Primer Libre Selección aptámero utilizar una biblioteca de ADN al azar

El objetivo general de este procedimiento es identificar los abers de una biblioteca aleatoria, que se unen específicamente a una proteína objetivo, en este caso, la proteína S 100 B. Esto se logra digiriendo primero la biblioteca con endonucleasa de restricción para liberar secuencias aleatorias de las secuencias de cebadores fijas flanqueantes. El segundo paso del procedimiento es unir las secuencias de la biblioteca aleatoria a la proteína S 100 B purificada y recuperarlas.

El tercer paso del procedimiento es reunir secuencias ligadas con secuencias de cebadores fijas mediante hibridación y ligadura. El último paso del procedimiento consiste en transcribir los productos ligados para permitir la reamplificación R-T-P-C-R del grupo unido de candidatos a la ampliación, seguido de rondas adicionales de este procedimiento de selección. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la unión específica de los abers seleccionados a la proteína S 100 B.

Por ejemplo, en este caso, los ensayos de unión en sándwich se realizan mediante microarrays y los ensayos de segundos abers marcados con fluorescencia también se realizan utilizando nanocables funcionalizados y segundos abers acoplados a nanopartículas de oro de 15 nanómetros. Hoy mostraremos un procedimiento para seleccionar la proteína B óptima que se une a cien proteínas B de una biblioteca aleatoria de secuencias D. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para una variedad de propósitos, incluido el desarrollo de una plataforma de sensores para la detección temprana del cáncer.

Así que comencemos. Para comenzar este procedimiento, genere una biblioteca de ADN PF o libre de cebadores como se describió anteriormente. La escisión de la biblioteca de ADN bicatenario seguida de la purificación en gel con un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 10% dará como resultado un fragmento de 32 nucleótidos de cinco fosfato primario en 30 cc, y un fragmento de 30 nucleótidos de cinco fosfato primario en 30, designados como fragmento 32 plus y 30 plus respectivamente.

El fragmento de más de 32 contiene el dominio aleatorio de 30 nucleótidos con la secuencia de flanqueo mínima CC en el extremo de los tres primos, mientras que el fragmento de más de 30 consta solo de la secuencia de dominio aleatorio de 30 nucleótidos. Para preparar los fragmentos de ADN de la biblioteca PF para la selección aptr, suspenda cada uno de los fragmentos más y 32 más y 30 en 40 microlitros de 20 mili tris, pH HCL 7.4. A continuación, calentar las muestras durante tres minutos a 85 grados centígrados después de la incubación.

Enfriar, las muestras durante tres minutos en una incubadora de baño de agua a 37 grados centígrados, luego a 760 microlitros de selección, tampar e incubar durante tres minutos a 37 grados centígrados. Después de tres minutos, mantenga la muestra a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de la incubación, pase la solución a través de una columna que contiene perlas de níquel NTA agro prelavadas con tampón de selección.

Para eliminar el ADN inespecífico, recoja los fragmentos de ADN de la biblioteca PF que no se unan a la columna y déjelos para más adelante. Para preparar las perlas encuadernadas S 100 B, primero centrifugar 400 microlitros de perlas de níquel NDA durante tres segundos en una microcentrífuga y desechar el sobrenadante. A continuación, lave las perlas con 400 microlitros de tampón aglutinante pipeteando suavemente cinco veces.

A continuación, gira las cuentas y desecha el sobrenadante. Repite esto. Lavar dos veces.

A continuación, la mala proteína marcada con histidina previamente purificada sobre las perlas. Aquí, la unión de calcio S 100 humano. La proteína B se utiliza pipeteando suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo cinco veces cada tres minutos durante un total de 15 minutos.

Después de 15 minutos, gire las cuentas y deseche el sobrenadante. Por último, lavar suavemente el S 100 B encuadernado con 400 microlitros de tampón de selección acariciando tres veces hacia arriba y hacia abajo. De nuevo, gira las cuentas hacia abajo y desecha el sobrenadante.

Repita este paso dos veces para un total de tres lavados finales para seleccionar para los abers encuadernados S 100 B. Recupera los fragmentos más 32 y más de 30 que se reservaron anteriormente. Añada los fragmentos a la cuenta S 100 B.A continuación, incube la muestra durante 15 minutos.

Mezclando cada tres minutos pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo después de 15 minutos, gire brevemente las perlas, deseche el sobrenadante y luego lave el complejo S 100 BDNA con 800 microlitros de tampón de selección pipeteando suavemente. A continuación, gira las cuentas hacia abajo y desecha el sobrenadante. Repita este paso de lavado dos veces.

Para recuperar el S 100, se seleccionan los abers a 200 microlitros de tris de 20 milimolares, HCL pH 7,4 a las perlas. A continuación, calienta la lechada durante tres minutos a 85 grados centígrados. Después de la incubación.

Agita las cuentas durante un minuto y gíralas hacia abajo. Luego transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Repite este paso una vez y combina los sobrenadantes.

Por último, purifica los fragmentos de ADN seleccionados. Extraiga los productos de PCR dos veces con un volumen equivalente de fenilcloroformo, alcohol isopropílico. Precipitarlos con cloruro de sodio 250 milimolares y 2,5 veces el volumen de etanol al 100% a menos 70 grados centígrados durante 15 minutos.

Gire a 21, 000 GS a cuatro grados centígrados durante 15 minutos. A continuación, deseche el sobrenadante. Enjuague el pellet con etanol al 75% de manera eficiente.

Girar a 21.000 GS a cuatro grados centígrados durante cinco minutos y desechar el sobrenadante. Seque el pellet en una aspiradora rápida durante tres minutos después de 10 rondas de selección. Clonar los fragmentos de ADN amplificados por PCR resultantes en el vector topo PCR 2.1 obtenido a partir de un núcleo de vitrógeno.

A continuación, secuenciar entre 40 y 50 colonias individuales para cada uno de los fragmentos seleccionados de N 30 cc y N 30 con el cebador delantero M 13. Alinee las secuencias seleccionadas utilizando el software infomax vector NTI. A continuación, determine las secuencias de consenso en función de las alineaciones.

Una vez que se han identificado las secuencias de consenso, compre los abers de consenso como se describe en el protocolo escrito. Suspender el primer aptámero sintetizado con un Amin C de cinco primos y seis mitades en tampón de impresión hasta una concentración final de 15 micromolares. A continuación, localice la solución del aptámero en portaobjetos activados por enlace de código utilizando una matriz de microrredes de descubrimientos de apogen.

Siguiendo los protocolos recomendados de enlace de código. Imprime cada diapositiva con 12 matrices. Usa un formato de dos por ocho.

Casete de hibridación de microarrays para hibridación. Diluir la proteína S 100 B a la concentración adecuada en 70 microlitros de PBS. A continuación, aplique la solución a los pocillos del casete de microarrays.

Selle el casete de microarray con una lámina de techo adhesiva sin nucleasas para evitar la evaporación. Permita que la proteína se una a los abers impresos en el enlace del código. Frotar durante una hora a temperatura ambiente después de la incubación individualmente.

Lave los pocillos del casete tres veces con cloruro de magnesio PBS de cinco milimolares o PBSM. A continuación, diluya los segundos abers marcados con fluorescencia a 0,125 micromolares en 70 microlitros de PBSM. Calienta la mezcla durante tres minutos a 85 grados centígrados.

A continuación, deje que los ABERS etiquetados se enfríen con hielo. Durante tres minutos, aplique los abers a los pocillos del casete del microarray. De nuevo, selle el casete con la lámina adhesiva e incube durante una hora a temperatura ambiente.

De nuevo, individualmente. Lave los pocillos tres veces con PBSM después del lavado. Desmonte el casete y enjuague toda la diapositiva con PBSM.

A continuación, seque completamente el portaobjetos por centrifugación. Por último, escanee la diapositiva con una matriz de escaneo de Packard Biosciences. Se determinó la unión de 4.000 XL para los aptámeros marcados con gamma P 32 A TP con cinco extremos primarios para la proteína S 100 B y se graficó contra la concentración para la determinación de KD.

Los kds representativos después de aproximadamente siete rondas de selección suelen estar en el rango de 10 a siete molares negativos. Se acoplaron cinco aptámeros de primer puntería a microarrays de enlace de código, la proteína S 100 B purificada se unió al primer optimer y LOR 5 46 se etiquetó con el segundo. Optimer se unió a los primeros complejos optimer S 100 B.

La fluorescencia se cuantificó utilizando un escáner de barrido. La fila del medio muestra la unión en sándwich caracterizada por la unión aditiva en los ensayos KD en las filas superiores e inferiores. No hay unión en sándwich para los abers, los primeros abers derivados de cinco tioles primos se acoplaron a nanocables de oro utilizando la química estándar del tilo.

Los segundos abers se acoplaron a 50 NMO o nps de oro de la misma manera. A continuación, la proteína S 100 B purificada se unió primero a los nanocables derivados, el segundo aptámero 50 nano molares de oro mps se unió posteriormente a los primeros complejos S 100 B de nanocables de aptámero. Los complejos sándwich ligados se visualizaron utilizando F FE SEM. Aquí.

Se puede ver un control negativo para un ensayo de unión realizado con la proteína HTRA one en lugar de la proteína S 100 B. Bien, una de las cosas más importantes del procedimiento es que estamos utilizando un enfoque sin cebadores en el que no tenemos secuencias fijas que puedan causar falsos positivos y falsos negativos en función de las secuencias mismas que abruman la región aleatoria. Al realizar este procedimiento, es importante asegurarse de que la plantilla de ADN se destruya antes de cada reacción de transcripción inversa y tener cuidado de aislar el producto R-T-P-C-R específico después de cada reamplificación.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.