Name: Primer Libre Selección aptámero utilizar una biblioteca de ADN al azar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Aprende un protocolo sin cebadores para seleccionar aptámeros que se unen específicamente a la proteína S100B desde una biblioteca de ADN aleatoria. Este método mejora la eficiencia de SELEX eliminando interferencias de secuencias fijas.

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Damos las gracias a Craig Pablo en el Fondo para el núcleo de microarrays por su ayuda. Este trabajo fue apoyado por el NIH / NCI subvención # CA118591 del Programa de IMAT. SLD también reconoce un Pennsylvania Space Grant Consortium for beca de apoyo financiero. Esta publicación fue apoyada también por la Universidad Estatal de Pennsylvania Materiales del Instituto de Investigación Nano Fabricación de redes y la Fundación Nacional de Ciencias Acuerdo de Cooperación No. 0335765, la National Nanotechnology Infraestructura de red, con la Universidad de Cornell.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Tris-HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HotMaster TAQ DNA Polimerasa</td><td>5 PRIME</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de dNTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampón UltraPuro 10X TBE</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ADN PhiX174/ Marcador de ADN Hinf I</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-dCTP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fenol:ChCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;:IAA</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etileno</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enzimas de restricción</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Película fotográfica</td><td>ECE Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perlas de agarosa Ni-NTA</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Columna de polipropileno</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaAc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células Detroit-551</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células SK-MEL-31</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ligasa de ADN T4</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sulfoxido</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polimerasa de ARN Sp6</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNasa I libre de RNasa</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de RNasa</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transcriptasa inversa SensiScript</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vector pCR-2.1-TOPO</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células competentes DH5&amp;alpha;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit mini de plásmido</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vector NTI</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cinasa de polinucleótidos T4</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;#947;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-ATP</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

primer libre selección aptámero utilizar una biblioteca de adn al azar

Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

Los aptámeros son oligonucleótidos altamente estructurado (ADN o ARN) que se puede unir a los objetivos con afinidades similares a los anticuerpos 1. Se identifican a través de un proceso de selección in vitro denominado evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) para reconocer una gran variedad de objetivos, a partir de moléculas pequeñas de proteínas y otras macromoléculas 2-4. Aptámeros tienen propiedades que son muy adecuadas para el diagnóstico in vivo y / o aplicaciones terapéuticas: Además de una buena especificidad y afinidad, que son fáciles de sintetizar, sobrevivir las condiciones del proceso más riguroso, son poco inmunogénicas, y su tamaño relativamente pequeño puede dar lugar a la penetración fácil de tejidos. Aptámeros que se identifican con el proceso SELEX estándar por lo general comprenden ~ 80 nucleótidos (nt), ya que normalmente se selecciona a partir de bibliotecas de ácidos nucleicos con ~ 40 nt de longitud regiones más al azar sitios fijos de imprimación de ~ 20 nt en cada lado. El primer secuencias fijas por lo tanto puede comprender casi el ~ 50% de las secuencias de la biblioteca, y por lo tanto, positiva o negativamente compromiso identificación de los aptámeros en el proceso de selección de tres, aunque los enfoques bioinformáticos sugieren que las secuencias fijas no contribuyen significativamente a la estructura aptamer después de la selección 5 . Para hacer frente a estos problemas potenciales, primer secuencias han sido bloqueados por oligonucleótidos complementarios o cambiar a mitad de camino diferentes secuencias durante las rondas de SELEX 6, o que han sido recortadas a 6-9 nt 7, 8. Wen y Gray 9 diseñó una cartilla sin método SELEX genómica, en la que el primer secuencias fueron completamente eliminadas de la biblioteca antes de la selección y se regenera entonces para permitir la amplificación de los fragmentos del genoma seleccionado. Sin embargo, para emplear la técnica, una biblioteca genómica única tiene que ser construido, el cual posee una limitada diversidad, y la regeneración después de varias rondas de selección se basa en un paso reamplificación lineal. Por otra parte, los esfuerzos para evitar los problemas causados ​​por primer secuencias fijas con el particionado de alta eficiencia se encuentran con problemas en cuanto a amplificación por PCR 10. Hemos desarrollado un manual gratuito (PF) el método de selección que simplifica los procedimientos de SELEX y efectivamente elimina la interferencia de imprimación problemas 11, 12. Los protocolos de trabajo de una manera directa. La región central al azar de la biblioteca se purifica sin extrañas secuencias de acompañamiento y se une a un objetivo adecuado (por ejemplo, para una proteína purificada o de mezclas complejas, tales como líneas de células). A continuación, las secuencias de atado se obtienen, se reunió con las secuencias de acompañamiento, y re-amplificado para generar seleccionado sub-bibliotecas. Como ejemplo, aquí hemos seleccionado aptámeros para S100B, un marcador de proteína para el melanoma. Los ensayos de unión mostró Kd s en los 10 -7 a 10 -8 M rango después de unas cuantas rondas de selección, y se demuestra que los aptámeros funcionar eficazmente en un formato sándwich vinculante.

SELEX protocolos comprenden múltiples rondas de selección, cada uno de los cuales requieren la regeneración de ligandos unidos, que a su vez requieren secuencias fijas de imprimación que flanquean las regiones de la biblioteca al azar. Estas secuencias de los cebadores fija puede interferir con el proceso de selección (falsos positivos y negativos). Aquí presentamos una cartilla sin protocolo.

Primer Libre Selección aptámero utilizar una biblioteca de ADN al azar

Los aptámeros son oligonucleótidos (ADN o ARN) altamente estructurados que pueden unirse a dianas con afinidades comparables a las de los anticuerpos 1. Se identifican...

El objetivo general de este procedimiento es identificar abers a partir de una biblioteca aleatoria, que se unan específicamente a una proteína diana, en este caso, la proteína S 100 B. Esto se logra primero digiriendo la biblioteca con una endonucleasa de restricción para liberar secuencias aleatorias de las secuencias fijas de cebadores adyacentes. El segundo paso del procedimiento consiste en unir las secuencias de la biblioteca aleatoria a la proteína S 100 B purificada y recuperarlas.El tercer paso del procedimiento consiste en reunir las secuencias unidas con las secuencias de cebadores fijas mediante hibridación y ligación. El paso final del procedimiento es transcribir los productos ligados para permitir la reamplificación por R-T-P-C-R del grupo de áptidos candidatos unidos, seguido de rondas adicionales de este procedimiento de selección. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren la unión específica de los áptidos seleccionados a la proteína S 100 B.Por ejemplo, aquí se realizan ensayos de unión tipo sándwich utilizando microarreglos y ensayos con segundos anticuerpos marcados con fluorescencia también se llevan a cabo usando nanocables funcionalizados y segundos anticuerpos acoplados a nanopartículas de oro de 15 nanómetros. Hoy mostraremos un procedimiento para seleccionar los óptimos, que se unen a la proteína S cien B a partir de una biblioteca aleatoria de secuencias D. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para diversas finalidades, incluyendo el desarrollo de una plataforma de sensores para la detección temprana del cáncer.Entonces, comencemos. Para iniciar este procedimiento, genere una biblioteca de ADN libre de cebadores o PF según se describió anteriormente. La escisión de la biblioteca de ADN de doble cadena seguida de la purificación en gel con un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 10 % dará como resultado un fragmento de 32 nucleótidos con fosfato en el extremo cinco prima en 30 cc, y un fragmento de 30 nucleótidos con fosfato en el extremo cinco prima en 30, denominados respectivamente fragmento 32+ y fragmento 30+.El fragmento 32 más contiene el dominio aleatorio de 30 nucleótidos con la secuencia flanqueante mínima CC en el extremo tres prima, mientras que el fragmento 30 más consiste únicamente en la secuencia del dominio aleatorio de 30 nucleótidos. Para preparar los fragmentos de ADN de la biblioteca PF para la selección de aptámeros, resuspenda cada uno de los fragmentos 32 más y 30 más en 40 microlitros de tris 20 milimolar, HCl pH 7,4. Luego caliente las muestras durante tres minutos a 85 grados Celsius tras la incubación.Enfríe las muestras durante tres minutos en un baño de agua con incubadora a 37 grados Celsius, luego añada 760 microlitros de tampón de selección e incube durante tres minutos a 37 grados Celsius. Después de tres minutos, mantenga la muestra a temperatura ambiente durante 10 minutos. Tras la incubación, pase la solución a través de una columna que contiene perlas de agarosa con níquel NTA previamente lavadas con tampón de selección.Para eliminar el ADN no específico, recolecte los fragmentos de ADN de la biblioteca PF que no se unen a la columna y resérvelos para un uso posterior. Para preparar las perlas unidas a S 100 B, primero centrifugue 400 microlitros de perlas de NDA con níquel durante tres segundos en una microcentrífuga y deseche el sobrenadante. Luego lave las perlas con 400 microlitros de tampón de unión pipeteando suavemente cinco veces.Luego, centrifugar los perlas y desechar el sobrenadante. Repita esto. Lave dos veces.A continuación, pase lentamente la proteína previamente purificada con etiqueta de histidina sobre las perlas. Aquí, se utiliza la proteína B de unión al calcio S100 humana. Pipetee suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo cinco veces cada tres minutos durante un total de 15 minutos.Después de 15 minutos, centrifugar las perlas y desechar el sobrenadante. Finalmente, lavar las perlas con S 100 B unido con 400 microlitros de tampón de selección, pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo tres veces. Nuevamente, centrifugar las perlas y desechar el sobrenadante.Repita este paso dos veces para un total de tres lavados finales con el fin de seleccionar los anticuerpos unidos a S 100 B. Recupere los fragmentos de 32 más y 30 más que se habían apartado previamente. Añada los fragmentos a las perlas con S 100 B unido. A continuación, incube la muestra durante 15 minutos.Después de 15 minutos, mezcle cada tres minutos pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo; luego centrifugue brevemente las perlas, deseche el sobrenadante y lave el complejo S 100 BDNA con 800 microlitros de tampón de selección pipeteando suavemente. A continuación, centrifugue las perlas y deseche el sobrenadante. Repita este paso de lavado dos veces.Para recuperar el S 100, se seleccionaron abers agregando 200 microlitros de tris 20 milimolar, HCl pH 7,4 a las perlas. Luego, caliente la suspensión durante tres minutos a 85 grados Celsius. Después de la incubación.Vortexee las perlas durante un minuto y centrifúguelas. Luego, transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Repita este paso una vez y combine los sobrenadantes.Finalmente, purifique los fragmentos de ADN seleccionados. Extraiga los productos de PCR dos veces con un volumen equivalente de fenol-cloroformo, alcohol isopropílico. Precipítelos con cloruro de sodio 250 milimolar y 2,5 veces el volumen de etanol al 100 % a menos 70 grados Celsius durante 15 minutos.Centrifugar a 21.000 ×g a cuatro grados Celsius durante 15 minutos. Luego, desechar el sobrenadante. Enjuagar el precipitado eficazmente con etanol al 75 %.Centrifugar a 21.000 ×g a cuatro grados Celsius durante cinco minutos y desechar el sobrenadante. Secar el pellet en un vacío rápido durante tres minutos tras 10 ciclos de selección. Clonar los fragmentos de ADN amplificados por PCR resultantes en el vector PCR 2.1 topo obtenido de un kit de VITROGEN.Luego, secuencie entre 40 y 50 colonias individuales para cada uno de los fragmentos seleccionados N 30 cc y N 30 con el cebador M 13 hacia adelante. Alinee las secuencias seleccionadas utilizando el software Infomax Vector NTI. A continuación, determine las secuencias consenso basándose en los alineamientos.Una vez que se han identificado las secuencias de consenso, adquiera los aptámeros de consenso según se describe en el protocolo escrito. Suspenda el primer aptámero sintetizado con un grupo aminoc6 en el extremo cinco prime en tampón de impresión hasta una concentración final de 15 micromolares. Luego, aplique la solución de aptámero sobre portaobjetos activados con CodeLink utilizando un microrejilla Array de Apogen Discoveries.Seguir el enlace de código con los protocolos recomendados. Imprimir cada portaobjetos con 12 matrices. Utilizar un formato de dos por ocho.Cassette de hibridación de microarreglo para hibridación. Diluya la proteína S100B a la concentración adecuada en 70 microlitros de PBS. A continuación, aplique la solución a los pocillos del cassette de microarreglo.Cierre el cassette de microarreglo utilizando una lámina adhesiva selladora libre de nucleasas para prevenir la evaporación. Permita que la proteína se una a los anticuerpos impresos en el enlace de código. Incube individualmente durante una hora a temperatura ambiente.Lave los pocillos del casete tres veces con PBS con cloruro de magnesio cinco milimolar o PBSM. A continuación, diluya los segundos anticuerpos marcados con fluorescencia hasta 0,125 micromolar en 70 microlitros de PBSM. Caliente la mezcla durante tres minutos a 85 grados Celsius.Luego, deje enfriar los ABERS marcados sobre hielo. Aplique los ABERS a los pocillos del casete de microarreglo durante tres minutos. Vuelva a sellar el casete con la lámina adhesiva e incube durante una hora a temperatura ambiente.Nuevamente, individualmente. Lave los pocillos tres veces con PBSM tras el lavado. Desarme el casete y enjuague completamente la portaobjetos con PBSM.Luego, seque completamente la laminilla mediante centrifugación. Finalmente, escanee la laminilla utilizando un escáner Packard Biosciences ScanArray. Se determinó la unión de 4,000 XL para aptámeros marcados en el extremo cinco prime con gamma P 32 A TP frente a la proteína S 100 B y se representó en función de la concentración para la determinación de KD.Los kd representativos tras aproximadamente siete rondas de selección suelen estar en el rango de 10 a la menos siete molar. Los aptámeros dert dirigidos al extremo 5' se acoplaron a microarreglos de enlace de código; la proteína S 100 B purificada se unió al primer optímero y el segundo optímero marcado con LOR 5 46 se unió a los complejos del primer optímero con la proteína S 100 B.La fluorescencia se cuantificó utilizando un escáner de matriz. La fila central muestra unión sándwich con caracterización mediante unión aditiva en ensayos de KD en las filas superior e inferior. No hay unión sándwich para abers con derivatización de tiol en el extremo cinco prime; los primeros abers se acoplaron a nanocables de oro utilizando química estándar de tiol.Los segundos aptámeros se acoplaron a 50 NMO o a nanopartículas de oro de la misma manera. Luego, la proteína S100B purificada se unió primero a los nanocables derivatizados; posteriormente, los aptámeros secundarios de 50 nanomolares con nanopartículas de oro se unieron a los complejos de nanocable-aptámero-S100B. Los complejos sándwich formados se visualizaron mediante microscopía electrónica de barrido de emisión de campo (F FE SEM). Aquí.Un control negativo puede observarse en un ensayo de unión realizado con la proteína HTRA1 en lugar de la proteína S100B. Bien, una de las cosas más importantes sobre el procedimiento es que estamos utilizando un enfoque sin cebadores, en el que no contamos con secuencias fijas que podrían provocar resultados falsos positivos y falsos negativos debido a que las propias secuencias dominen la región aleatoria. Al realizar este procedimiento, es fundamental asegurarse de que la plantilla de ADN se destruya previamente a cada reacción de transcripción inversa y tener cuidado al aislar el producto específico de RT-PCR tras cada reamplificación.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Se proporciona un protocolo para seleccionar aptámeros de conmutación de estructura para objetivos de moléculas pequeñas basado en un método de selección de perlas magnéticas de rigurosidad sintonizable. Los aptámeros seleccionados con propiedades de cambio de estructura son beneficiosos para los ensayos que requieren un cambio conformacional para señalar la presencia de un objetivo, como el ensayo de nanopartículas de oro descrito.

Un método para la selección de aptámeros Estructura de conmutación Aplicado a una de nanopartículas de oro ensayo colorimétrico

Este manuscrito describe un enfoque automatizado de selección del tamaño del gel para purificar fragmentos de ADN para la secuenciación de próxima generación. La tecnología Ranger proporciona una automatización completa de todo el proceso de carga de gel de agarosa, análisis electroforético y recuperación de fragmentos de ADN específicos, lo que permite bibliotecas de secuenciación de próxima generación de alto rendimiento y alta calidad.

Automatizado Gel Tamaño Selección para mejorar la calidad de las bibliotecas de secuenciación de próxima generación Preparado a partir de muestras de agua del medio ambiente

Se presenta un protocolo para la evaluación funcional de amplias bibliotecas de saturación de un solo sitio de mutagénesis de proteínas utilizando secuenciación de alto rendimiento. Es importante destacar que este enfoque utiliza pares de cebadores para multiplexar ortogonales construcción de la biblioteca y secuenciación. Se proporcionan resultados representativos utilizando TEM-1 β-lactamasa seleccionado en una dosis clínicamente relevante de ampicilina.

Un protocolo para la evaluación funcional de la Proteína Total-mutagénesis de saturación Bibliotecas La utilización de secuenciación de alto rendimiento

La termoforesis a microescala (MST) es una tecnología sensible para caracterizar las interacciones aptámero-objetivo. Este manuscrito describe un protocolo MST para caracterizar las interacciones aptámero-molécula pequeña.

Mapear el sitio de unión de un aptámero de ATP utilizando MicroScale termoforesis

Se presenta un protocolo para la selección en vitro y caracterización del ácido ftálico de grupo específico éster enlace DNA aptámeros. También se incluye la aplicación de los aptámeros seleccionados en un aptasensor electroquímico.

Selección de aptámeros ADN enlace de éster ácido ftálico, caracterización y aplicación a un Aptasensor electroquímico

Secuenciación de próxima generación (NGS) es una poderosa herramienta para la caracterización genómica que está limitada por la tasa alta de error de la plataforma (~0.5–2.0%). Describimos nuestros métodos de corrección de error de la secuencia que nos permiten obviar la tasa de error NGS y detectar mutaciones en fracciones de alelo variante tan raros como 0.0001.

Detección de eventos raros usando ADN Error corregido y secuenciación de ARN

La especificidad de la secuencia es fundamental para la regulación genética. Las proteínas reguladoras que reconocen secuencias específicas son importantes para la regulación genética. Definir sitios de unión funcional para tales proteínas es un problema biológico desafiante. Aquí se describe un enfoque iterativo para la identificación de un sitio de unión para una proteína de unión al ARN y es aplicable a todas las proteínas de unión al ARN.

Explorar el espacio de secuencia para identificar sitios de unión para proteínas reguladoras que unen el ARN

Los experimentos de microarray de unión a proteínas (PBM) combinados con ensayos bioquímicos vinculan las propiedades lácteas y catalíticas de la primasa de ADN, una enzima que sintetiza los imprimadores de ARN en el ADN de la plantilla. Este método, designado como perfilado de primas de alto rendimiento (HTPP), se puede utilizar para revelar patrones de unión al ADN de una variedad de enzimas.

Reconocimiento de secuencia de ADN por ADN primas mediante perfiles de primas de alto rendimiento

Las endonucleasas de restricción con nueva especificidad de secuencia se pueden desarrollar a partir de enzimas que reconocen una secuencia parcialmente degenerada. Aquí proporcionamos un protocolo detallado que utilizamos con éxito para alterar la especificidad de la secuencia de la enzima NlaIV. Los ingredientes clave del protocolo son la compartimentación in vitro de la reacción de transcripción/traducción y la selección de variantes con nuevas especificidades de secuencia.

In Vitro dirigió la evolución de una endonucleasa de restricción con una especificidad más estricta

Proporcionamos un protocolo que generalmente se puede aplicar para seleccionar aptámeros que se unen solo a virus infecciosos y no a virus que se han vuelto no infecciosos mediante un método de desinfección o a cualquier otro virus similar. Esto abre la posibilidad de determinar el estado de infectividad en pruebas portátiles y rápidas.

Selección in vitro de aptámeros para diferenciar virus infecciosos de virus no infecciosos

Aprende un protocolo sin cebadores para seleccionar aptámeros que se unen específicamente a la proteína S100B desde una biblioteca de ADN aleatoria. Este método mejora la eficiencia de SELEX eliminando interferencias de secuencias fijas.

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