Name: Oligo perfiles Misa (OLIMP) de polisacáridos extracelulares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Aprende el método OLIMP para analizar glicoestructuras de paredes celulares vegetales mediante digestión enzimática y espectrometría de masas MALDI-TOF. Esta técnica permite obtener información estructural rápida y sensible.

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Este trabajo fue financiado por la beca del Instituto de Biociencias de la Energía OO0G01.

El método se ejemplifica en OLIMP la hemicelulosa principales presentes en las paredes celulares de plantas dicotiledóneas, xiloglucano, utilizando un endoglucanasa como glycosylhydrolase. El método se demuestra con toda plántulas de Arabidopsis como una fuente de tejido de la planta. Material de la matriz extracelular y enzima se puede sustituir en función del análisis deseado utilizando el mismo procedimiento. 1. El aislamiento de la pared celular <ol><li> Cosecha de cinco 5 días de plántulas de Arabidopsis toda o la cantidad equivalente de su material deseado y transferirlos a un tubo de reacción 1,5 ml. Asegúrese de que el material se coloca en la parte inferior del tubo. </li><li> Agregue dos bolas de metal de 3 mm para el tubo de reacción en la parte superior de la muestra y la presión de congelación en nitrógeno líquido. </li><li> Triturar la muestra congelada con una molienda (2:30 min, 25 Hz). </li><li> Añadir 1 ml de etanol acuoso al 70% de la muestra. Eliminar las bolas de metal con un imán. Vortex a fondo. </li><li> Centrifugar la muestra a 14.000 rpm durante 10 minutos para que sedimenten los residuos insolubles en alcohol que contiene el material de la pared celular. </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante por aspiración. Asegúrese de no perturbar el sedimento. </li><li> Añadir 1 ml de solución de cloroformo / metanol (1:1 v / v). Vortex a fondo para volver a suspender el pellet. </li><li> Centrifugar la muestra a 14.000 rpm durante 10 minutos y retirar con cuidado el sobrenadante por aspiración. Asegúrese de no perturbar el sedimento. </li><li> Secar la muestra utilizando un concentrador. </li></ol> 2. Solubilización de los oligosacáridos <ol><li> Para la solubilización del polisacárido particular en forma de sus oligosacáridos resuspender el pellet seco en 25μl de una solución amortiguadora. Para el formato de amonio endoglucanasa 50 mM, pH4.5, se utiliza. Añadir 0.2U de endoglucanasa. Vórtice de la suspensión y el líquido de girar. </li><li> Incubar la muestra durante 16 horas a 37 ° C en una incubadora, con agitación a 300rpm. </li><li> Eliminar el disolvente de la digestión (agua) utilizando un concentrador. </li></ol> 3. MALDI-TOF análisis de los oligosacáridos liberados <ol><li> BioRex MSZ 501 perlas de resina de intercambio catiónico se utilizan para eliminar las sales y la enzima de la muestra digerida. Estado de las cuentas mediante la colocación de una alícuota en una columna vacía y el lavado de los granos con grandes cantidades de agua. </li><li> Añadir 5-10 gotas BioRex de la muestra digerida y se secan. A continuación, añadir agua 10μl, por pequeñas cantidades de material de 5μl de agua puede ser utilizada. Sumerja las bolas en la solución de una breve gira el tubo. Incubar durante al menos 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Lugar 2μl matriz (2,5-ácido hidroxibenzoico (DHB), 10mg/ml en agua) en una placa de MALDI objetivo. Se evapora el disolvente a vacío de la matriz que conduce a cristales homogéneos matriz química. </li><li> 2μl lugar de la solución de la muestra desalada en la parte superior de los cristales de la matriz en el plato blanco. Si desea detectar un gran número de muestras sólo seguir manchado por un máximo de 3 minutos. Este plazo se asegura de que la primera muestra manchas no está seco todavía. Espere a que un 2 minutos adicionales para asegurar una buena mezcla de re-disuelven la matriz y moléculas de la muestra de oligosacáridos en la última muestra de manchas. Luego, seque la placa de destino en el vacío. La mezcla de la muestra / matriz debe cristalizar en menos de 1 minuto para permitir la cristalización homogénea. </li><li> Lugar de destino en la placa de un espectrómetro de masas MALDI-TOF. La máquina debe estar en modo reflectron positiva con una tensión de aceleración de 20000V y un retraso de 350 nm, el rango de masas seleccionadas deben ser 500 a 3.000 Da (puede cambiar depende de los oligómeros de espera). Empiezan a disparar el láser y recoger 100-200 espectros por muestra, que se compilan para generar un espectro representativo medio (Figura 2A). Iones que representan oligosacáridos específicos se pueden identificar por su masa en carga (m / z) ratio. La intensidad de iones (altura máxima) de todos los iones de interés hay que añadir hasta 100%, resultando en la abundancia relativa de cada uno de oligosacáridos en la muestra (Figura 2B). </li></ol> 4. En el análisis in situ OLIMP OLIMP también se puede utilizar directamente sobre el tejido omitiendo los pasos de preparación de la pared. A modo de ejemplo etioladas hipocotilos de Arabidopsis como fuente tejido de la planta se utilizan. Una vez más, la endolucanasa se utiliza para determinar la estructura del xiloglucano hemicelulosas. Enzimas y material de tejido puede ser sustituido en función del análisis deseado utilizando el mismo procedimiento. <ol><li> Cosecha de una planta de semillero descoloridas y colocarlo en un plato blanco vacío MALDI y dejar que la semilla seca. </li><li> Añadir 0.5μl endoglucanasa (0.4U/μl, disuelto en formato de amonio 50 mM, pH4.5) en la plántula seca en la posición deseada. Asegúrese de que la caída de la enzima toca parte de la placa de destino. </li><li> Coloque la placa de MALDI objetivo en un recipiente cerrado con una humedad de saturación para evitar que la caída de la enzima se seca. Se incuba la placa en la cámara de un6 horas a 37 ° C. </li><li> Secar la placa MALDI objetivo con el tejido de la planta y la caída de la enzima al vacío. </li><li> Añadir 0.5μl matriz (DHB, 10 mg / l) en la parte superior de cada punto enzima seca. Deje reposar por 2 minutos. </li><li> Secar la placa MALDI objetivo al vacío. </li><li> Analizar las muestras con el MALDI-TOF. Lugar de destino placa con el tejido y el punto de enzima / matriz (s) en un espectrómetro de masas MALDI-TOF. La máquina debe estar en modo reflectron positiva con una tensión de aceleración de 20000V y un retraso de 350 nm, el rango de masas seleccionadas deben ser 500 a 3.000 Da (puede cambiar depende de los oligómeros de espera). </li><li> Empiezan a disparar el láser en los cristales / de la matriz siguiente muestra a los tejidos. Asegúrese de que no se alcanza el tejido en sí, como en este caso, el tiempo de vuelo de las moléculas se apagará. Reunir alrededor de 20 a 50 espectros por punto, que se compilan para generar un espectro representativo medio (Figura 3). Iones que representan oligosacáridos específicos se pueden identificar por su masa en carga (m / z) ratio. La intensidad de iones (altura de iones) pueden ser informados y todos los iones de interés hay que añadir hasta 100%, resultando en la abundancia relativa de cada uno de los oligosacáridos en la muestra. </li></ol> 5. Resultados representante Un ejemplo de un análisis de la OLIMP xiloglucano hemicelulosas presentes en plantas de Arabidopsis se muestra en la Figura 2. Debido a las diferencias de masa de los iones y la enzima conocida bien caracterizados (endoglucanasa) especificidad de los iones pueden ser asignados a determinadas estructuras de oligosacáridos (Figura 2A). Obviamente, isómeros estructurales no pueden ser distinguidos. El supuesto básico para la determinación de la abundancia relativa de los diversos oligosacáridos (Figura 2B) es que su espectrómetro de masas factor de respuesta es muy similar a los oligosacáridos. Como se muestra aquí, la cuantificación OLIMP es altamente reproducible. Sin embargo, tenga en cuenta que la solidez del método depende en gran medida la relación señal-ruido de los iones de oligosacáridos diferentes. Por ejemplo, la contaminación con sales o menores cantidades de oligosacáridos puede disminuir esa proporción. El análisis OLIMP en el propio tejido (análisis in situ) permite el estudio de áreas muy pequeñas y definidas y consiste en la preparación de muestras muy pequeñas. En el ejemplo que aquí se presenta (Figura 3) no cualitativo (iones mismo), pero las diferencias cuantitativas (variación en la intensidad de iones) se observaron entre los brotes y las raíces de tejidos de la plántula de Arabidopsis. Permutaciones de los OLIMP método de lo que podría dar lugar a tejidos "imagen". <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagrama de flujo del procedimiento OLIMP con plántulas de Arabidopsis como toda una planta. En primer lugar, el tejido se macera y material de la pared celular se prepara (foto modificada de Fujino et al. 10). A continuación, los oligosacáridos de un polisacárido de pared en particular son liberados con una hidrolasa específica. Por último, la abundancia relativa de los oligosacáridos solubles se determinan mediante MALDI-TOF espectrometría de masas. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Abundancia relativa de los oligosacáridos xiloglucano en plántulas de Arabidopsis etioladas según lo determinado por OLIMP. A) espectro Representante xiloglucano oligosacáridos de masa, cada ion representa una estructura de oligosacáridos específicos, isómeros estructurales no pueden ser distinguidos. B) diagrama de barras correspondiente para la determinación de la abundancia relativa de oligosacáridos. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. En el análisis de OLIMP situ utilizando plantas de Arabidopsis etioladas como ejemplo. Cada gota de enzimas de digestión / (círculos de colores) pueden ser analizados de forma independiente y un espectro de masas correspondientes pueden ser obtenidos y analizados. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. OLIMP espectro del xilano hemicelulosa obtenida por digestión de material de Miscanthus hoja con una xilanasa (Megazyme).

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</ol>

El método que aquí se presenta OLIMP permite un análisis muy sensible y rápida de los polímeros presentes en las matrices extracelulares. OLIMP combina la liberación enzimática de oligómeros con posterior análisis MALDI-TOF. La generación de un espectro de MALDI-TOF toma menos de un minuto, por lo que OLIMP es adecuado para una amplia gama de aplicaciones, incluyendo de alto rendimiento estudios tales como pantallas de mutantes. OLIMP no se limita a los polisacáridos de plantas, pero potencialmente se pueden aplicar a una amplia gama de polímeros, sólo limitada por la disponibilidad de determinadas enzimas hidrolíticas. Sin embargo, una limitación de OLIMP es que la abundancia absoluta del polímero no se puede obtener. Como se mencionó antes OLIMP se puede utilizar para estudiar la estructura de una variedad de polisacáridos presentes en la matriz extracelular de una diversidad de especies. A modo de ejemplo, la Figura 4 representa un espectro OLIMP de la hemicelulosa en las principales especies de gramíneas, xilano. En este caso, el material de la pared celular derivado de la hierba templada Miscanthus fue digerido con una xilanasa.

<table><tbody><tr><td>ácido 2,5-dihidroxibenzoico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37550</td><td>10 mg/mL en agua</td></tr><tr><td>Resina BioRex MSZ 501(D)</td><td>Bio-Rad</td><td>142-7425</td><td></td></tr><tr><td>Endoglucanasa</td><td>Megazyme</td><td>E-CELTR</td><td></td></tr><tr><td>Xilanasa M6</td><td>Megazyme</td><td>E-XYRU6</td><td></td></tr><tr><td>Bolas de metal de 3 mm</td><td>Retsch</td><td>22.455.0011</td><td></td></tr><tr><td>Molino de percusión</td><td>Retsch</td><td>Mixer Mill MM400</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>Shimadzu Corporation</td><td>Axima Performance</td><td></td></tr><tr><td>Placa objetivo para MALDI</td><td>Kratos Analytical</td><td>DE4555TA</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Eppendorf</td><td>Vacufuge 5301</td><td></td></tr><tr><td>Manifold de vacío</td><td>EMD Millipore</td><td>MSVMHTS00</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de vacío</td><td>Welch Allyn</td><td>DryFast Ultra 2032</td><td></td></tr></tbody></table>

oligo perfiles misa (olimp) de polisacáridos extracelulares

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

El contacto directo de las células con el medio ambiente está mediada en muchos organismos por una matriz extracelular. Uno de los aspectos comunes de las matrices extracelulares es que contienen restos de azúcar en forma de complejo de glicoproteínas, proteoglicanos, y / o polisacáridos. Los ejemplos incluyen la matriz extracelular de las células animales y seres humanos que consiste principalmente de proteínas fibrilares y proteoglicanos o las paredes de polisacáridos basados ​​en células de plantas y hongos, y los proteoglicanos / glicolípidos paredes de las células base de bacterias. Todos estos glycostructures juegan un papel vital en la célula a la comunicación celular y celular con el medio ambiente y de señalización. Un ejemplo extraordinario complejo de una matriz extracelular está presente en las paredes de las células de plantas superiores. Su pared está hecha casi en su totalidad de los azúcares, hasta un 75% del peso seco, y se compone de los biopolímeros más abundantes presentes en este planeta. Por lo tanto, la investigación se lleva a cabo la forma de utilizar estos materiales de la mejor manera un recurso renovable de carbono-neutral para sustituir los productos petroquímicos derivados de combustibles fósiles. El principal desafío para la conversión de combustible sigue siendo la obstinación de las paredes a la degradación enzimática o química debido a la glycostructures únicos presentes en este biocompuesto único. A continuación, presentamos un método para el análisis rápido y sensible de glycostructures la pared celular vegetal. Este método de generación de perfiles Oligo Misa (OLIMP) se basa en la liberación enzimática de oligosacáridos a partir de materiales de la pared para facilitar glycosylhydrolases específicos y posterior análisis de las mezclas de oligosacáridos solubilizados con láser asistida por matriz de desorción / ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF/MS ) 1 (Figura 1). OLIMP requiere paredes de sólo 5000 células para un análisis completo, se puede realizar en el tejido mismo 2, y es susceptible de análisis de alto rendimiento 3. Mientras que la cantidad absoluta de los oligosacáridos solubilizado no se puede determinar por OLIMP la abundancia relativa de los iones de oligosacáridos diferentes pueden ser definidos a partir de los espectros de masas dando ideas acerca de la sustitución de patrón de los polisacáridos nativos presentes en la pared. OLIMP se puede utilizar para analizar una amplia variedad de polímeros de la pared, sólo limitada por la disponibilidad de enzimas específicas 4. Por ejemplo, para el análisis de polímeros presentes en las enzimas de la pared celular vegetal se encuentran disponibles para analizar el xiloglucano hemicelulosas con un xyloglucanase 5, 11, 12, 13, xilano con un 6,7 endo-β-(1-4)-xilanasa , o de polisacáridos pécticas utilizando una combinación de una poligalacturonasa y metilesterasa 8. Además, utilizando los mismos principios de OLIMP glycosylhydrolase e incluso actividades glicosiltransferasa se ​​puede controlar y decidir 9.

Una manera rápida se describe para obtener información sobre la estructura de los polisacáridos en una matriz extracelular. El método tiene la ventaja de la especificidad de glycosylhydrolases y la sensibilidad de la espectrometría de masas permite pequeñas cantidades de materiales para ser analizados. Esta técnica se puede adaptar para utilizarse directamente sobre el tejido en sí.

Oligo perfiles Misa (OLIMP) de polisacáridos extracelulares

El contacto directo de las células con el entorno está mediado en muchos organismos por una matriz extracelular. Un aspecto común de las matrices extracelulares es...

El perfilado de masa de oligómeros o experimento Olímpico mostrado aquí permite obtener información rápida sobre la estructura de los polímeros en la matriz extracelular o en la pared celular de un organismo. En este caso, las paredes celulares se preparan a partir de plántulas de plantas eliminando primero los componentes celulares con etanol al 70 %. A continuación, el polímero de pared objetivo se digiere con una hidrolasa específica, solubilizando componentes particulares de la pared en forma de oligómeros.Un enfoque alternativo consiste en digerir la pared celular con la enzima en C dos directamente sobre el tejido. La abundancia relativa de los ligamentos liberados se determina mediante espectrometría de masas MALDI y análisis estadístico. Hola, soy Marcus Polly del Instituto de Ciencias Biosostenibles aquí en la Universidad de California en Berkeley.Hola, soy Marcus Re. Y yo soy Asha Giller. También del Instituto de Ciencias Biosustentables. Los organismos están rodeados por matrices extracelulares que, dependiendo del organismo, consisten en redes complejas de polímeros.Una forma rápida y sensible de evaluar la matriz extracelular es un método que denominamos perfilado de masas oli, abreviado como oleum, que les mostraremos hoy. Este procedimiento también puede realizarse directamente sobre el tejido vegetal. Así que comencemos.Comience este procedimiento aislando la matriz extracelular o la pared celular de los tejidos vegetales. Recolecte cinco plántulas de arabidopsis o la cantidad equivalente de otro material vegetal y transfiéralas a un tubo de reacción de 1,5 mililitros. Asegúrese de que el material se coloque en el fondo del tubo.Agregue dos bolas metálicas de tres milímetros al tubo de reacción y congele rápidamente en nitrógeno líquido. Luego, muela la muestra congelada utilizando un molino de bolas durante 2,5 minutos a 25 hercios. Después de moler el material, agregue un mililitro de etanol acuoso al 70 % a la muestra.Retire las bolas de metal utilizando un imán y vortexe cuidadosamente. Este tratamiento solubiliza la mayoría de las proteínas y orgánulos celulares; centrifugue la muestra a 14.000 RPM durante 10 minutos para obtener el residuo insoluble en alcohol. Representando el material de la pared celular, aspire cuidadosamente el sobrenadante, asegurándose de no perturbar el precipitado.Añada un mililitro de solución de cloroformo-metanol al precipitado que queda en el tubo y mezcle bien mediante vortex. Para resuspender el precipitado y centrifugar, los extractos de cloroformo-metanol contienen compuestos hidrofóbicos como lípidos. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y seque completamente el precipitado utilizando un centrífugo al vacío. Esto completa el aislamiento del material de la pared celular, que ahora puede tratarse para obtener ligandos específicos.El ejemplo mostrado aquí es la solubilización de xiloglucano, la principal hemicelulosa presente en las paredes celulares de plantas dicotiledóneas como Arabidopsis. El xiloglucano es un polímero formado por un armazón de glucano que está fuertemente sustituido con otros residuos de azúcares, lo cual requiere un tratamiento especial para su solubilización. Se utiliza una endoglucanasa de origen fúngico para solubilizar esta hemicelulosa. Re-suspenda el pellet de pared celular aislado y seco en 25 microlitros de formiato de amonio 50 milimolar, pH 4,5, y añada 0,2 unidades de endoglucanasa. Vortexe la suspensión y centrifugue brevemente para recoger el líquido al fondo del tubo.Coloque el tubo en un mezclador y deje digerir las paredes durante 16 horas a 37 grados Celsius con agitación. A 300 RPM. Cuando la digestión de la pared celular aislada esté completa, elimine el disolvente utilizando una centrífuga al vacío y proceda a analizar los oligosacáridos liberados mediante espectrometría de masas; las sales y la enzima se eliminan de la muestra digerida utilizando las perlas de resina de intercambio catiónico de Biox MSD 5 0 1.Primero se condicionan las perlas colocando la cantidad necesaria en una columna vacía y lavando las perlas con grandes cantidades de agua. Añada de cinco a diez perlas catiónicas biox condicionadas a la muestra digerida y seca. Luego añada 10 microlitros de agua para cantidades menores de material.Pueden utilizarse cinco microlitros de agua. Sumerja las perlas en la solución mediante una breve centrifugación del tubo e incube durante al menos 10 minutos a temperatura ambiente mientras el digesto incuba con las perlas. Aplique dos microlitros de la matriz DHB sobre una placa objetivo MALDI.Evapore el disolvente de la matriz bajo vacío, lo que lleva a la formación de cristales químicos de la matriz; ahora, coloque dos microlitros de la solución del digesto desalado encima de los cristales de la matriz en la placa objetivo. El disolvente del punto de muestra con la matriz se evapora nuevamente bajo vacío.Es importante mantener un tiempo adecuado de mezcla del líquido de la matriz de la muestra antes de la cristalización, tal como se describe detalladamente en el protocolo escrito adjunto. Una vez que la muestra se haya secado, coloque la placa objetivo en un espectrómetro de masas con maldi. Configure el equipo en modo positivo con un voltaje de aceleración de 20.000 voltios y un retardo de 350 nanómetros.El rango de masas seleccionado para estos ligamentos de hemicelulosa es de 500 a 3000 Daltons. El rango de masas debe modificarse según el tamaño de los ligamentos esperados. Comience a disparar el láser y recolecte de 100 a 200 espectros por muestra, que se compilan para generar un espectro promedio representativo.Este es el espectro de hemicelulosa. El método de oly mostrado en este video también puede utilizarse directamente sobre el tejido vegetal, omitiendo cualquier paso de preparación de la pared. Este procedimiento de análisis in situ se demuestra en plántulas de Arabidopsis cultivadas en la oscuridad.El espécimen se coloca directamente sobre una placa objetivo y se seca al aire hasta obtener una plántula seca sobre la placa. Añada 0,5 microlitros de la mezcla adecuada de tampón enzimático en las posiciones deseadas. Asegúrese de que la gota de enzima toque parcialmente el tejido y la placa objetivo.Coloque la placa objetivo de MALDI en un recipiente cerrado con humedad saturada para evitar el secado de las gotas de enzima. Incube la placa durante 16 horas a 37 grados Celsius. Al final del período de incubación, seque el punto de enzima al vacío y agregue 0,5 microlitros de la matriz DHB líquida encima de cada punto de enzima seco.Luego seque la placa de objetivo MALDI bajo vacío. Para analizar las NC, dos muestras. Coloque la placa de objetivo, incluyendo los puntos de matriz enzimática con el espécimen de tejido, en un espectrómetro de masas para registrar los espectros de masas, utilizando los mismos parámetros que para la muestra aislada de pared celular.Comience a disparar el láser sobre la matriz. Analice los cristales de muestra junto al tejido. Asegúrese de no impactar directamente el tejido, ya que en tal caso, el tiempo de vuelo de las moléculas será incorrecto.Recopile alrededor de 20 a 50 espectros por punto y combínelos para generar un espectro promedio representativo. Este es un espectro promedio representativo de los oligosacáridos derivados del glucano HemosIL presente en los AOP. Las plántulas, las intensidades de los iones o la altura de los iones de todos los iones de interés se suman hasta un 100 %, lo que da como resultado la abundancia relativa de los diversos oligosacáridos.El resultado del método NC dos OMP proporciona resultados similares. Cada gota de digestión enzimática marcada con un círculo de color puede analizarse de forma independiente y se pueden obtener y analizar los espectros de masas correspondientes. Oola también puede realizarse en otros polímeros de la matriz extracelular si está disponible una enzima hidrolítica adecuada.Como ejemplo, este es un espectro oola de la ciliina de hemo celulosa presente en el cultivo de bioenergía. Ms.Canus para obtener los datos presentados mientras que el material de una hoja de mecampus fue digerido con la xin. Para la asignación de estructuras a los iones, consulte el protocolo adjunto.Acabamos de mostrarle el procedimiento de perfilado de masa de oligómeros en métricas extracelulares. Polymers, al realizar este procedimiento, es importante recordar que se obtienen los mejores resultados cuando se logran resultados de matriz homogénea para el análisis por OV MS. Eso es todo.Gracias por ver el video y buena suerte con los experimentos.

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