antes de devolverlo al animalario entre ocho y doce semanas después de la intervención.Extraiga el teratoma renal y cualquier quiste circundante de la cavidad abdominal como un bloque de tejido. Coloque todo el bloque de tejido extirpado en un tubo de polipropileno de 50 mililitros que contenga fórmula tamponada al 10%. Deje que el teratoma se fije durante la noche a cuatro grados Celsius.Retire el teratoma del tubo y colóquelo sobre una alfombrilla. Utilice un escalpelo para diseccionar cualquier quiste y tanta cantidad de riñón como sea posible sin dañar el teratoma mismo. Los teratomas más grandes pueden cortarse por la mitad para facilitar la disección y la inclusión.Procese el teratoma utilizando la técnica estándar de fijación en parafina y tiña las secciones montadas sobre portaobjetos para su análisis e imagenología. Consulte las notas en la sección de texto del protocolo para obtener detalles. Aquí le mostraremos secciones de tejido de un teratoma típico.Este teratoma fue teñido con hematoxilina y eosina para identificar tejidos embrionarios, representativos de las tres capas germinales, y muestra una estructura incipiente de tubo neural representativa del ectodermo. Esta sección proporciona otro ejemplo de ectodermo, en este caso epitelio escamoso primitivo. Aquí, el cartílago rodeado por una cápsula de mesénquima condensado representa tejidos derivados del mesodermo embrionario.Por último, esta sección que muestra una estructura intestinal glandular demuestra tejido dérmico interno dentro del teratoma para trazar el destino de las células madre marcadas genéticamente; los teratomas fueron sembrados con una mezcla de células madre embrionarias humanas de tipo silvestre y positivas para CD133. Las células derivadas positivas para CD133, indicadas mediante flechas, se observaron en tejidos provenientes del ectodermo embrionario, específicamente en epitelio neuroectodérmico y estructuras similares a tubos neurales en formación. Soy el Dr. Harold Bernstein.Carissa les ha mostrado cómo formar teratomas a partir de cultivos de células madre embrionarias humanas para proporcionar un ensayo de desarrollo in vivo. Al realizar este procedimiento, es importante recordar tener cuidado con sus células y prestar atención a su técnica aséptica. Eso es todo.Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

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Biología

Pez cebra trasplante de células permite la combinación de la genética y la embriología para generar quimeras tejido específico. Este vídeo demuestra gástrula etapas trasplantes de células que han permitido a nuestro laboratorio para investigar el papel de las poblaciones de astro y señales específicas de orientación durante la formación de la comisura del cerebro anterior.

Tejido diana quimeras embrionarias: pez cebra Gástrula Trasplante de células

Genéticos inducible destino de asignación (GIFM) las marcas y las células de las pistas con un control preciso espacial y...

Un enfoque práctico de elaboración de mapas genéticos inducible destino: una guía visual para marcar y rastrear las células En Vivo</em

Las células madre pluripotentes (hPSCs) tienen el potencial para tratar una gran variedad de enfermedades diferentes. La utilidad de estas células reside en el hecho de que pueden diferenciarse en cualquier tipo de célula en el cuerpo. Aquí se describe el ensayo de teratoma, que se utiliza para demostrar la pluripotence de hPSCs.

Teratoma generación en la cápsula del testículo

El destino de una célula embrionaria individual puede ser influenciada por las moléculas hereditarias y / o por las señales de las células vecinas. Utilizando los mapas de destino de la etapa de escisión de embriones de Xenopus, blastómeras individuales pueden ser identificados por la cultura de forma aislada para evaluar las contribuciones de moléculas hereditarias frente a las interacciones célula-célula.

Los explantes blastómeras para la Prueba de Compromiso destino celular durante el desarrollo embrionario

Las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) tienen la capacidad intrínseca para diferenciarse y auto-organizarse en patrones de tejidos distintos; aunque esto requiere la presentación de los gradientes ambientales espaciales. Presentamos micropatterning plantilla como un método simple y robusto para generar gradientes bioquímicas y mecánicas para el control de los patrones de diferenciación HPSC.

Stencil Micropatterning de las células madre pluripotentes para el sondeo Organización Espacial de la diferenciación Parcas

En este estudio, generamos células madre pluripotentes inducidas a partir de células de líquido amniótico de ratón, utilizando un sistema de transposones no viral.

La producción de células madre pluripotentes a partir de células de ratón amniótico líquido mediante un sistema de transposón

Este protocolo describe la reprogramación de primaria amniótico líquido y membrana de las células madre mesenquimales en células pluripotentes inducidas mediante un enfoque episomal no integrar en condiciones totalmente químicamente definidas. Se detallan los procedimientos de extracción, cultivo, reprogramación y caracterización de las células pluripotentes inducidas resultante por métodos rigurosos.

Reprogramación de primario líquido amniótico y las células de la membrana a pluripotencia en condiciones libres de Xeno

Los ligandos de matriz extracelular se pueden patrones en hidrogeles de poliacrilamida para permitir el cultivo de células madre embrionarias humanas en colonias confinadas en sustratos compatibles. Este método se puede combinar con microscopía de fuerza de tracción y ensayos bioquímicos para examinar la interacción entre la geometría del tejido, las fuerzas generadas por células y la especificación del destino.

Patrón de la geometría de las colonias de células madre embrionarias humanas en sustratos compatibles para controlar la mecánica de nivel de tejido

En este estudio, presentamos un ensayo celular in vitro para identificar sustancias químicas teratogénicas. La dinámica de la señalización del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) / factor de respuesta sérica (SRF) se midió en células reporteras pluripotentes inducidas (iPS) humanas, y el riesgo de teratogenicidad se evaluó cuantificando la interrupción química de esta vía de señalización.<br...

Ensayo de toxicidad para el desarrollo basado en el monitoreo en tiempo real de la interrupción de la señal del factor de crecimiento de fibroblastos en células madre pluripotentes inducidas por humanos

Propagación de la madre embrionarias humanas (ES) Células

Aprende a diferenciar células estaminales embrionarias humanas in vivo mediante la formación de teratomas bajo la cápsula renal de ratones inmunocomprometidos. Este protocolo permite rastrear el destino celular.

El destino de la asignación de células estaminales embrionarias humanas mediante la formación de teratoma

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