Primer Libre Selección aptámero utilizar una biblioteca de ADN al azar

El objetivo general de este procedimiento es identificar abers a partir de una biblioteca aleatoria, que se unan específicamente a una proteína diana, en este caso, la proteína S 100 B. Esto se logra primero digiriendo la biblioteca con una endonucleasa de restricción para liberar secuencias aleatorias de las secuencias fijas de cebadores adyacentes. El segundo paso del procedimiento consiste en unir las secuencias de la biblioteca aleatoria a la proteína S 100 B purificada y recuperarlas.

El tercer paso del procedimiento consiste en reunir las secuencias unidas con las secuencias de cebadores fijas mediante hibridación y ligación. El paso final del procedimiento es transcribir los productos ligados para permitir la reamplificación por R-T-P-C-R del grupo de áptidos candidatos unidos, seguido de rondas adicionales de este procedimiento de selección. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren la unión específica de los áptidos seleccionados a la proteína S 100 B.

Por ejemplo, aquí se realizan ensayos de unión tipo sándwich utilizando microarreglos y ensayos con segundos anticuerpos marcados con fluorescencia también se llevan a cabo usando nanocables funcionalizados y segundos anticuerpos acoplados a nanopartículas de oro de 15 nanómetros. Hoy mostraremos un procedimiento para seleccionar los óptimos, que se unen a la proteína S hundred B a partir de una biblioteca aleatoria de secuencias D. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para diversas finalidades, incluyendo el desarrollo de una plataforma de sensores para la detección temprana del cáncer.

Así que comencemos. Para iniciar este procedimiento, genere una biblioteca de ADN libre de cebadores o PF como se describió anteriormente. La escisión de la biblioteca de ADN de doble cadena seguida de la purificación en gel con un gel denaturante de poliacrilamida al 10 % dará como resultado un fragmento de 32 nucleótidos con fosfato en el extremo cinco prima en 30 cc, y un fragmento de 30 nucleótidos con fosfato en el extremo cinco prima en 30, denominados respectivamente fragmento 32+ y fragmento 30+.

El fragmento 32 más contiene el dominio aleatorio de 30 nucleótidos con la secuencia flanqueante mínima CC en el extremo tres prima, mientras que el fragmento 30 más consiste únicamente en la secuencia del dominio aleatorio de 30 nucleótidos. Para preparar los fragmentos de ADN de la biblioteca PF para la selección de aptámeros, resuspenda cada uno de los fragmentos 32 más y 30 más en 40 microlitros de tris 20 milimolar, HCl pH 7,4. Luego caliente las muestras durante tres minutos a 85 grados Celsius tras la incubación.

Enfríe las muestras durante tres minutos en un baño de agua con incubadora a 37 grados Celsius, luego añada 760 microlitros de tampón de selección e incube durante tres minutos a 37 grados Celsius. Después de tres minutos, mantenga la muestra a temperatura ambiente durante 10 minutos. Tras la incubación, pase la solución a través de una columna que contiene perlas de agarosa con níquel NTA previamente lavadas con tampón de selección.

Para eliminar el ADN no específico, recolecte los fragmentos de ADN de la biblioteca PF que no se unen a la columna y resérvelos para un uso posterior. Para preparar las perlas unidas a S 100 B, primero centrifugue 400 microlitros de perlas de NDA con níquel durante tres segundos en una microcentrífuga y deseche el sobrenadante. Luego, lave las perlas con 400 microlitros de tampón de unión pipeteando suavemente cinco veces.

Luego, centrifugue los perles y deseche el sobrenadante. Repita esto. Lave dos veces.

A continuación, pase lentamente la proteína previamente purificada con etiqueta de histidina sobre las perlas. Aquí, se utiliza la proteína B de unión al calcio S100 humana. Pipetee suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo cinco veces cada tres minutos durante un total de 15 minutos.

Después de 15 minutos, centrifugar sobre las perlas y desechar el sobrenadante. Finalmente, lavar el S 100 B unido a las perlas con 400 microlitros de tampón de selección, pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo tres veces. Nuevamente, centrifugar las perlas y desechar el sobrenadante.

Repita este paso dos veces para un total de tres lavados finales con el fin de seleccionar los anticuerpos unidos a S 100 B. Recupere los fragmentos de 32 más y 30 más que se habían apartado previamente. Añada los fragmentos a las perlas con S 100 B unida. A continuación, incube la muestra durante 15 minutos.

Después de 15 minutos, mezcle cada tres minutos pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo; luego centrifugue brevemente las perlas, deseche el sobrenadante y lave el complejo S 100 BDNA con 800 microlitros de tampón de selección pipeteando suavemente. A continuación, centrifugue las perlas y deseche el sobrenadante. Repita este paso de lavado dos veces.

Para recuperar el S 100, se seleccionaron abers agregando 200 microlitros de tris 20 milimolar, HCl pH 7,4 a las perlas. Luego, caliente la suspensión durante tres minutos a 85 grados Celsius. Después de la incubación.

Vortexee las perlas durante un minuto y centrifúguelas. Luego, transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Repita este paso una vez más y combine los sobrenadantes.

Finalmente, purifique los fragmentos de ADN seleccionados. Extraiga los productos de PCR dos veces con un volumen equivalente de fenol cloroformo, alcohol isopropílico. Precipítelos con cloruro de sodio 250 milimolar y 2,5 veces el volumen de etanol al 100% a menos 70 grados Celsius durante 15 minutos.

Centrifugar a 21.000 ×g a cuatro grados Celsius durante 15 minutos. Luego desechar el sobrenadante. Lavar el precipitado con etanol al 75 % de manera eficiente.

Centrifugar a 21.000 ×g a cuatro grados Celsius durante cinco minutos y desechar el sobrenadante. Secar el precipitado en un vacío rápido durante tres minutos tras 10 rondas de selección. Clonar los fragmentos de ADN amplificados por PCR resultantes en el vector topo PCR 2.1 obtenido de un núcleo de vitrógeno.

Luego, secuencie entre 40 y 50 colonias individuales para cada uno de los fragmentos N 30 cc y N 30 seleccionados con el cebador M 13 hacia adelante. Alinee las secuencias seleccionadas utilizando el software Infomax Vector NTI. A continuación, determine las secuencias consenso basándose en los alineamientos.

Una vez que se han identificado las secuencias de consenso, adquiera los aptámeros de consenso según se describe en el protocolo escrito. Suspender el primer aptámero sintetizado con un grupo amina C seis en el extremo cinco primo en tampón de impresión hasta una concentración final de 15 micromolares. Luego, depositar la solución de aptámero sobre portaobjetos activados con CodeLink utilizando un microrejilla Array de Apogen Discoveries.

Siga los protocolos recomendados en el enlace del código. Imprima cada portaobjetos con 12 matrices. Utilice un formato de dos por ocho.

Cassette de hibridación de microarreglo para hibridación. Diluya la proteína S100B a la concentración adecuada en 70 microlitros de PBS. A continuación, aplique la solución a los pocillos del cassette de microarreglo.

Selle el casete de microarreglo utilizando una lámina adhesiva libre de nucleasas para prevenir la evaporación. Permita que la proteína se una a los abers impresos en el enlace de código. Incube individualmente durante una hora a temperatura ambiente.

Lave los pocillos del casete tres veces con PBS con cloruro de magnesio cinco milimolar o PBSM. A continuación, diluya los segundos anticuerpos marcados con fluorescencia hasta 0,125 micromolar en 70 microlitros de PBSM. Caliente la mezcla durante tres minutos a 85 grados Celsius.

Luego, deje enfriar los ABERS marcados sobre hielo. Aplique los ABERS a los pocillos del casete de microarreglo durante tres minutos. Vuelva a sellar el casete con la lámina adhesiva e incube durante una hora a temperatura ambiente.

Nuevamente, individualmente. Lave los pocillos tres veces con PBSM tras el lavado. Desarme el casete y enjuague toda la diapositiva con PBSM.

Luego, seque completamente la laminilla mediante centrifugación. Finalmente, escanee la laminilla utilizando un escáner Packard Biosciences ScanArray. Se determinó la unión de 4,000 XL para aptámeros marcados en el extremo cinco prime con gamma P 32 A TP dirigidos contra la proteína S 100 B y se graficó frente a la concentración para la determinación de KD.

Los kd representativos tras aproximadamente siete rondas de selección suelen estar en el rango de 10 a la menos siete molar. Los aptámeros dert primero con dirección 5’ se acoplaron a microarreglos de enlace de código; la proteína S 100 B purificada se unió al primer optímero y el segundo optímero marcado con LOR 5 46 se unió a los complejos del primer optímero con la proteína S 100 B.

La fluorescencia se cuantificó utilizando un escáner de matriz. La fila central muestra unión sándwich con caracterización por unión aditiva en ensayos de KD en las filas superior e inferior. No hay unión sándwich para abers con derivatización tiol en el extremo cinco primo; los primeros abers se acoplaron a nanocables de oro utilizando química tiol estándar.

Los segundos aptámeros se acoplaron a 50 NMO o a nanopartículas de oro de la misma manera. Luego, la proteína S100B purificada se unió primero a los nanocables derivatizados; posteriormente, los aptámeros secundarios de 50 nanomolares con nanopartículas de oro se unieron a los complejos de nanocable-aptámero-S100B. Los complejos tipo sándwich formados se visualizaron mediante microscopía electrónica de barrido de emisión de campo (F FE SEM). Aquí.

Un control negativo puede observarse en un ensayo de unión realizado con la proteína HTRA1 en lugar de la proteína S100B. Bien, una de las cosas más importantes sobre el procedimiento es que estamos utilizando un enfoque sin cebadores, en el que no contamos con secuencias fijas que puedan causar falsos positivos y falsos negativos debido a que las propias secuencias dominen la región aleatoria. Al realizar este procedimiento, es importante asegurarse de que la plantilla de ADN se destruya previamente a cada reacción de transcripción inversa y tener cuidado al aislar el producto específico de RT-PCR tras cada reamplificación.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.