Name: Inducción transuretral de infección del tracto urinario ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-05T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Aprende a inducir infecciones del tracto urinario en ratones mediante inoculación transuretral con cepas bacterianas. Este protocolo permite cuantificar colonias en orina y tejidos para estudiar patogénesis y respuestas a antibióticos.

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Los autores desean agradecer a Shelly Xie y Jennifer Payne por su asistencia técnica de expertos. Este trabajo fue posible gracias a donaciones de la Sociedad de Urología Pediátrica y el Fondo de Stanford Pediatric Research.

I. Preparación de sondas uretrales <ol><li> Para cada uno de vejiga y los riñones del ratón para el muestreo, lugar 5-6 gotas de acero inoxidable (vejiga, el tamaño de 1,6 mm o de 0,9 a 2,0 mm mezcla) o granos de óxido de circonio (de los riñones, el tamaño de 0,5 mm) en un tubo de criovial, respectivamente. Autoclave de los tubos de cuentas que contienen. </li><li> Después de los tubos de enfriar a temperatura ambiente, añadir 200 microlitros de PBS estéril a cada cordón de acero inoxidable que contiene el tubo y 400 microlitros de PBS estéril a cada grano de óxido de zirconio que contiene el tubo. </li><li> Preparamos sondas uretrales según lo descrito por Hung y Hultgren 13. Autoclave un par limpio de cabeza plana de pinzas y tijeras finas (iris o similar) y permitir que los instrumentos que se enfríe a temperatura ambiente. Limpie las superficies de una campana de flujo laminar con etanol al 70%. En la capilla, un corte de 30 cm (aproximado) del segmento de tubería de polietileno. Asépticamente a cabo una aguja de calibre 30 estéril (la aguja larga 1 / 2 pulgada) en una jeringa estéril de 3. Levante un extremo de la tubería de polietileno cortada con la pinza en autoclave y deslice el tubo en la aguja hasta que se encuentra el centro. Cortar el tubo a fin de que aproximadamente 2 cm se extiende más allá de la punta de la aguja. Retirar el catéter de la jeringa y coloque en un plato de Petri estériles. </li><li> Para reducir la probabilidad de contaminación cruzada, hacemos un catéter para cada ratón. Después de todos los catéteres se hacen, esterilizarlos por la exposición en una placa de Petri descubrió que la radiación UV por lo menos durante 30 minutos. No mire directamente a las lámparas UV o exponer cualquier parte del cuerpo en la capilla mientras que las lámparas se activan. Después de la exposición UV, los catéteres se pueden almacenar a largo plazo en la placa de Petri. Se recomienda sellar el plato con Parafilm para ayudar a mantener la esterilidad. </li></ol> II. La inoculación de los animales <ol><li> Los ratones deben llegar por lo menos una semana antes de la manipulación experimental con el fin de evitar la tensión inducida por factores de confusión. Los ratones hembra que se utilizan debido a que la uretra ratón macho es extremadamente difícil para la cateterización. CBA / J es un comúnmente utilizados, UTI-susceptibles cepa de ratones endogámicos. Los ratones se debe utilizar entre 8 y 12 semanas de edad, ya que esta es la ventana de la madurez inmunológica antes de la senescencia. En el primer día del experimento, sumergir el extremo de un lazo de inoculación estéril en un vial de las acciones de bacterias congeladas. Raspar un inóculo pequeño y fuera racha en una placa de agar apropiado. En general, los uropatógenos E. coli (UPEC) y otras cepas pueden ser cultivadas durante la noche en Luria-Bertani (LB) de agar a 37 ° C en el aire ambiente. Cepas UPEC crecer como sólida, de color blanco amarillento colonias translúcidas en agar LB. De inmediato a la acción bacteriana en el congelador. Cepas de uropatógenos bacteriana puede llegar a ser menos virulento en el tiempo con cultivos repetidos en serie. Por lo tanto, se recomienda en estrías, una placa de agar fresco para cada experimento. </li><li> El día 2 del experimento, después de confirmar morfología de las colonias adecuada, elegir una sola de las colonias de las placas de agar y el lugar por lo menos en 5 cc de caldo de cultivo durante la noche. Caldo de LB se pueden utilizar para la mayoría de las cepas de uropatógenos bacteriana (37 ° C, 200 rpm en el aire ambiente). Mantenga las tapas sueltas en los tubos de caldo de cultivo para permitir la aireación. </li><li> El día 3 del experimento, tienen el 10% de caldo de cultivo primera y la cultura en el caldo de nuevo durante la noche (normalmente 37 º C y 200 rpm), para mejorar la expresión de tipo I pili. Los cultivos seriados de caldo de ayudar a optimizar uropathogenicity bacteriana, ya que el tipo I pili han demostrado ser un factor de virulencia crítica para los uropatógenos en vivo 1. Mantenga las tapas sueltas en los tubos de caldo de cultivo para permitir la aireación. </li><li> El día 4 del experimento, medir el diámetro exterior de 600 de caldo de cultivo a partir del día 3. Si no es ya conocido por la cepa bacteriana que se prueba, realizar diez veces dilución en placas en serie en al menos 7 registros (diluciones realizadas con PBS, cultivos realizados en agar LB, de 37 ° C de incubación durante la noche) para determinar la relación entre el OD y 600 ufc / ml. Como regla general, una OD 600 de 0,4-0,5 comúnmente corresponde al 1-2x10 7 ufc por 50 microlitros. Una vez que la relación entre el OD y 600 ufc / ml ha sido determinada, se puede ajustar el caldo de cultivo para el OD 600 correspondiente a la ufc deseada por ratón en 50 microlitros de PBS. Algunos trabajos han sugerido que la inoculación de 10 microlitros, en lugar de 50, lleva a un menor de reflujo en el kidneys6. Sin embargo, la mayoría de las publicaciones han reportado el uso de 50 microlitros por ratón. En general, los rangos de ufc deseado entre 10 6 y 108 ufc / ratón, pero cada combinación de la cepa bacteriana / ratón debe ser probado empíricamente en vivo. </li><li> Para ayudar a asegurar que inóculos no se anulan inmediatamente después de la instilación, los ratones deben ser privados de agua durante por lo menos 30 minutos antes de la inducción de la anestesia general. Otra maniobra clave para inducir la evacuación antes de la inducción de la anestesia por scruffing ratones y presionando suavemente el abdom menoren. Dos a un 2,5% isoflurano es una dosis de inducción segura por 8-12 semanas de edad, los ratones hembra CBA, seguido de mantenimiento de la anestesia con isoflurano 1,8-2%. </li><li> Una vez que la anestesia se logra, los ratones se colocan en posición de decúbito supino con la cabeza insertada en una ojiva conectado a isoflurano que contienen oxígeno. La parte inferior del abdomen es un masaje para evacuar la orina desde la vejiga. Si la vejiga está relativamente vacío, esta maniobra no puede producir orina. La parte inferior del abdomen y el perineo está empapado con etanol al 70%. </li><li> Un estéril jeringa de 1 cc sin aguja se utiliza para la elaboración del inóculo deseado bacteriana. A continuación, un catéter uretral estéril asépticamente colocada en la jeringa. El exceso de tubo se corta el catéter con un par de tijeras para que sólo 2.1 milímetros de tubería de permanecer distal a la punta de la aguja. Entonces, la jeringa se aprovecha y el émbolo de la depresión con la jeringa en posición vertical para eliminar todas las burbujas. Una cucharada de jalea lubricante bacteriostático se roció sobre una placa de Petri estéril o en el interior de la envoltura jeringa estéril. La punta del catéter (con jeringa adjunta) se sumerge en la jalea. Si hay varias cepas de bacterias se están probando en el mismo experimento, tenga cuidado de no utilizar la misma gota de jalea para lubricar los catéteres que contienen diferentes cepas. </li><li> El uso de un microscopio estereoscópico (0.8x de zoom 5x) para la ampliación, la capucha del clítoris con el ratón anestesiado con suavidad, tomado en la mano no dominante con un par de pinzas de dientes finos y se crió cefálica para exponer el meato uretral profundidad de color rosa ( Figura 1). La jeringa (con sonda conectada) se sujeta en la mano dominante, con un agarre lápiz y la punta del catéter está involucrado en el meato uretral en un ángulo de 45 grados. La capucha del clítoris está extendida a lo largo del eje longitudinal de la jeringa, con eficacia "carga" de la uretra en el catéter. Esta maniobra es esencial, ya que la uretra del ratón es redundante. El catéter debe introducirse con facilidad en la vejiga (hasta el centro, la figura 2), y se puede girar suavemente para ayudar a navegar los pliegues redundantes de la uretra. Una vez que el catéter se hubbed, la jeringa se puede reducir hasta que quede paralela al eje largo del mouse. La mano no dominante puede dejar las pinzas para ayudar a estabilizar la posición del catéter y la jeringa en la mano dominante se utiliza para inyectar lentamente el inóculo (por lo menos 5 segundos). Si el líquido se ve que fluye alrededor de la sonda durante la inyección, ya sea que la vejiga está llena o el catéter está en la vagina (justo caudal a la uretra). La inyección debe detenerse inmediatamente y la posición del catéter cuidadosamente examinada. Si el catéter se encontraba en la uretra, el ratón dado no deben ser incluidos en el experimento. Por otro lado, un catéter mal colocado en la vagina puede cambiar de posición y la reinyección intento. Después de la inyección, el catéter y la jeringa se retira lentamente desde el ratón. </li><li> Para reducir la probabilidad de los primeros después de la inoculación la micción, lo cual puede evacuar a las bacterias administrada y por lo tanto llevar a los niveles de infección variables, algunos investigadores mantienen los ratones bajo anestesia durante 30 minutos después transuretral inoculation10. Después de la cirugía, los ratones se recuperará en una manta térmica limpia con la observación continua para confirmar cambio de los patrones de respiración y la actividad normal. Una vez que los animales se han recuperado totalmente la capacidad de arrastre, que pueden ser devueltos a las camas-jaulas que contienen. </li></ol> III. UFC medir en el tejido infectado <ol><li> Diversas publicaciones del ratón IU han informado sobre los resultados del cultivo de 6 horas a una semana o más después de la inoculación. Los puntos de tiempo óptimo necesario determinar empíricamente para cada combinación de cepas bacterianas / ratón. Orina evacuada se obtiene de la cultura por scruffing ratón sobre una placa de Petri estéril. Orina recolectada debe mantenerse en hielo en todo momento. Múltiples intentos para obtener orina evacuada durante varias horas puede ser necesaria, ya que la micción frecuente del ratón es el volumen, baja (30 a 100 microlitros por vacío), y el estrés-dependiente. </li><li> Después de la obtención de muestras de orina anulado, sacrificamos los ratones por dislocación cervical y el isoflurano. El abdomen está abierto asépticamente. Si la muestra de orina evacuada, no se obtiene con éxito antes, una pequeña cantidad de orina a menudo pueden ser aspiradas a través de la pared de la vejiga usando una aguja de calibre 30 y una jeringa. </li><li> Uno o ambos riñones se eliminan, picada en al menos 4 piezas (cada pieza debe ser inferior a 50 microgramos) en una placa de Petri estéril, y se coloca en circonio de cuentas / PBS que contiene crioviales en el hielo. Se extirpa la vejiga, picada en al menos 4 piezas, y se coloca en acero inoxidable de grano / PBS que contiene crioviales en el hielo. El tejido / grano / PBS que contiene crioviales se colocan en una bala Blender homogeneizador y los tejidos se homogeneizan con el "8" ajuste de la velocidad durante un minuto. Es común que algunos fragmentos de tejido a permanecer después de la homogeneización. Mientras 50-100 microlitros de líquido homogeneizado puede ser una pipeta, fragmentos sólidosno son necesariamente un problema. Si el tiempo es mayor homogeneización de algunos ejemplos, es muy importante hacerlo para todos los tejidos con el fin de mantener la coherencia de la homogeneización. Utilizamos una bala Blender homogeneizador, ya que evita la posibilidad de contaminación cruzada, es más rápido que el procesamiento de muestras individuales, uno por uno usando un homogeneizador estándar, y no de manera significativa el calor de las muestras se homogeneizaron. </li><li> Por lo menos dos o tres de diez diluciones de la orina recolectada y homogeneizados de tejido debe ser hecho en una placa de microtitulación. Para los experimentos preliminares, puede ser prudente para que al menos siete de diez diluciones. La cultura hasta 100 microlitros de la orina, la vejiga y / o homogeneizados renales en agar apropiado. Dado que las muestras de orina puede ser de volumen limitado, puede ser necesario para que sus volúmenes de 100 microlitros antes de realizar diez diluciones. Si esto es necesario, la dilución inicial (antes de las diez veces dilución) tendrá que tenerse en cuenta en los cálculos finales de los rendimientos de las bacterias. Nosotros preferimos el cultivo de la UPEC en el azul de metileno o eosina-agar MacConkey (una noche de incubación a 37 ° C), ya que estos medios son selectivos para los microorganismos gramnegativos. Cepas UPEC crecen en agar MacConkey como centro umbilicadas, de color rojo-rosado colonias debido a su capacidad de fermentar la lactosa. </li><li> Después del cultivo durante la noche, contar con la UFC por cada plato. Para las muestras diluido en serie, la dilución de la placa que contiene 50 a 100 colonias se considera los resultados más exactos. "Volver" calcular ufc por los tejidos, por miligramo de tejido, o por ml. </li></ol> IV. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Meato uretral (tejido de color rosa oscuro) expuesta por el levantamiento de capuchón del clítoris cefálica con fórceps (más allá de la parte superior de la foto) <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Sondaje uretra. El clítoris bífido se puede ver justo por encima de la sonda. <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Vejiga ufc cuenta dos días después de la infección transuretral de 8 semanas de edad CBA / J ratones con uropatógenos E. coli. Vejigas se homogeneizaron y se determinó ufc / ml mediante siembra de diluciones en serie en agar MacConkey. Diamantes indican ufc / ml en los ratones individual, barra horizontal indica la mediana ufc / ml.

<ol><li>Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+type+1+pilus+expression+in+Escherichia+coli+to+ascending+urinary+tract+infections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice.</a> Infect Immun. 55, 373-380 (1987).</li>
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</ol>

La inducción de la infección del tracto urinario del ratón mediante la inoculación de bacterias transuretral es un procedimiento de larga data, pero técnicamente exigente 11. Colgado y Hultgren ha publicado recientemente una excelente revisión de las técnicas transuretral de infección del tracto urinario del ratón 13. En este trabajo, se intenta ilustrar los puntos más importantes de este enfoque experimental. Los principiantes pueden practicar su técnica mediante la re...

<table><tbody><tr><td>Tubos criogénicos, 2.0 ml de polipropileno (sin tapas)</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>640201</td><td></td></tr><tr><td>Tapas para tubos criogénicos, con anillo &amp;rsquo;O&amp;rsquo;</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>440011-N</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador tipo bala (Bullet Blender)</td><td>Next Advance</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de óxido de circonio (0,5 mm)</td><td>Next Advance</td><td>ZROB05</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de acero inoxidable (1,6 mm)</td><td>Next Advance</td><td>SSB16</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de perlas de acero inoxidable (0,9-2,0 mm)</td><td>Next Advance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>Ratones CBA/J, hembras de 8-12 semanas de edad</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000656</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 4,3 mM, KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 1,4 mM)</td><td>EMD Millipore</td><td>EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;) EM-5108-1 (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td></td></tr><tr><td>Agar LB</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caldo LB</td><td>EMD Millipore</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano (Aerrane)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>NDC 10019-773-60</td><td></td></tr><tr><td>Asas de inoculación</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-601</td><td></td></tr><tr><td>Polvo de agar eosina-azul de metileno (EMB)</td><td>Himedia Laboratories</td><td>MM022-500G</td><td></td></tr><tr><td>Polvo de agar MacConkey</td><td>Difco Laboratories</td><td>212123</td><td></td></tr><tr><td>Polvo de agar LB</td><td>Difco Laboratories</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno no radiopaco Intramedic, PE10 [dimensión interna 0,28 mm (0,011 pulgadas); dimensión externa 0,61 mm (0,024 pulgadas)]</td><td>BD Biosciences</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de calibre 30, 1/2 pulgada</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa tuberculina de 1 ml con punta deslizante (Slip-Tip)</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 3 ml con sistema de bloqueo Luer-Lock</td><td>BD Biosciences</td><td>309585</td><td></td></tr></tbody></table>

inducción transuretral de infección del tracto urinario ratón

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Cepas bacterianas uropatógena de interés se cultivan en agar. En general, los uropatógenos<em&gt; E. coli</em&gt; (UPEC) y otras cepas pueden ser cultivadas durante la noche en Luria-Bertani (LB) de agar a 37 ° C en el aire ambiente. Cepas UPEC crecer como colonias de color blanco amarillento translúcido en LB agar. Tras la confirmación de la morfología de las colonias apropiadas, las colonias solo entonces se escogió para ser cultivadas en caldo. Caldo de LB se pueden utilizar para la mayoría de cepas bacterianas uropatógenos. Dos culturas de serie, la noche de caldo de LB se pueden emplear para aumentar la expresión de pili de tipo I, un factor de virulencia bien definidas para las bacterias uropatógenos. Caldos de cultivo se diluye a la concentración deseada en tampón fosfato salino (PBS). De ocho a 12 semanas de edad ratones hembra se colocan bajo anestesia con isoflurano y transuretral inoculadas con las bacterias mediante tubos de polietileno cubiertas de 30 jeringas de calibre. Inóculos típico, el cual debe ser determinada empíricamente para cada combinación de cepas bacterianas / ratón, son 10<sup&gt; 6</sup&gt; A 10<sup&gt; 8</sup&gt; UFC por ratón de 10 a 50 microlitros de PBS. Tras el periodo de infección deseado (un día a varias semanas), las muestras de orina y la vejiga y los riñones tanto se cosechan. Cada órgano es picado, colocado en PBS, y se homogeneizaron en un homogeneizador Bala Azul. Homogeneizados de orina y el tejido se diluyen en serie en PBS y se cultivaron en agar apropiado. Al día siguiente, las unidades formadoras de colonias se cuentan.

Este video se muestran los métodos para inducir transuretral infecciones del tracto urinario ratón y cuantificar la extensión de las infecciones resultantes.

Inducción transuretral de infección del tracto urinario ratón

Las cepas bacterianas uropatogénicas de interés se cultivan en agar. Generalmente, la E. coli uropatogénica (UPEC) y otras cepas pueden cultivarse durante la noche en...

El objetivo general de este procedimiento es inducir una infección del tracto urinario en ratones mediante vía transuretral. Esto se logra primero cultivando cepas bacterianas de interés y diluyendo los cultivos a la concentración deseada. El segundo paso del procedimiento consiste en inocular transuretralmente la vejiga del ratón con las cepas bacterianas de interés.El tercer paso del procedimiento consiste en recolectar muestras de orina y extraer riñones y vejigas. El paso final del procedimiento es la inoculación de placas con orina y muestras homogenizadas de riñón y vejiga. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestren una infección exitosa del tracto urinario basada en la presencia de colonias bacterianas en las muestras en placas.Hola, soy Michael Shea y bienvenidos a mi laboratorio en el Departamento de Urología de la Escuela de Medicina de la Universidad de Stanford. Yo soy Annu ti, también del laboratorio de Shea. Hoy les mostraremos un procedimiento para la cateterización transuretral en ratones.Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la inducción de infecciones del tracto urinario en ratones. Comencemos. En una cabina de flujo laminar, corte un tramo de tubo de polietileno de 30 centímetros de longitud y sujete una aguja de calibre 30 a una jeringa estéril de tres centímetros cúbicos.Utilice pinzas estériles para tomar un extremo del tubo cortado y deslícelo sobre la aguja hasta que llegue al cono. Corte el tubo de modo que aproximadamente dos centímetros sobresalgan más allá de la punta de la aguja. Esto ayuda a prevenir lesiones en los ratones durante la cateterización.Retire el catéter de la jeringa y colóquelo en una placa de Petri estéril. Prepare un catéter por cada ratón que se vaya a infectar. Esterilice los catéteres mediante irradiación ultravioleta durante al menos 30 minutos.Selle un plato con perfil para mantener el catéter estéril durante el almacenamiento a largo plazo. Inocular una placa de agar apropiada con un inóculo de stock congelado de la cepa bacteriana de interés. Aquí, se siembra un inóculo de *E. coli* uropatógena o UPEC para su crecimiento nocturno a 37 grados Celsius.Seleccione colonias individuales con la morfología adecuada, que en el caso de UPEC son colonias sólidas de color amarillento y translúcidas en agar LB, y colóquelas en al menos cinco mililitros de caldo líquido para un cultivo nocturno a 37 grados Celsius con agitación a 200 revoluciones por minuto. Añada el 10 % del primer cultivo de caldo a medio fresco y hágalo crecer durante la noche. Nuevamente, para potenciar la expresión de las fimbrias de tipo uno, asociadas a la patogénesis urinaria in vivo, mida la DO 600 del cultivo para determinar el número de unidades formadoras de colonias.UFC abreviadas por mililitro de cultivo. Diluya el cultivo con PBS 1X estéril de modo que la concentración final esté entre 10 a la sexta y 10 a la octava UFC en 10 a 50 microlitros, para asegurar que las inoculaciones no sean eliminadas inmediatamente. Después de la instalación, prive a los ratones de agua durante 30 minutos antes de la anestesia, sujete al ratón por la nuca y presione suavemente el abdomen inferior para favorecer la micción.Coloque el ratón anestesiado boca arriba, con la cabeza insertada en un cono nasal conectado a isoflurano que contiene oxígeno. Masajee el abdomen para evacuar cualquier orina residual de la vejiga. Utilice un atomizador para humedecer el abdomen inferior y el perineo con etanol al 70 %.A continuación, utilice una jeringa estéril de un mililitro para aspirar el inóculo bacteriano. Fije un catéter estéril preparado en la jeringa. Use tijeras para cortar el tubo de modo que sobresalga solo uno a dos milímetros más allá de la punta de la aguja.Esto ayuda a prevenir lesiones en los ratones durante la cateterización; golpee la jeringa y presione el émbolo. Para eliminar las burbujas de aire, lubrique el catéter sumergiéndolo en una pequeña cantidad de gel lubricante bacteriostático. Asegúrese de usar una cantidad diferente de gel para cada cepa bacteriana que se probará bajo un microscopio estereoscópico de disección.Utilice pinzas con dientes finos en la mano no dominante para agarrar suavemente el capuchón clitoriano y levantarlo a fin de exponer la uretra ATU de color rosa intenso en la mano dominante. Sujete la jeringa con el catéter acoplado. Con un agarre tipo lápiz, introduzca la punta del catéter en la uretra ATU a un ángulo de 45 grados con respecto al abdomen del ratón.En el plano sagital medio. Estire el capuchón clitoriano a lo largo del eje largo de la jeringa. Cargue eficazmente la uretra en el catéter.El catéter debe deslizarse fácilmente hacia la vejiga si es necesario. Gire suavemente el catéter para ayudar a navegar por los pliegues redundantes de la uretra. Cuando el catéter esté colocado hasta el conector, baje la jeringa en posición paralela al abdomen del ratón.Suelte la pinza y utilice la mano no dominante para estabilizar el catéter y la jeringa. Inyecte lentamente el inóculo durante al menos cinco segundos. Si se observa líquido desplazándose alrededor del catéter durante la inyección, la vejiga está llena o el catéter se encuentra en la vagina.Detenga la inyección y examine la posición del catéter. Reposicione el catéter en la uretra si es necesario. Después de la inyección, retire lentamente el catéter.Mantenga al ratón bajo anestesia durante media hora después de la inoculación. Para reducir el riesgo de micción después de la cirugía, permita que el ratón se recupere sobre una manta térmica limpia con observación continua para confirmar el retorno de patrones normales de respiración y actividad. Una vez que se haya recuperado completamente y tenga la capacidad de arrastrarse, devuelva al ratón a una jaula con cama.Dependiendo de la combinación de cepas bacterianas y de ratón, puede transcurrir entre seis horas y una semana para que se desarrolle una infección completa. Para obtenerla, coloque un plato de Petri estéril sobre hielo para cada ratón infectado durante varias horas. Sujete al ratón por la nuca sobre el plato para recoger orina destinada al cultivo.50 microlitros de orina deberían ser suficientes. Aspire la orina con una pipeta y colóquela en un tubo pequeño para centrífuga, tápelo y mantenga la orina sobre hielo. Bajo el microscopio estereoscópico, coloque un ratón sacrificado en posición supina sobre una bandeja de disección.Rocíe el abdomen con etanol al 70%. Utilice tijeras para realizar una incisión de tres a cuatro centímetros en la piel y en la pared abdominal subyacente. Si es necesario, use alfileres para retraer la pared abdominal lejos del contenido abdominal.Si intentos anteriores de recolección de orina no tuvieron éxito, utilice una aguja de calibre 30 y una jeringa para aspirar la orina directamente a través de la pared de la vejiga. Use pinzas y tijeras para extraer los riñones. Trasládelos a una placa de Petri estéril y píquelas cada uno en al menos cuatro trozos, de aproximadamente dos a tres milímetros de tamaño cada uno.Transfiera cada fragmento de riñón a un tubo criogénico que contenga cinco o seis esferas estériles de óxido de circonio de 0,5 milímetros y 400 microlitros de PBS estéril. Mantenga las muestras de riñón en hielo. Utilice pinzas y tijeras para extraer la vejiga.Pique la vejiga utilizando el mismo método que para los riñones. Transfiera cada fragmento de la vejiga a un vial criogénico que contenga cuentas de acero inoxidable de 1,6 milímetros y 200 microlitros de PBS estéril, y mantenga los tubos sobre hielo. Coloque los viales en un homogeneizador tipo bullet blender y homogenice el tejido a la velocidad ocho durante al menos un minuto.Es común que algunos fragmentos de tejido permanezcan después de la homogenización. Todas las muestras deben homogenizarse durante el mismo período de tiempo en una placa de microtitulación. Realice diluciones seriadas de diez veces de la orina recolectada y del homogenado de tejido con hielo.Dispersión con PBS frío. La dilución finalizada. Incubar las placas adecuadas con agitador durante la noche a 37 grados Celsius.Las UFC por órgano, miligramo de tejido o mililitro de orina pueden calcularse retroactivamente a partir del número de colonias en cada placa. Hemos estado utilizando estas técnicas para estudiar cómo las mutaciones en las respuestas bacterianas al estrés afectan la capacidad de la UPEC para causar ITU in vivo, así como para resistir los antibióticos administrados a los ratones infectados. Esta tabla muestra la capacidad de la UPEC de tipo silvestre para infectar la vejiga de ratón tras la inoculación transuretral.Acabamos de mostrarle cómo inducir infecciones del tracto urinario transversalmente en ratones. Al realizar este procedimiento, es importante cateterizar a los ratones con suavidad. La técnica adecuada se asocia con una cateterización sencilla, aunque puede requerir práctica.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Luyts, N., et al. Seguimiento longitudinal de infecciones urinarias y su tratamiento en ratones mediante imagen bioluminiscencia. J. Vis. Exp. (2021).Este vídeo muestra la inducción y seguimiento de la infección urinaria en un modelo murino utilizando E. coli bioluminiscente inyectada en la vejiga, donde ocurren adhesiones, invasión y replicación intracelular bacteriana. La luz emitida por el operón bioluminiscente sirve como marcador en tiempo real de la carga bacteriana durante la...

Visualización de la infección del tracto urinario en un modelo murino usando bioluminiscencia

Fuente: Conover, M. S., et al., J. Establecimiento y caracterización de ITU y CAUTI en un modelo murinho. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo muestra el procedimiento para ensamblar e implantar un catéter transuretral en una ratona, seguido de la inoculación bacteriana para establecer la infección urinaria asociada al catéter e investigar las interacciones hospedador-patógeno mediadas por biofilm.

Infección urinaria asociada a catéter en un modelo murino

Fuente: Conover, M. S. et al., Establecimiento y caracterización de ITU y CAUTI en un modelo murinho. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demuestra la detección de comunidades bacterianas intracelulares (IBCs) en tejido de vejiga de ratón infectado con Escherichia coli que expresa β-galactosidasa. Tras la fijación tisular, permeabilización y tinción con X-gal, los IBC aparecen como puntos azules bajo un microscopio disecante, confirmando la invasión bacteriana durante la infección urinaria.

Visualización de comunidades bacterianas intracelulares en una vejiga de ratón infectada

En este video, describimos la técnica para la administración intravesical de bacterias uropatógenas para generar un modelo de infección del tracto urinario en ratones. Este modelo se puede utilizar para comprender la propagación de la infección bacteriana uropatógena dentro del sistema urinario y los mecanismos que determinan la susceptibilidad a las infecciones urinarias.

Modelo de Generación de Infección del Tracto Urinario: Una Técnica para Administrar Bacterias Uropatógenas en Ratón para Desarrollar un Modelo de Infección del Tracto Urinario

Este video demuestra el establecimiento de una infección uropatógena por Escherichia coli en una vejiga de ratón hembra a través de la instilación de catéter transuretral. Las bacterias inyectadas establecen con éxito una infección del tracto urinario dentro de la vejiga, proporcionando una valiosa plataforma para estudiar las enfermedades asociadas a la atención médica relacionadas con el tracto urinario.

Cateterismo transuretral e inoculación bacteriana para generar un modelo de infección del tracto urinario en ratones machos

Establecimiento de un modelo de infección del tracto urinario en ratones hembra

La capacidad de modelar infecciones del tracto urinario (ITU) es crucial para poder comprender la patogénesis bacteriana y generar el desarrollo de nuevas terapias. El objetivo de este trabajo es demostrar modelos murinos de ITU experimentales e ITU asociadas a catéteres que recapitulen y predigan los hallazgos observados en humanos.

Establecimiento y caracterización de IU y ITUAC en un modelo de ratón

El modelo establecido de cateterización transuretral de ratones permite el estudio de patologías de vejiga, incluyendo infección del tracto urinario, pero puede realizarse solamente en las hembras. Un nuevo modelo de hombre instilación transuretral, presentado aquí, permitirá que la investigación en un área marcada por fuertes diferencias clínicas y epidemiológicas entre los sexos.

Infección del tracto urinario en un modelo Animal pequeño: cateterización transuretral de ratones machos y hembras

La instilación transuretral es un procedimiento difícil y no ha sido bien descrita en la literatura. El objetivo de este manuscrito es describir una técnica para la inserción transuretral de un catéter para la administración intravesical de líquidos con sustancias activas en la vejiga o la próstata en ratones macho adultos.

Procedimiento transuretral instilación en ratón macho adulto

Se demuestra un modelo de ratón de inoculación transuretral uropatógena de E. coli (UPEC) para establecer reservorios latentes de vejiga intracelular y posterior exposición vesical a G. vaginalis para inducir itunica urinaria RECURRENTE de UPEC. También se ha demostrado la enumeración de bacterias, la citología de orina y la fijación y procesamiento de la vejiga in situ para la microscopía electrónica de barrido.

Infección recurrente del tracto urinario por Escherichia coli desencadenada por la exposición de la vejiga de Gardnerella vaginalis en ratones

Este manuscrito describe la administración intravesical de bacterias uropatógenas con un lux operon para inducir una infección del tracto urinario en ratones y el posterior análisis longitudinal in vivo de la carga bacteriana mediante imágenes de bioluminiscencia.

Seguimiento longitudinal de las infecciones del tracto urinario y su tratamiento en ratones utilizando imágenes de bioluminiscencia

Aprende a inducir infecciones del tracto urinario en ratones mediante inoculación transuretral con cepas bacterianas. Este protocolo permite cuantificar colonias en orina y tejidos para estudiar patogénesis y respuestas a antibióticos.

Inducción transuretral de infección del tracto urinario ratón

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