Name: Respuesta de células vivas a la estimulación mecánica estudiados por microscopía óptica integrada la Fuerza Atómica y (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprende a estudiar la respuesta celular a la estimulación mecánica utilizando microscopía óptica integrada con fuerza atómica en células vivas. Este método permite observar en tiempo real la reorganización del citoesqueleto de actina.

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Plásmido vinculina-GFP fue un regalo de Kenneth Yamada, Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial, Bethesda, Maryland, y la actina mRFP plásmido fue un regalo de Michael Davidson, Florida State University, Tallahassee, Florida. Este trabajo fue apoyado por el premio de su carrera NSF # 0747334 y AHA-Nacional SDG # 0835205N a Andreea Trache.

1. Panorámica del sistema de microscopio integrado El sistema de microscopio que se utiliza para estos estudios se ha descrito en detalle 1. En pocas palabras, un invertido Olympus IX-81 con microscopio TIRF adjunto (Olympus, Center Valley, PA) se combina con la CSU-22 Yokogawa cabeza de lectura (Yokogawa Electric Inc, Japón). Un microscopio de fuerza atómica Bioscope SZ (Veeco Instruments Inc, Santa Barbara, CA) está montado en la parte superior del microscopio invertido óptica, y todo el sistema se coloca en la parte superior de una tabla de grados de investigación óptica (Newport, Irvine, CA). El montaje confocal compuesta desde el escáner girar el disco, rueda de filtros externos y su cámara EMCCD (Roper Científico-Fotometría, Tucson, AZ) están rígidamente conectados con una placa base de aluminio colocado en una plataforma de silicio necesario para la amortiguación de las vibraciones. El escáner confocal se conecta con el microscopio a través de una brida con un collar de recauchutados que se puede separar de un microscopio AFM durante las mediciones, de tal manera que ninguna vibración del escáner girando el disco va a afectar a las mediciones de AFM. Un láser de argón-criptón (Spectra Physics, Mountain View, CA) se utiliza como fuente de excitación para ambos TIRF y modos de microscopía confocal, y se puede acoplar alternativamente en dos fibras ópticas que ofrecen el láser para la unión TIRF o el cabezal, respectivamente . Dos equipos de control del sistema: Slidebook software controla la formación de imágenes ópticas y software Nanoscope controla la AFM. 2. Cultivo de células Las células vivas que expresan GFP construcciones dirigidas contra las proteínas específicas se deben colocar en un plato con fondo de cristal de cultivo celular 24 horas antes de la prueba de estimulación mecánica. En el día del experimento sustituir el medio de cultivo celular con rojo fenol libre de soporte. La placa de cultivo celular se monta en la etapa de AFM con un collar magnético. 3. AFM Consejo Preparación y Microscopio Set-up La punta del AFM personalizar con una de 2 micrones biotinilado de perlas de vidrio se lavaron cinco veces con DPBS y luego se incubaron 5 minutos con avidina (1 mg / ml), se lavan nuevamente con DPBS cinco veces, y luego se incubaron 5 minutos con 1 mg / ml biotinilado fibronectina. La punta se lavaron cinco veces más en el extremo 2, montado en el escáner AFM, y luego la falda protectora de silicona se coloca alrededor de la titular. Ajuste el microscopio para ver vídeo para alinear la punta del AFM en el centro del campo de visión. Alinear la palanca óptica colocando el rayo láser en el extremo de la viga, y luego cambiar el objetivo a un objetivo de gran aumento adecuado de imágenes de células individuales. La constante del resorte de la punta tiene que ser determinada antes de comenzar el experimento. Este parámetro se mide utilizando el método de ajustar las características térmicas disponibles en el software Nanoscope. Interruptor de la cámara de vídeo a la cámara EMCCD para permitir la formación de imágenes de fluorescencia. A continuación, seleccione una celda y poner la punta del AFM en contacto con la celda en cuestión. Después de un tiempo de 20 minutos de espera, que es necesaria para una fuerte adhesión focal para formar en el punto de AFM de contacto con la superficie de la célula, el procedimiento de estimulación mecánica se inicia. 4. La estimulación mecánica de las células vivas TIRF 3-4 imagen será el método de elección para la visualización y cuantificación de las adhesiones focales, y girando el disco de imagen confocal 5 será utilizado para la visualización del citoesqueleto de actina a través del cuerpo celular. La AFM 6 se utilizará en el modo de imagen de contacto con el líquido. Una imagen TIRF o confocal de la célula se adquirió antes de iniciar el procedimiento de estimulación mecánica. La estimulación mecánica será inducida por la sonda de AFM funcionalizada que se mueve hacia arriba en pasos discretos cada 3-5 minutos durante un período de tiempo (1 a 1,5 horas). La célula reactiva de respuesta se grabará continuamente en software Nanoscope como una serie de imágenes de altura, cada línea de la imagen que representa una unidad de tiempo de 1 seg. Mientras que la adquisición de los datos de AFM, el operador controla en todo momento el z-posición de la punta del AFM para determinar el momento adecuado para la atracción de la próxima. Después de cada estimulación mecánica es posible adquirir una imagen TIRF o confocal de la celda en Slidebook software, mientras continua la adquisición de datos AFM. Las imágenes ópticas pueden ser procesados ​​off-line para crear películas que muestran la reorganización del citoesqueleto de actina y las adhesiones focales. Además, cada imagen puede ser procesada para determinar cuantitativamente área de la celda, la zona de proteínas específicas, y analizar la morfología de las células en general. Al final del experimento se retira la punta del AFM de la célula y la sensibilidad de la punta del AFM se medirá en el software Nanoscope. El experimento es muy sensible al ruido! Cualquier conversación o un microscopio de tocar durante la experiment debe ser evitado. Para minimizar el ruido en las mediciones de AFM, el confocal girar el disco debe ser disociado del microscopio. El tiempo de espera para formar una fuerte adhesión focal entre la superficie de la célula y la punta del AFM puede variar dependiendo del tipo de células utilizadas y el revestimiento de la matriz en la punta. 5. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2072/2072fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Mismas células del músculo liso vascular (CMLV) transfectadas con actina-mRFP y vinculina GFP-fue fotografiada por: (A) AFM en la superficie celular apical (B) TIRF en la superficie de células basales, y (C) girando el disco de microscopía confocal en todo el cuerpo de la célula. La imagen confocal se muestra como la proyección máxima de una pila de 3-D. Solapamientos entre las buenas y AFM TIRF o girar imágenes de disco confocal se muestran en (D) y (E), respectivamente. Tamaño de la imagen es de 64 x 50 micras. <img src="/files/ftp_upload/2072/2072fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. A las CMLV transfectadas con actina-mRFP fue estimulado mecánicamente por la AFM y la imagen haciendo girar el disco microscopía confocal Las flechas indican las fibras de actina que:. (A) polimerizar / espesar, (b) despolimerizar / desaparecer, o (c) paquete en conjunto debido a la reestructuración de la actina. Las líneas blancas discontinuas representan la punta del AFM encima de la celda. La imagen a tamaño 91 x 91 micras.

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</ol>

Adherencias citoesqueleto 07.10 y focal 11-16 son estructuras dinámicas que reúnen, se dispersan y vuelta como las células migran o responder a la fuerza mecánica 17. Tienen funciones importantes en la regulación del crecimiento celular, la supervivencia, y la expresión génica. Conocer su distribución específica y la dinámica proporciona una mejor comprensión de cómo se comunican las células con la matriz y entre ellos. Este sistema nuevo microscopio es ampli...

<table><tbody><tr><td>Punta de AFM</td><td>Novascan Technologies, Inc.</td><td></td><td>Bola de borosilicato de 2 micrones, 0,01 N/m, superficie con biotina</td></tr><tr><td>Avidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9275</td><td>1 mg/mL en DPBS</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4759</td><td>1 mg/mL</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>21600-051</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transfección Amaxa para células musculares lisas</td><td>Lonza Inc.</td><td>VPI-1004</td><td></td></tr><tr><td>Placas MatTek con fondo de vidrio</td><td>MatTek Corp.</td><td>P60G-1.5-30-F</td><td>Placas Falcon estériles de 60 mm con cubreobjetos de vidrio no. 1.5 en el fondo</td></tr></tbody></table>

respuesta de células vivas a la estimulación mecánica estudiados por microscopía óptica integrada la fuerza atómica y

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

Para entender el mecanismo por el cual las células vivas sentido las fuerzas mecánicas, y cómo responden y se adaptan a su medio ambiente, una nueva tecnología capaz de investigar el comportamiento de las células a nivel subcelular con alta resolución espacial y temporal se ha desarrollado. Por lo tanto, un microscopio de fuerza atómica (AFM) se integró con la reflexión total interna de fluorescencia (TIRF) microscopía y el disco de giro rápido (FSD) microscopía confocal. El sistema integrado es ampliamente aplicable a través de una amplia gama de estudios moleculares dinámicos en cualquier célula viva adherente, permitiendo una imagen óptica directa de las respuestas celulares a la estimulación mecánica en tiempo real. Reorganización significativa de los filamentos de actina y adhesiones focales se demostró debido a la estimulación mecánica local en la superficie celular apical que los cambios inducidos en la estructura celular en todo el cuerpo celular. Estas técnicas innovadoras que proporcionan nueva información para la comprensión de la reestructuración de células vivas y dinámicas, en respuesta a una fuerza mecánica. Un protocolo detallado y un conjunto de datos representativos que muestran la respuesta de células vivas a la estimulación mecánica se presentan.

Este documento tiene como objetivo instruir al lector en la operación de una fuerza integrada atómica microscopio óptico de imagen para la estimulación mecánica de las células vivas en la cultura. Un protocolo de paso a paso se presenta. Un conjunto representativo de datos que muestra la respuesta de células vivas a la estimulación mecánica se presenta.

Respuesta de células vivas a la estimulación mecánica estudiados por microscopía óptica integrada la Fuerza Atómica y

Para comprender el mecanismo mediante el cual las células vivas detectan las fuerzas mecánicas, y cómo responden y se adaptan a su entorno, se requiere una nueva tecnología capaz de...

El estudio de la respuesta celular en tiempo real a la estimulación mecánica se lleva a cabo primero cultivando células que expresan proteínas de fusión GFP en placas con fondo de vidrio durante 24 horas. El segundo paso consiste en recubrir la punta de microscopio de fuerza atómica (AFM) con fibronectina biotinilada. Luego, la punta de AFM funcionalizada se pone en contacto con la superficie celular para permitir la formación de una adhesión focal fuerte alrededor de la punta de AFM, lo que permite la manipulación directa del citoesqueleto de actina mediante un enlace entre la matriz, las integrinas y la actina, entre la punta recubierta de fibronectina y la célula.El paso final consiste en estimular mecánicamente la célula viva mediante un movimiento ascendente controlado de la punta de microscopía de fuerza atómica (AFM), de modo que la fuerza vertical se aplique en el punto de contacto con la célula sin romper la adhesión focal fuerte. En última instancia, los resultados muestran que las células responden a la estimulación mecánica reforzando su adhesión al sustrato e induciendo la reorganización del citoesqueleto de actina, tal como se registra mediante imágenes ópticas de fluorescencia en tiempo real. Hola, soy Andrea Trake, profesora asistente del Departamento de Biología de Sistemas y Medicina Traduccional en el Centro de Ciencias de la Salud Texas A&M.Hola, soy Sum Lim. Soy investigador posdoctoral en el Departamento de Biología de Sistemas y Medicina Traduccional del Centro de Ciencias de la Salud de Texas A&M. Hoy les mostraremos un procedimiento para estudiar la reestructuración celular adaptativa ante la estimulación mecánica.Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para investigar en tiempo real la remodelación del citoesqueleto en células vivas de músculo liso vascular. Así que comencemos. Para estos estudios, se utiliza un microscopio invertido Olympus IX 81 con un sistema de fluorescencia por reflexión interna total o accesorio TIRF, combinado con una cabeza de escaneo CSU 22 de Yokogawa.Un microscopio de fuerza atómica tipo bio scope SZ está montado encima de un microscopio óptico invertido. Todo el sistema está colocado sobre una mesa óptica de investigación y ha sido descrito previamente en detalle. Este microscopio integrado utiliza dos cámaras electrónicas multiplicadoras de carga acopladas, también conocidas como EM-CCD.Uno es para imágenes de césped y el otro para imágenes confocales. El conjunto confocal, que consta del escáner de disco giratorio, rueda portafiltros externa y una cámara E-M-C-C-D, está montado sobre una placa base de aluminio colocada encima de una almohadilla de silicona necesaria para la amortiguación de vibraciones. Todo el conjunto confocal se conecta al microscopio mediante una brida con un collar roscado.Por lo tanto, el ensamblaje puede desacoplarse del microscopio durante la microscopía de fuerza atómica o mediciones de FM para evitar vibraciones provenientes del escáner de disco giratorio. Se utiliza un láser de argón criptón como fuente de excitación tanto para el modo de imagen de turf como para el modo confocal. El láser puede acoplarse a cualquiera de las dos fibras ópticas, que dirigen el láser al accesorio de turf o a la cabeza de escaneo confocal.Dos computadoras controlan el sistema. Una utiliza un software de libro de diapositivas, que controla la imagen óptica, y la otra un software de nanoscopio, que controla el AFM. Veinticuatro horas antes del experimento de estimulación mecánica, coloque células vivas que expresan constructos GFP dirigidos contra proteínas específicas en un platillo de cultivo celular con fondo de vidrio. En el día del experimento, reemplace el medio de cultivo celular con un medio libre de rojo de fenol.Dado que un experimento de MF es muy sensible al ruido, evite hablar o tocar la mesa óptica o el microscopio durante el experimento para minimizar el ruido. En las mediciones de MF, desacople el disco giratorio confocal del microscopio. El experimento comienza colocando el recipiente de cultivo celular sobre la platina de MF con un collar magnético para fijar el recipiente a la platina magnética del microscopio.El cantiléver en forma de V en la sonda de FM está personalizado con la microperla de vidrio biotinilada. El cantiléver puede verse fácilmente mediante el microscopio. La perla está pegada en el extremo mismo del cantiléver, y aquí es donde se debe aplicar gota a gota la solución de recubrimiento.Para preparar una sonda FM para el experimento, primero monte la punta en el soporte de vidrio y luego coloque el soporte de vidrio en el soporte de la mesa para recubrir la punta. Lave la punta dejando caer cuidadosamente 10 microlitros de solución salina tamponada con docos fosfato o DPBS en el extremo mismo de la punta, y luego use una toallita kim para secar la punta. Repita este procedimiento cinco veces después de lavar con DPBS a una concentración de un miligramo por mililitro.Agitación en solución. Añadir gota a gota sobre la punta. Dejar que la punta incube durante cinco minutos tras el recubrimiento con avadon.Lave la punta cinco veces más con DPBS. A continuación, reticule la fibronectina biotinilada sobre el avadón añadiendo una solución de un miligramo por mililitro, gota a gota sobre la punta e incubando durante cinco minutos.Finalmente, lave nuevamente la punta cinco veces con DPBS, dejando la última gota en la punta. Una vez que la punta haya sido preparada, coloque la punta en un escáner de FM. Después de colocar la punta de FM, coloque una falda protectora de silicona alrededor del soporte.Luego configure el microscopio para la visualización de video. A continuación, alinee una punta de FM en el centro del campo de visión. Establezca la palanca óptica colocando el haz láser en el extremo mismo del cantiléver.Luego, cambie el objetivo al objetivo de alta magnificación adecuado para la imagen individual de células. A continuación, coloque la célula, que será estimulada mecánicamente, en el campo de visión y elija un lugar donde la punta de FM deba posarse sobre la superficie celular. Finalmente, baje la punta de FM hasta que haga contacto con esa célula específica.Después de poner la punta en contacto con la célula, espere aproximadamente 20 minutos. Esto permite que se forme una adhesión focal fuerte en el punto de contacto de la MF sobre la superficie celular. Tras el período de espera, puede comenzar el procedimiento de estimulación mecánica para preparar el experimento de estimulación mecánica.Cambie de cámara de video a cámara E-M-C-C-D para permitir la visualización de las células fluorescentes durante la obtención de imágenes. Luego, adquiera una imagen inicial de la célula en reposo. Utilice microscopía de disco giratorio y microscopía vocal para la visualización del citoesqueleto de actina en todo el cuerpo celular.Por el contrario, utilice el césped para visualizar las adhesiones focales y estimular la célula. Utilice el cantiléver para aplicar un movimiento controlado hacia arriba en pasos discretos cada tres a cinco minutos. Durante la adquisición de los datos de microscopía de fuerza atómica (AFM), es importante que el operador supervise constantemente el voltaje de la posición Z del piso para determinar el momento adecuado para el polo vertical.Simultáneamente a la adquisición de datos de FM, registre una imagen confocal o de mosaico de la célula después de cada tracción vertical utilizando el software Slide Book. Finalmente, retire la punta de FM de la célula al completar el experimento de estimulación. Una célula de músculo liso vascular transfectada con actina MRFP y vcul.Se realizó la imagen de GFP mediante un microscopio de fluorescencia (FM) en la superficie apical de la célula. La misma célula fue imagen mediante turf en la superficie basal de la célula. Aquí se superponen las dos imágenes.Se adquirió también una imagen de la misma célula mediante microscopía confocal de disco giratorio a lo largo de todo el cuerpo celular, y se muestra como una proyección máxima de un conjunto tridimensional. Se observa una buena superposición entre las imágenes de MF-A y las imágenes confocales de disco giratorio. Esta célula de músculo liso vascular transfectada con actina MRFP fue estimulada mecánicamente mediante la MF-A e imagenada por microscopía confocal de disco giratorio.Los errores indican fibras de actina que muestran una notable reestructuración tras una estimulación de FM. Algunas fibras de actina se polimerizan mientras que otras se despolimerizan debido a la estimulación mecánica; otras fibras de actina se agrupan en haces. Debido a la reestructuración de la actina, acabamos de mostrarle cómo estimular mecánicamente una cultura de células vivas utilizando EFM mientras se registra simultáneamente la reorganización del citoesqueleto mediante métodos de imagen óptica.Al realizar este procedimiento, es importante recordar que un experimento de FM es extremadamente ruidoso y sensible. Eso es todo. Gracias por verlo y buena suerte con sus mediciones.

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