Name: Generación de recombinantes del virus de influenza a partir del ADN plásmido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-03T17:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprenda a generar virus de influenza recombinante a partir de ADN plásmido mediante transfección en células 293T y MDCK. Este método permite amplificar el virus en huevos embrionados de pollo para estudios de virología y desarrollo de vacunas.

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Los autores desean agradecer a los miembros pasados ​​y presentes en la Adolfo García-Sastre y los laboratorios de Peter Palese para el desarrollo de la influenza técnicas de genética inversa y los plásmidos. La investigación en los laboratorios de AG-S está parcialmente financiado por CRIP, un centro financiado por el NIAID de Excelencia para la Investigación y Vigilancia de Influenza (HHSN266200700010C) y por las subvenciones NIAD R01AI046954, U01AI070469 y P01AI058113. La investigación en LM-S laboratorio está financiado parcialmente por el NIAID subvención RO1AI077719.

1. Virus de la gripe de rescate de la transfección Influenza A virus pertenece a la familia Orthomyxoviridae de cadena negativa virus ARN envuelto. La gripe A genoma del virus consiste en ocho diferentes genes de ARN de polaridad negativa que codifican, al menos, 11 proteínas virales (Figura 1) 4. Nos centraremos, en este informe, en el rescate de uno de la cepa de laboratorio más común, la gripe A/PR/8/34, 5 por medio de plásmidos ambisense (PDZ), que contiene los 8 segmentos de la gripe A/PR/8/34 viral ( Figura 2). Para el rescate de los virus de la influenza recombinante de ADN plásmido, se recomienda 3 transfecciones independientes para cada virus recombinante. Si más de un virus recombinante de rescate que se intenta, escala los siguientes pasos accordantly a la cantidad de virus para ser rescatados. La transfección siguientes y el protocolo de infección se ha establecido para los 6 y placas. Una representación esquemática del protocolo se ilustra en la Figura 3. <ol><li> OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) mezcla: Preparar 250 ml del medio OptiMEM y 8.6 l de transfección por LPF2000. Se incuba durante 5-10 minutos a temperatura ambiente (TA). Mientras tanto, prepare la mezcla de transfección del plásmido. </li><li> Mezcla de transfección del plásmido: Prepare el coctel de la transfección de plásmidos en 50 l de los medios de comunicación OptiMEM. Por lo general, el uso de cada uno 1 mg de ADN plásmido por influenza rescate. Añadir 1 l de los plásmidos PDZ (a 1 mg / l) PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, y NS a un tubo que contiene 50 l de los medios de comunicación OptiMEM. </li><li> OptiMEM-LPF2000 ADN plásmido mezcla: Añadir 250 l de paso 1.1 en la mezcla de ADN del plásmido de transfección de la gripe (paso 1.2). Incubar la mezcla durante 20-30 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, preparar suspensiones de células 293T y MDCK para la transfección. </li><li> Preparación de 293T/MDCK co-cultivo: Antes de comenzar, lleve el 1X PBS, DMEM 10% de SFB al 1% los medios de comunicación PS, y la mezcla de EDTA-tripsina a 37 º C. La densidad de las células deben estar en 80-90% de confluencia del día de la transfección. Por lo general, un plato de 100 mm confluente de 293T y un plato de 100 mm confluente de células MDCK se puede utilizar para 10-12 rescates. Vamos a utilizar 250 l de células por pocillo. Ambas líneas celulares se resuspendieron en un total de 3 ml de DMEM 10% de SFB 1% PS. <ul><li> Cuidadosamente resuspender cada línea celular en 10 ml de DMEM 10% de SFB 1% PS en un tubo de centrífuga de 15 ml. Usted tendrá un tubo de células 293T y un tubo de células MDCK. </li><li> Resuspender las células 293T en 3 ml de DMEM 10% de SFB 1% PS, y cuando volvieron a suspender, entregar el 3 ml a las células MDCK para volver a suspender las células. Esto le dará la mezcla de células MDCK y 293T que se utilizará para sus compañeros de la cultura. </li><li> Añadir 250 l de las células 293T/MDCK por pozo (10-12 de 6 y pozos). </li></ul></li><li> Después de 20-30 minutos de incubación RT (paso 1.3), añadir 1 ml de DMEM 10% de SFB 1% PS a la mezcla de OptiMEM-LPF2000-influenza ADN del plásmido. </li><li> Agregue el 1,3 ml (paso 1.5) en los pozos con el 250 l de células 293T/MDCK (paso 1.4). </li><li> Agite con cuidado el 6-y-placa y dejar que la transfección de incubar durante la noche (ON) en la incubadora a 37 ° C y CO 2 al 5%. </li><li> Al día siguiente, aproximadamente 16-24 horas después de la transfección, cambiar el soporte de la transfección y se incuban las células transfectadas en Buenos Aires DMEM 0,3% al 1% PS con 1 mg / ml de TPCK-tripsina durante 48 horas. </li><li> A las 48 horas del cambio de los medios de comunicación, la transferencia del sobrenadante de las células transfectadas en un tubo de microcentrífuga. </li><li> Centrifugar el sobrenadante de cultivo de tejidos en una microcentrífuga durante 1-2 minutos, 13.000 rpm. </li><li> Infectar nuevas células MDCK en placas de 6 pocillos (plateado el día antes) o 10 días de edad huevos embrionados de pollo con 200 l de centrifugado sobrenadantes de cultivo de tejidos a partir del paso 1.10. Se incuban las células y / o los huevos a 37 ° C durante 2-3 días. <ol><li> La infección de los huevos de pollo de 10 días de edad embrionados: Todos los procedimientos para infectar los huevos de gallina embrionados se llevan a cabo en condiciones estériles. <ol><li> Vela los huevos de 10 días de edad, con una caja de luz, mirar al trasluz para ver la interfaz entre la cámara de aire y de la cavidad alantoidea. Haga una marca de lápiz en la frontera de la interfaz. </li><li> Con una aguja de la jeringa de 5 ml hacer un agujero en la cáscara del huevo. </li><li> Con una jeringa de 1 ml, infectan cada huevo con 200 l de los sobrenadantes de cultivo de tejidos a partir del paso 1.10. </li><li> Cubrir el agujero en la cáscara del huevo con cera fundida utilizando un hisopo de algodón. </li><li> Incubar los huevos infectados en 37οC durante 2-3 días. </li></ol></li><li> La infección de nuevas células MDCK: El día antes de la aprobación del sobrenadante del cultivo de tejido de la 293T/MDCK co-cultivos, prePare de 6 pocillos placa con células MDCK para llegar a 80-90% de confluencia día siguiente. Por lo general, un confluente 100 mm placa de cultivo de tejidos se puede dividir en 6-8 pozos. Lavar las células dos veces con PBS 1X, trypsinize y preparar las placas de 6 pocillos. Agite suavemente con la mano las placas con el fin de tener una distribución uniforme de las células. Cultivo de las células, ON, en la incubadora de 37 ° C, 5% de CO 2. Antes de la infección, consulte las células bajo el microscopio para confirmar una monocapa, y luego, proceder a la infección: <ul><li> Lavar las células dos veces con 1 ml de PBS 1X. </li><li> Infectar con el l 200 de centrifugado sobrenadantes de cultivo de tejidos durante 1 hora a temperatura ambiente. No deje que las pilas secas. Rock the 6-y-placa cada 10 minutos. </li><li> Después de 1 hora de la absorción viral, retire el soporte de la infección de las células MDCK y añadir 2 ml de DMEM BA 0,3% al 1% PS con 1 mg / ml de TPCK-tripsina. </li><li> A las 48-72 horas después de la aprobación, en función de la eficiencia de transfección y la carga viral, un efecto citopático (CPE) se observó en las células infectadas MDCK. CPE propone un rescate exitoso. Sin embargo, un ensayo de HA (sección 2), aún se debe realizar para confirmar la presencia del virus en el sobrenadante de cultivo de tejidos. </li></ul></li></ol></li><li> Fluido alantoideo de cosecha de huevos de gallina embrionados infectados: Todos los procedimientos para la cosecha del líquido alantoideo de los huevos infectados se llevan a cabo en condiciones estériles. Aproximadamente 8-12 ml de fluido alantoideo se puede cosechar a partir de cada huevo de 10 días de edad por el VIH. Antes de la recolección del líquido alantoideo, se incuban los huevos de gallina durante 2 horas (u ON) a 4 ° C para matar a los embriones de pollo y la coagulación de la sangre. <ul><li> Lave las cáscaras de huevo con etanol al 70% para establecer las condiciones de esterilidad. </li><li> Abrir el huevo, con cuidado, sobre la cavidad de aire golpeando con una cuchara. Retire la cáscara de huevo roto con la ayuda de fórceps. </li><li> Con una aguja de 1 ml, quitar la membrana alantoidea sin romper la yema del huevo. </li><li> Estabilizar el embrión de pollo con una espátula en la conducción de una pipeta de 10 ml en el líquido alantoideo. Recoger la mayor cantidad de líquido alantoideo como sea posible en un tubo de centrífuga de 15 ml en hielo en un cubo de hielo sin romper o el cobro de cualquiera de la yema del huevo. Utilizar un tubo de centrífuga de 15 ml por cada huevo. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 4 ° C y la transferencia del líquido alantoideo (sin gránulos de glóbulos rojos) a un nuevo tubos de 15 ml centrífuga. </li><li> Guarde los tubos que contienen el líquido alantoideo se centrifuga a 4 ° C hasta que se comprueba la presencia de virus rescatado con una hemaglutinación (HA) de ensayo. </li></ul></li></ol> 2. HA ensayo para confirmar el rescate de los virus de la influenza recombinante Ensayo de hemaglutinación (HA) se utiliza rutinariamente para detectar la presencia de virus rescatado en MDCK sobrenadantes de cultivo de tejidos y / o el líquido alantoideo de los huevos cosechados. Por otra parte, los ensayos de inmunofluorescencia (IFA) también se puede ajustar. Una vez que un ensayo identifica la presencia de virus rescatado, el virus se purificaron en placa y la composición genética del virus se confirmó mediante RT-PCR y secuenciación. La presencia del virus en el sobrenadante de cultivo de tejidos MDCK y / o en el líquido alantoideo de los huevos infectados se puede determinar macroscópicamente con HA de pollo (u otra fuente) los glóbulos rojos (RBC). La presencia del virus induce hemaglutinación de glóbulos rojos, mientras que la ausencia de virus permite la formación de una bolita roja en el fondo del pozo (Figura 4). En el caso de los virus de la influenza, se cree que aproximadamente 10 3 -10 4 unidades formadoras de placas (UFP) están obligados a dar una señal positiva en el ensayo de HA, por lo tanto, una alternativa de huida se puede realizar en paralelo con el ensayo de hemaglutinación para confirmar un resultado negativo verdadero. IFA con primaria de anticuerpos anti-influenza es más sensible que la prueba de HA, ya menos de 103 a 104 virus puede ser detectado con esta técnica. Es posible que los sobrenadantes o fluidos alantoideo que HA-negativos son positivos por el IFA. En este caso, el virus debe ser amplificada por pases, de nuevo, en células MDCK o en huevos. Fluido alantoideo y / o sobrenadantes de cultivo de tejidos a partir de ahora el segundo paso debe ser claramente positivos en el ensayo de HA. HA ensayos se llevan a cabo en el fondo en V de 96 pocillos. Negativos (por ejemplo, PBS 1X) y positivos (sobrenadantes de cultivo de tejidos y / o fluido alantoideo de una infección de virus de la influenza) muestras de control siempre debe ser incluido en cualquier ensayo de HA para validarlo. <ul><li> Dispensar 50 l de PBS 1X a cada pocillo de la V-96 pocillos de fondo de placa. </li><li> Añadir 50 l delos sobrenadantes tejido MDCK cultura y / o fluido alantoideo de los huevos infectados con el primer pozo y hacer 2 veces diluciones seriadas de los pozos siguientes. Deseche el extra de 50 l en el pozo pasado. </li><li> Añadir 50 l de 0,5% -1,0% de células rojas de la sangre de pollo (preparado en PBS 1X) a cada pocillo. </li><li> Incubar el fondo en V de 96 pocillos durante 30-45 minutos (hasta un punto rojo es visible en la parte inferior de un control negativo de la muestra PBS) sobre el hielo. Lea y interpretate los resultados como se indica en la Figura 4. </li></ul> 3. La aprobación de sobrenadantes de cultivo de tejidos Un resultado negativo en la prueba de HA puede ser el resultado de la baja eficiencia de transfección con bajos niveles de virus presente que en los sobrenadantes de cultivo de tejidos y / o fluido alantoideo. La aprobación de estas muestras de huevos frescos MDCK y / o embrionados permite la amplificación del virus (como se indica en la Figura 3) Las infecciones se llevan a cabo como se describió anteriormente en la sección 1.11.2. 4. Resultados representante Rescate con éxito el virus de la gripe se confirma por la presencia de un ensayo de HA positivo (Figura 4). Además, la existencia de ECP en las células infectadas con el sobrenadante de cultivo de tejidos o con el fluido alantoideo de los huevos se sugiere un rescate viral positiva. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Estructura virus de la gripe: el virus de la gripe está rodeado por una bicapa lipídica que contiene dos glicoproteínas virales (HA, NA) y, también, la proteína del canal de iones, M2. HA es la proteína de unión del virus, responsables de la unión de ácido siálico, que contienen los receptores. NA es responsable de la liberación viral de las células huésped. Por debajo de la bicapa lipídica, es una capa de proteína compuesta por la proteína de la matriz sobre una superficie interior, M1, que desempeña un papel en virión montaje y en ciernes y la proteína nuclear de exportación (NEP), necesarios para la exportación nuclear de ribonucleocapsids viral. El núcleo del virus es de una ribonucleoproteína (RNP) compleja, compuesta de 8 de cadena simple negativa genes ARN viral encapsulada por la nucleoproteína viral, NP. Asociadas con el complejo RNP son los virus de ARN dependiente de ARN polimerasa subunidades PA, PB1, PB2 y. Las proteínas no estructurales, NS1 y PB1-F2, codificado por el ARN segmentos NS y PB1, respectivamente, no son parte de la estructura del virión. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Influenza virus de rescate plásmidos: Los genes de la gripe ocho virus clonado en el plásmido PDZ ambisense se indican. plásmido PDZ 6, deriva de la expresión de la proteína del plásmido pCAGGs 7, es un vector plásmido bidireccional con un ser humano la RNA polimerasa I promotor y una secuencia de terminación de ratón que codifica el ARN genómico de sentido negativo, en orientación opuesta a la de la polimerasa que se unen, una polimerasa II cassette de transcripción (pollo β-actina promotor y poliA) codifica las proteínas del virus del gen viral mismo. ADNc de cada segmento viral son generados por RT-PCR con cebadores directo e inverso que contiene la restricción endonucleasa Sapi sitio y las regiones no codificadoras de cada segmento (cajas de negro en el extremo de los genes virales). El producto de PCR se clona en el PDZ digerido con Sap-I. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. De ocho a base de plásmidos influenza sistema de rescate: los plásmidos PDZ que contienen los genes 8 influenza viral son co-transfectadas, en suspensión, en las células MDCK-293T co-culturas (día 1). Veinticuatro horas después de la transfección, los medios de comunicación sin FBS, pero que contiene TPCK / tripsina se sustituye (día 2). Cuarenta y ocho horas después de cambiar los medios de comunicación, el sobrenadante de cultivo de tejidos se extrae y se usa para infectar los huevos embrionados MDCK o 10 días de edad-de pollo (día 4). 48-72 horas después de la amplificación, los sobrenadantes de cultivo de tejidos de las células infectadas MDCK o fluido alantoideo de los huevos se cosechan y se analizó la presencia de virus de HA (día 6). Si no se detecta virus, los sobrenadantes misma y / o fluidos alantoideo puede volverse a inocular en nuevas células MDCK y / o huevos embrionados. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Hemaglutinina ensayo (HA): hemaglutinación de glóbulos rojos por partículas de virus es visible macroscópicamente y es la base para detectar partículas virales en los sobrenadantes de cultivo de tejidos y / o fluidos alantoideo. Aunque el ensayo de HA no discrimina entre las partículas virales que son infecciosas y las partículas que son degradados y ya no es capaz de infectar las células, el ensayo es un buen indicador de la presencia del virus en las muestras. A) Ausencia (arriba) de la presencia (inferior) del virus en las muestras biológicas se determina por la presencia de glóbulos rojos en la parte inferior de la placa o su ausencia, respectively. B) Un resultado representativo de un ensayo de HA con niveles no detectables de virus (arriba) o presencia (inferior) del virus de la muestra.

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</ol>

Mount Sinai School of Medicine tiene derechos de propiedad intelectual en el ámbito del virus de la influenza recombinante, y AG-S es un inventor de esta propiedad intelectual.

Rescate de los virus de la influenza recombinante de ADN plásmido es un proceso simple y sencillo una vez que el protocolo se realiza rutinariamente en el laboratorio, pero en un principio, varias cosas pueden salir mal. Es imprescindible tener una buena preparación de plásmidos para generar el virus. El mantenimiento adecuado de las líneas celulares (293T y MDCK) es crucial para el éxito de un rescate viral. Tradicionalmente, un marcador genético se inserta en un gen que codifica la gripe plásmido, mediante mutagénesis...

Las líneas celulares 293T (número de catálogo CRL-11268) y MDCK (número de catálogo CCL-34) líneas de células se mantienen en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2 en DMEM 10% FBS, 1% de PS. Las células se forman a disposición de la American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 EE.UU.). Huevos embrionados de pollo Embrionados de 10 días de edad, los huevos de gallina se puede obtener de los Laboratorios Charles River, específico de abastecimiento patógeno aviar Fee (SPAFAS) Productos y Servicios aviar. Franklin Commons, 106 Ruta 32, North Franklin, CT 06254 EE.UU.. Los huevos se incuban a 37 ° C antes y después de la infección viral. Antes y después de la infección viral, los huevos son trasluz para determinar la viabilidad de los embriones. Es muy importante para buscar los huevos muertos, antes y después de la infección viral. Antes de la infección de un huevo muerto puede ser fácilmente identificables por la ausencia de vasos sanguíneos, así como la falta de movilidad del embrión. Al trasluz, los embriones vivos se mueven. Después de la infección viral de un huevo muerto (probablemente relacionada con la infección por virus de la gripe) se puede divisar por el mal aspecto de los huevos como se ve por el menor volumen y sangrienta de fluido alantoideo. Infectados con huevos son descartadas en doble bolsa de autoclave y autoclave siguiendo los procedimientos estándar. Células de pollo de glóbulos rojos (RBC) RBC de pollo se pueden comprar en las granjas Truslow, 201 Valley Road, Chestertown, MD 21620. Almacenar a 4 ° C. Para los ensayos de HA, lavado de 5 ml de RBC de pollo con 45 ml de PBS 1X en un tubo de centrífuga de 50 ml. Centrifugar durante 5 minutos a 1000 rpm, RT. Descartar cuidadosamente el sobrenadante y el uso de una dilución 1:1000 de los pellets de glóbulos rojos en PBS 1X (concentración final de 0.5 a 1.0% de glóbulos rojos). Sobrenadantes de cultivo de tejidos y fluidos alantoideo Tanto, los sobrenadantes de cultivo de tejidos y fluidos alantoideo se puede almacenar a 4 ° C por un período corto de tiempo. Después de confirmar rescate de virus, los virus de sobrenadantes de las células o el líquido alantoideo se almacenan a -80 ° C. Plásmidos Todos los plásmidos se preparan con las recomendaciones de un kit de plásmido maxi fabricante siguiente. Todos los plásmidos son alícuota en concentraciones de 1 mg / ml en ddH2O y almacenadas a -20 ° C. Para almacenamiento a corto plazo, el plásmido se puede mantener a 4 ° C. La concentración del ADN plásmido purificado se determina por espectrofotometría a 260 nm, con la pureza que se calcula utilizando la relación de 260:280 nm. Preparaciones a 1,8-2,0 260:280 nm ratios se consideran apropiados para fines de salvamento virus. Además, la concentración de plásmido y la pureza debe ser confirmada con la cromatografía en gel de agarosa. Ambisense PDZ plásmidos (6) que contiene los ocho genes virales de la gripe A/PR/8/34 (7) se ilustra en la Figura 2. Virus El protocolo descrito para el rescate de la gripe A/PR/8/34 se puede realizar bajo nivel de bioseguridad (BSL) 2 condiciones. Material contaminado, incluyendo los sobrenadantes de cultivo de tejidos y los huevos embrionados, deben ser esterilizados antes de su eliminación. Rescate de otros virus de la influenza puede requerir mayores condiciones BSL y, por tanto, las condiciones especiales / medidas de seguridad tendrá que ser seguido. Medios de cultivo y soluciones DMEM 10% de SFB 1% PS: 445 ml de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM), 50 ml de suero fetal bovino (FBS), y 5 ml de 100X penicilina / estreptomicina (PS). Almacenar a 4 ° C. Este medio se utiliza para mantener las células 293T y MDCK, así como para las transfecciones. DMEM 0,3% BA 1% PS: 495,7 ml de DMEM, 4,3 ml de 35% de albúmina bovina (BA). Almacenar a 4 ° C. Justo antes de su uso, agregar la tripsina TPCK tratada a una concentración final de 1 mg / ml. Los medios de comunicación infecciosas. Fosfato de 10 veces (PBS): 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 11,5 g de Na 2 HPO 4 .7 H 2 O, 2 g de KH 2 PO 4. Añadir ddH2O hasta 1 litro. Ajustar el pH a 7.3. Esterilizar en autoclave. Conservar a temperatura ambiente. 1X PBS: Diluir 10 veces con PBS 1:10 ddH 2 O. Esterilizar en autoclave y almacenar a temperatura ambiente.

generación de recombinantes del virus de influenza a partir del adn plásmido

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Los esfuerzos realizados por varios grupos de investigación de la gripe han sido fundamentales en el desarrollo y la mejora genética de la influenza A virus inversa. Originalmente establecida en 1999<sup&gt; 1,2</sup&gt; Plásmido basado en técnicas de genética inversa para generar virus recombinantes han revolucionado el campo de la investigación de la gripe debido a cuestiones específicas han sido contestadas por la ingeniería genética, los virus infecciosos de la gripe recombinante. Estos estudios incluyen la replicación del virus, la función de las proteínas virales, la contribución de las mutaciones específicas en las proteínas virales en la replicación viral y / o patogénesis y, también, los vectores virales con virus recombinantes que expresan proteínas extrañas influenza<sup&gt; 3</sup&gt;.

Rescate de virus de gripe A a partir del ADN plásmido es una técnica experimental básica y esencial que permite a los investigadores de la gripe para generar virus recombinantes para estudiar múltiples aspectos de la biología de los virus de la influenza, y para ser utilizado como vectores potenciales o vacunas.

Generación de recombinantes del virus de influenza a partir del ADN plásmido

Los esfuerzos de diversos grupos de investigación sobre la influenza han sido fundamentales para el desarrollo y la mejora de la genética inversa del virus de la influenza A. Originalmente...

El objetivo general del siguiente experimento es generar virus de la influenza recombinante a partir de ADN plasmídico. Esto se logra transfectando los ocho plásmidos de ADN que codifican los genes de la influenza en un cultivo celular mixto de células 2 9 3 t y MDCK, utilizando Lipectomy 2000 como segundo paso. El sobrenadante del cultivo celular se utilizará para infectar células MDCK frescas y/o huevos embrionados de pollo de 10 días de edad, los cuales amplificarán el virus presente en el sobrenadante procedente de las células transfectadas.A continuación, cosecharemos los sobrenadantes de los cultivos de tejidos y el líquido de Alan Toic de huevos embrionados de pollo infectados. Con el fin de confirmar la presencia del virus mediante un ensayo de HA, se obtienen resultados que muestran la presencia del virus basándose en la presencia de aglutinación. Hola, soy Luis Martinez Rito del Departamento de Microbiología e Inmunología de la Universidad de Rochester.Hoy les voy a mostrar cómo recuperar virus de influenza recombinantes a partir de ADN plasmídico. Utilizamos esta técnica en nuestro laboratorio para estudiar múltiples aspectos de la biología del virus de la influenza y para desarrollar vectores y vacunas potenciales. Así que comencemos.Antes de comenzar la transfección, caliente los reactivos de cultivo celular a 37 grados Celsius: solución salina tamponada con fosfato al uno por ciento, P-B-S-E-D-T-A, tripsina y medio de Eagle modificado por KO, DMEM, con 10% de suero bovino fetal, FBS, y 1% de penicilina-estreptomicina, PS. A continuación, prepare 250 microlitros de medio opti MEM y de seis a ocho microlitros de LPF 2000 por transfección e incube a temperatura ambiente durante cinco a 10 minutos. Prepare la mezcla de transfección de plásmido añadiendo un microgramo de ADN plasmídico a un tubo con 50 microlitros de medio opti MEM. Añada un microgramo de cada uno de los ocho plásmidos PDZ que contienen segmentos virales.PB dos PB uno pa ha np na m y N MS. Añada 250 microlitros de opti-MEM a temperatura ambiente con PF 2000 a la mezcla de transfección del plásmido de ADN de influenza e incube durante 20 a 30 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, prepare suspensiones de células 293T y MDCK para la transfección. La densidad de las células 293T y MDCK debe estar entre 80 y 90 % de confluencia.El día de la transfección, aproximadamente cinco veces 10 a la seis células por placa de 100 milímetros, lave las células, desprenda y centrifugue utilizando técnicas estándar de cultivo celular. REsuspenda las células 293T en tres mililitros de D-M-E-M-F-B-S-P-S. Una vez resuspendidas, añada los tres mililitros a las células MDCK para su resuspensión.Esto creará la mezcla de células 293T y MDCK que se utilizará como cultivo conjunto. Añada 250 mililitros de las células 293T-MDCK por pocillo en una placa de seis pocillos. Después de 20 a 30 minutos, agregue un mililitro de DMEM con 10 % de FBS y 1 % de PS a cada una de las mezclas de plásmidos de ADN de influenza opti M-E-M-L-P-F 2000.Luego, agregue a los pocillos con los 250 mililitros de células 2 9 3 T-M-D-C-K. Agite suavemente la placa de seis pocillos y deje que la transfección se incube durante la noche en el incubador a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, entre 16 y 24 horas posteriores a la transfección, cambie el medio de transfección e incube las células transfectadas en DMEM con 0,3% de albúmina bovina o BA y 1% de PS, que contenga un microgramo por mililitro de tripsina tratada con L tosil lado dos fenol etil clor metil cetona o TPCK durante 48 horas.Si se desea la infección de células MDCK, sembrar células MDCK frescas un día antes de la infección o dos días después de la transfección viral inicial, luego 48 horas después de cambiar el medio, transferir el sobrenadante SUP de las células transfectadas a un tubo de microcentrífuga y centrifugar. El sobrenadante de cultivo celular en una microcentrífuga durante uno o dos minutos a 13.000 RPM antes de la infección de las células MDCK. Revisar las células bajo el microscopio para confirmar una monocapa, luego proceder con la infección. Lavar las células dos veces con un mililitro de PBS al 1×.Añada 200 microlitros de sobrenadantes de cultivo celular centrifugados de pasos anteriores e incube durante una hora a temperatura ambiente. Agite suavemente la placa cada 10 minutos para evitar que las células se sequen tras una hora de absorción viral. Retire el medio de infección de las células MDCK y añada dos mililitros de DMEM con 0,3 % de BA y 1 % de PS, que contenga un microgramo por mililitro de tripsina TPCK.Se observará un efecto citopático en las células MDCK infectadas entre 48 y 72 horas después del pase. Dependiendo de la eficiencia de transfección y de la carga viral, los efectos citopáticos consisten en redondeamiento celular, muerte y desprendimiento de la superficie, entre otros. A continuación, aísle el snat de las células MDCK para el ensayo, con el fin de confirmar la presencia del virus en el cultivo de tejidos.Microcentrifugar los sobrenadantes durante uno o dos minutos a 13.000 rpm para eliminar los restos celulares y transferirlos a un nuevo tubo de centrífuga para infectar huevos embrionados de pollo. Iluminar los huevos de 10 días de edad mediante una caja de candela para observar la interfase entre la cámara de aire y la cavidad alantoidea. Marcar con un lápiz el borde de la interfase utilizando una aguja de jeringa de cinco mililitros.Haga un orificio en la cáscara del huevo con una jeringa de un mililitro. Inflija cada huevo con 200 microlitros de los sobrenadantes de cultivo de tejidos de pasos anteriores. Tape el orificio en la cáscara del huevo con cera derretida utilizando un hisopo de algodón.Incube los huevos infectados a 37 grados Celsius durante dos o tres días antes de recolectar el líquido alantoideo. Incube los huevos de gallina durante dos horas o durante la noche a cuatro grados Celsius para matar al embrión de gallina y coagular la sangre después de esto. Lave las cáscaras de los huevos con etanol al 70 % para establecer condiciones estériles.Abra el huevo cuidadosamente sobre la cavidad de aire golpeando con una cuchara. Retire las cáscaras rotas del huevo utilizando pinzas con una aguja de un mililitro. Retire la membrana alantoides sin romper la yema del huevo.Estabilice el embrión de pollo con una espátula y guíe una pipeta de 10 mililitros hacia el líquido de Alan Toic. Recoja la mayor cantidad posible de líquido de Alan Toic. De 8 a 12 mililitros en un tubo cónico de 15 mililitros sobre hielo por cada huevo.No rompa ni recoja ninguna yema de huevo. Centrifugue durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y transfiera el líquido alan tóxico a tubos cónicos frescos de 15 mililitros sobre hielo. Mantenga los tubos que contienen el líquido alan tóxico a cuatro grados Celsius hasta que se verifiquen en busca de la presencia de virus rescatado mediante un ensayo de HA. El ensayo de HA se realiza utilizando placas VBO de 96 pocillos, controles negativos con PBS uno X y controles positivos de cultivo de tejidos.Supine y/o fluido de Alan Toic. El fluido de una infección no provocada por el virus de la influenza siempre debe incluirse en el ensayo NAHA. Dispense 50 microlitros de PBS 1X en cada pocillo de la placa de fondo en V de 96 pocillos, añada 50 microlitros de los sobrenadantes de cultivo celular de MDCK y/o fluido de Alan Toic procedente de los huevos infectados al primer pocillo y realice diluciones seriadas al doble para los siguientes pocillos.Descarte los 50 microlitros adicionales del último. Añada 50 microlitros de glóbulos rojos de pollo al 0,5-1 % a cada pocillo e incube la placa de 96 pocillos con fondo en V durante 30 a 45 minutos en hielo o hasta que aparezca un sedimento rojo visible en el fondo de la muestra del control negativo con PBS. La presencia de virus en los sobrenadantes de cultivo celular MDCK y/o en el líquido alantoideo de huevos infectados puede determinarse macroscópicamente mediante la hemaglutinación de glóbulos rojos de pollo.La presencia de virus induce la hemaglutinación, mientras que la ausencia de virus permite la formación de un sedimento rojo en el fondo del pocillo. Además, la presencia de efecto citopático (CPE), como redondeo celular, muerte y desprendimiento de la superficie, entre otros, en células infectadas con sobrenadantes de cultivo tisular o con el líquido alantoideo de huevos, sugerirá un rescate viral positivo. En el caso del virus de la influenza, se requieren aproximadamente de 10³ a 10⁴ unidades formadoras de placas (pfu) para obtener una señal positiva en el ensayo de HA. Por lo tanto, puede realizarse un ensayo de inmunofluorescencia en paralelo con el ensayo de HA para confirmar un resultado negativo verdadero.Dado que la presencia de partículas virales individuales puede detectarse mediante la tinción de células infectadas con anticuerpos marcados con fluorescencia, es posible que los sobrenadantes negativos para HA o los fluidos de Alan Toic den positivo al utilizar ensayos de inmunofluorescencia. En este caso, el virus debe amplificarse nuevamente mediante empaquetamiento en células MDCK o en huevos. El fluido de Alan Toic y/o los sobrenadantes de cultivo celular procedentes del segundo pase ahora deberían dar claramente positivo en el ensayo de HA.Así que acabamos de mostrarle cómo recuperar virus de la gripe y rein. La recuperación de virus de la gripe a partir de ADN plasmídico es un proceso sencillo y directo. Uno, el protocolo se realizó originalmente en el laboratorio para la recuperación de virus de la gripe recombinantes a partir de ADN plasmídico.Recomendamos tres transfecciones independientes por virus recombinante. Si se intenta el rescate de más de un virus recombinante de influenza, ajuste los pasos en consecuencia según el número de virus a rescatar. El siguiente protocolo de transfección e infección para rescatar virus recombinantes de influenza a partir de ADN plasmídico es adecuado para placas de seis pocillos.Todos los procedimientos para recolectar fluidos tóxicos de LAN de huevos infectados se realizan bajo condiciones estériles. Eso es todo. Gracias por ver y buena suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Source: Philip, A. A., et al. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the recovery of recombinant rotavirus by transfecting plasmids encoding viral genome segments into hamster kidney cells, followed by amplification in monkey epithelial cells, enabling studies of rotavirus biology, replication, and vaccine development.

Plasmid-Mediated Generation of Recombinant Rotavirus in Cultured Cells

Este video muestra la generación de partículas similares al virus de la influenza (VLP) en un sistema de mamíferos. Al expresar tres vectores de expresión eucariotas, que codifican diferentes proteínas estructurales virales, en células huésped de mamíferos adecuadas, las proteínas virales expresadas se autoensamblan en VLP en la membrana plasmática del huésped y se liberan a través de la gemación desde la superficie celular.

Una técnica para la generación de partículas similares al virus de la gripe a través de un sistema de mamíferos

El video muestra un método para crear virus de influenza recombinantes adaptados al frío. Consiste en transfectar células humanas con plásmidos bidireccionales, seguido de una incubación a baja temperatura para producir virus adecuados para la producción de vacunas, caracterizada por una replicación reducida en condiciones más cálidas.

Generación de virus vivos atenuados recombinantes de la influenza para vacunas

Aquí se describe una forma de expresar antígenos de superficie del virus de la influenza correctamente plegadas y funcionales derivadas del nuevo virus H7N9 chino en células de insecto. La técnica se puede adaptar para expresar ectodominios de cualquiera de las proteínas de superficie virales o celulares.

Expresión de funcionales recombinante hemaglutinina y neuraminidasa Proteínas del Virus Novel H7N9 Influenza usando el sistema de expresión de baculovirus

Un protocolo rápido y modular para la generación de virus recombinantes de la vacuna que expresan las proteínas fluorescente marcadas simultáneamente usando el método de selección dominante transitoria se describe aquí.

Metodología Para La Generación Eficiente De Proteínas Del Virus Vaccinia Marcadas Fluorescentemente

Hay una falta general de conocimiento sobre cómo funcionan las vacunas. Aquí proponemos el uso combinado de genética inversa y ratones quiméricos de médula ósea para obtener información sobre las respuestas inmunitarias tempranas del huésped a las vacunas, con un enfoque especial en las células dendríticas y la inmunidad de las células T.

Administración intranasal de vacunas contra la influenza recombinante en modelos de ratón quimérico para el Estudio de la mucosa Inmunidad

A continuación, se presenta un protocolo para la síntesis de partículas similares a virus, ya sea utilizando baculovirus o sistemas de expresión de mamíferos, y la purificación ultracentrifugación. Este enfoque altamente adaptable se usa para identificar antígenos virales como objetivos de vacunas de una manera segura y flexible.

Expresión y purificación de partículas similares al virus para la Vacunación

Se describe un método por el cual identificamos residuos críticos necesarios para la Unión de humanos o murinos anticuerpos monoclonales dirigidos a la hemaglutinina viral del virus de la gripe A. El protocolo puede ser adaptado a otras glicoproteínas de superficie del virus y sus correspondientes anticuerpos neutralizantes.

Generación de variantes de Escape de neutralizar anticuerpos Monoclonal del Virus de la Influenza

Este protocolo describe un proceso experimental para producir partículas seudotipos virales infecciosas de alto valor (pp) con glicoproteínas envolventes de dos cepas de gripe A y cómo determinar su infectividad. Este protocolo es altamente adaptable para desarrollar pps de cualquier otro tipo de virus envueltos con diferentes glicoproteínas envolventes.

Producción de partículas pseudotipadas de influenza infecciosa de alto valor con glicoproteínas envolventes de virus H5N1 altamente patógenos y aviares H7N9

La generación de rotavirus recombinantes a partir del ADN plásmido proporciona una herramienta esencial para el estudio de la replicación del rotavirus y la patogénesis, y el desarrollo de vectores de expresión de rotavirus y vacunas. En este documento, describimos un enfoque de genética inversa simplificado para generar rotavirus recombinantes, incluyendo cepas que expresan proteínas fluorescentes de reportero.

Método de Genética Inversa Simplificada para Recuperar Rotavirus Recombinantes Expresando Proteínas Reportero

Este es un método para generar virus de vacuna recombinante "sin cicatrices" utilizando la selección del rango de host y la identificación visual de virus recombinantes.

Generación rápida y sin fisuras de poxvirus recombinantes utilizando el rango de host y la selección visual

Aprenda a generar virus de influenza recombinante a partir de ADN plásmido mediante transfección en células 293T y MDCK. Este método permite amplificar el virus en huevos embrionados de pollo para estudios de virología y desarrollo de vacunas.

Generación de recombinantes del virus de influenza a partir del ADN plásmido

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