Generación de recombinantes del virus de influenza a partir del ADN plásmido

Rescate de virus de gripe A a partir del ADN plásmido es una técnica experimental básica y esencial que permite a los investigadores de la gripe para generar virus recombinantes para estudiar múltiples aspectos de la biología de los virus de la influenza, y para ser utilizado como vectores potenciales o vacunas.

El objetivo general del siguiente experimento es generar virus de la influenza recombinante a partir de ADN plasmídico. Esto se logra mediante la seccionamiento de los ocho genes de la influenza que codifican plásmidos de ADN en un cocultivo de 2 9 3 t y células MDCK mediante el uso de Lipectomy 2000 como segundo paso. El supinato de cultivo de tejidos se utilizará para infectar células MDCK frescas y/o huevos embrionados de gallina de 10 días de edad, que amplificarán el virus presente en el supinato de las células transfectadas.

A continuación, cosecharemos los cultivos de tejidos, sobrenadantes y el fluido Alan Toic de huevos embrionados de gallina infectados. Con el fin de confirmar la presencia del virus mediante el uso de un ensayo de AH, se obtienen resultados que muestran la presencia del virus en función de la presencia de aglutinación. Hola, soy Luis Martínez Rito del Departamento de Microbiología e Inmunología de la Universidad de Rochester.

Hoy les voy a mostrar cómo rescatar virus de influenza recombinantes a partir de ADN plasmídico. Utilizamos esta técnica en nuestro laboratorio para estudiar múltiples aspectos de la biología del virus de la gripe y para desarrollar posibles vectores y vacunas. Así que comencemos.

Antes de comenzar el transfecto, transfecte los reactivos de cultivo celular caliente a 37 grados centígrados, una vez solución salina tamponada con fosfato, P-B-S-E-D-T-A, tripsina y DMEM de águilas modificadas con 10% de suero fetal bovino FBS y 1% de penicilina estreptomicina PS. A continuación, prepare 250 microlitros de medios opti MEM y de seis a ocho microlitros de LPF 2000 por transfección e incube a temperatura ambiente durante cinco a 10 minutos. Prepare la mezcla de transfección de plásmidos añadiendo un microgramo de ADN plasmídico a un tubo con 50 microlitros de medios opti MEM. Agregue un microgramo a cada uno de los ocho plásmidos PDZ que contienen segmentos virales.

PB dos PB uno pa ha np na m y N MS. Añada 250 microlitros de opti MEML PF 2000 a temperatura ambiente en la mezcla de transfección de plásmidos de ADN de la gripe e incube durante 20 a 30 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, prepare suspensiones de 2 9 3 T y células MDCK para la transfección. La densidad de las células 2, 9, 3 T y MDCK debe estar entre el 80 y el 90% de confluencia.

El día de la transfección, aproximadamente cinco veces 10 a las seis células por plato de 100 milímetros Las células de lavado se desprenden y giran hacia abajo utilizando técnicas estándar de cultivo celular. RESUSPENDER 2 9 3 células T en tres mililitros de D-M-E-M-F-B-S-P-S. Cuando Resus esté suspendido, entregue los tres mililitros a las células MDCK para su resuspensión.

Esto creará la mezcla de células 2 9 3 T y MDCK que se utilizará como cocultivo. Agregue 250 mililitros de las 2 9 3 células T-M-D-C-K por pocillo en una placa de seis pocillos. Después de 20 a 30 minutos, agregue un mililitro de DMEM 10%FBS 1%PS a cada una de las mezclas de plásmidos de ADN de influenza opti M-E-M-L-P-F 2000.

Luego agregue a los pocillos con los 250 mililitros de 2 9 3 celdas T-M-D-C-K. Agite suavemente la placa de seis pocillos y deje que la transfección se incube durante la noche en la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, de 16 a 24 horas después de la transfección, cambie el medio de transfección e incube las células transfectadas en DMEM 0,3% Albúmina bovina o BA 1%PS que contengan un microgramo por mililitro de L tosil lado dos fenol cloro etil metilcetona o tripsina tratada con TPCK durante 48 horas.

Si se desea una infección por MDCK, se colocan células MDCK frescas un día antes de la infección o dos días después de la transfección viral inicial, y luego, 48 horas después de cambiar el medio, transfiere el SUP natante de las células transfectadas a una centrífuga de tubo de microcentrífuga. El cultivo de tejidos se suministra en una microcentrífuga durante uno o dos minutos a 13.000 RPM antes de la infección de las células MDCK. Revise las células bajo el microscopio para confirmar una monocapa, luego proceda con la infección Lave las células dos veces con un mililitro de una vez PBS.

Añadir 200 microlitros de sobrenadantes de cultivo de tejidos centrífugos de los pasos anteriores e incubar durante una hora a temperatura ambiente. Agite la placa cada 10 minutos para evitar que las células se sequen después de una hora de absorción viral. Retire el medio de infección de las células MDCK y agregue dos mililitros de DMEM 0.3%BA 1%PS que contengan un microgramo por mililitro de tripsina TPCK.

Se observará un efecto citopático en las células infectadas con MDCK entre 48 y 72 horas después del paso. Dependiendo de la eficiencia de la transfección y de la carga viral, los efectos citopáticos consisten en la muerte del redondeo celular y el desprendimiento de la superficie, etcétera. A continuación, aísle el snat de las células MDCK para que el ensayo confirme la presencia del virus en el cultivo de tejidos.

Supernadantes Micro centrífugas durante uno o dos minutos a 13.000 RPM para eliminar los restos celulares y transferirlos a un nuevo tubo de centrífuga para infectar los huevos de gallina embrionados. Coloque una vela con los huevos de 10 días con una caja de ovoscopia ligera para ver la interfaz entre el saco de aire y la cavidad Allen Toic. Haz una marca de lápiz en el borde de la interfaz con una aguja de jeringa de cinco mililitros.

Haz un agujero en la cáscara del huevo con una jeringa de un mililitro. Infecte cada óvulo con 200 microlitros de los sobrenadantes de cultivo de tejidos de antes. Cubre el agujero de la cáscara de huevo con cera derretida con un bastoncillo de algodón.

Incubar los huevos infectados a 37 grados centígrados durante dos o tres días antes de recolectar el líquido Alan Toic. Incubar los huevos de gallina durante dos horas o toda la noche a cuatro grados centígrados para matar el embrión de gallina y coagular la sangre a continuación. Lavar las cáscaras de huevo con etanol al 70% para establecer condiciones estériles.

Abra el huevo con cuidado sobre la cavidad de aire golpeando con una cuchara. Retire las cáscaras de huevo rotas con pinzas con una aguja de un mililitro. Retire la membrana Alan Toic sin romper la yema de huevo.

Estabilice el embrión de pollo con una espátula y guíe una pipeta de 10 mililitros en el líquido Alan Toic. Recoja la mayor cantidad posible de Alan para fluido. De ocho a 12 mililitros en un tubo de centrífuga de 15 mililitros con hielo para cada huevo.

No rompa ni recoja ninguna centrífuga de yema de huevo durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y transfiera el líquido Alan Toic a tubos de centrífuga frescos de 15 mililitros en los tubos que contienen la centrífuga. Líquido Alan Toic a cuatro grados centígrados hasta que se comprueba la presencia del virus rescatado con un ensayo de HA. El ensayo de HA se realiza utilizando placas de 96 pocillos VBO, controles negativos con PBS one X y controles positivos de cultivo de tejidos.

Supinado y/o Alan Toic. El líquido de una infección por el virus de la influenza no res siempre debe incluirse en el ensayo NAHA. Dispensar 50 microlitros de PBS, una X en cada pocillo de la placa de 96 pocillos de fondo V, añadir 50 microlitros de los sobrenadantes de cultivo de tejidos MDCK y/o del fluido Alan Toic de los huevos infectados al primer pocillo y hacer diluciones en serie dobles para los pocillos siguientes.

Deseche los 50 microlitros adicionales de la última. Bueno, agregue 50 microlitros de 0.5 a 1% de glóbulos rojos de pollo a cada pocillo, incube la placa de 96 pocillos con fondo en V durante 30 a 45 minutos en hielo o hasta que esté rojo. es visible en la parte inferior de una muestra de PBS de control negativo, la presencia del virus en los sobrenadantes del cultivo de tejidos MDCK y/o en el líquido LAN toico de los huevos infectados se puede determinar macroscópicamente utilizando hemaglutinina de pollo, glóbulos rojos.

La presencia de virus induce la aglutinación del dobladillo, mientras que la ausencia de virus permite la formación de una bolita roja en el fondo del pozo. Además, la existencia de un desprendimiento de muerte por redondeo de células CPE de la superficie, etcétera, en células infectadas con los sobrenadantes del cultivo de tejidos o con el líquido LAN toico de los huevos, sugerirá el rescate viral positivo en el caso del virus de la gripe, se requieren aproximadamente 10 a las tres a 10 a cuatro unidades formadoras de placas o pfu para dar una señal positiva en el ensayo HA. Por lo tanto, se puede realizar un ensayo de inmunofluorescencia en paralelo con el ensayo de HA para confirmar un resultado negativo verdadero.

Debido a que la presencia de partículas virales individuales se puede detectar tiñendo las células infectadas con anticuerpos marcados con fluorescencia, es posible que los sobrenadantes s negativos de HA o los fluidos Alan Toic sean positivos cuando se utilizan ensayos de inmunofluorescencia. En este caso, el virus debe amplificarse empaquetando de nuevo en células MDCK o en huevos. Los sobrenadantes de cultivo de fluidos y/o tejidos de Alan Toic del segundo pasaje ahora deberían ser claramente positivos en el ensayo de HA.

Así que te acabamos de ver cómo rescatar los virus de las riendas y la gripe del ADN plasmídico. El rescate de los virus de la gripe a partir del ADN del plasma es un proceso sencillo y directo. En primer lugar, el protocolo se realiza originalmente en el laboratorio para el rescate de virus de la gripe recombinantes a partir del ADN del plasma.

Recomendamos tres transfectos independientes por virus recombinante. Si se intenta rescatar a más de un virus de la influenza recombinante, escale los pasos de acuerdo con la cantidad de virus que se van a rescatar. El siguiente protocolo de transfección e infección para rescatar virus de influenza recombinantes a partir de ADN plasmático es una habilidad para placas de seis pocillos.

Todos los procedimientos para recolectar fluidos LAN toicos de huevos infectados se realizan en condiciones estériles. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.