Respuesta de células vivas a la estimulación mecánica estudiados por microscopía óptica integrada la Fuerza Atómica y
4 de octubre de 2010
Este documento tiene como objetivo instruir al lector en la operación de una fuerza integrada atómica microscopio óptico de imagen para la estimulación mecánica de las células vivas en la cultura. Un protocolo de paso a paso se presenta. Un conjunto representativo de datos que muestra la respuesta de células vivas a la estimulación mecánica se presenta.
El estudio de la respuesta celular en tiempo real a la estimulación mecánica se lleva a cabo mediante el crecimiento de células que expresan primero proteínas de fusión GFP en placas con fondo de vidrio durante 24 horas. El segundo paso es recubrir la punta A FM con fibronectina biotinilada. A continuación, la punta de FM funcionalizada se pone en contacto con la superficie de la célula para permitir que se forme una fuerte adhesión focal alrededor de la punta de FM A, lo que permite la manipulación directa del citoesqueleto de actos a través de un enlace de actina de integrina de matriz entre la punta recubierta de fibronectina y la célula.
El paso final es estimular mecánicamente la célula viva mediante un movimiento ascendente controlado de la punta A FM, de modo que la fuerza vertical se aplique en el punto de contacto de la célula sin romper la fuerte adhesión focal. En última instancia, los resultados muestran que las células responden a la estimulación mecánica reforzando su unión al sustrato e induciendo la reorganización del citoesqueleto de actina, según lo registrado con imágenes ópticas de fluorescencia en tiempo real. Hola, soy Andrea Trake, profesora asistente en el Departamento de Biología de Sistemas y Medicina Traslacional en el Centro de Ciencias de la Salud de Texas a y m.
Hola, soy Sum Lim. Soy becario postdoctoral en el Departamento de Biología de Sistemas y Medicina Traslacional en el Centro de Ciencias de la Salud de Texas a&m. Hoy te mostraremos un procedimiento para estudiar la remodelación celular adaptativa a la estimulación mecánica.
Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para investigar la remodelación del citoesqueleto en tiempo real en células vivas del músculo liso vascular. Así que comencemos. Para estos estudios, se utiliza un microscopio Olympus IX 81 invertido con una fluorescencia de reflexión interna total o un accesorio de césped combinado con un cabezal de escaneo CSU 22 Yokogawa.
Un microscopio de fuerza atómica SZ está montado en la parte superior del microscopio óptico invertido. Todo el sistema está montado sobre una mesa óptica de grado de investigación y se ha descrito previamente en detalle. Este microscopio integrado utiliza dos cámaras E-M-C-C-D de dispositivo acoplado de carga multiplicadora de electrones cuantitativos.
Uno es para imágenes de césped y el otro para imágenes confocal. El conjunto confocal, que está compuesto por el escáner de disco giratorio, la rueda de filtro externo y una cámara E-M-C-C-D, está montado sobre una placa base de aluminio colocada encima de una almohadilla de silicona necesaria para la amortiguación de vibraciones. Todo el conjunto confocal se conecta con el microscopio a través de una brida con un collar roscado.
Por lo tanto, el conjunto se puede desacoplar del microscopio durante la microscopía de fuerza atómica o las mediciones FM para evitar la vibración del escáner de disco giratorio. Un láser de argón criptón se utiliza como fuente de excitación para los modos de imagen de césped y confocal. El láser se puede acoplar a cualquiera de las dos fibras ópticas, que entregan el láser al accesorio de césped o al cabezal de escaneo confocal.
Dos, las computadoras controlan el sistema. Uno utiliza el software de libro de diapositivas, que controla las imágenes ópticas y el otro el software de nanoscopio, que controla el A FM 24 horas antes del experimento de estimulación mecánica colocó células vivas que expresan construcciones de GFP dirigidas contra proteínas específicas en una placa de cultivo celular con fondo de vidrio. El día del experimento, reemplace el medio de cultivo celular con un medio libre de rojo de fenol.
Debido a que un experimento FM es muy sensible al ruido, evite hablar o tocar la mesa óptica o el microscopio durante el experimento para minimizar el ruido. En las mediciones de una FM, desacople el disco giratorio confocal del microscopio. El experimento comienza montando la placa de cultivo celular en una etapa FM con un collar magnético para fijar la placa a la etapa del microscopio magnético.
El voladizo en forma de V de la sonda A FM se personaliza con el cordón de vidrio biotinilado de dos micras. El voladizo se puede ver fácilmente con el microscopio. El cordón se pega en el extremo del voladizo, y aquí es donde se debe aplicar la solución de recubrimiento gota a gota.
Para preparar una sonda FM para el experimento, primero monte la punta en el soporte de vidrio y luego coloque el soporte de vidrio en el soporte de mesa para recubrir la punta. Lave la punta goteando cuidadosamente 10 microlitros de solución salina tamponada con fosfato docos o DPBS en el extremo de la punta, y luego use una toallita kim para secar la punta. Repita este procedimiento cinco veces después de lavar con DPBS a un miligramo por mililitro.
Ávido en solución. Gota a gota sobre la punta. Deje que la punta se incube durante cinco minutos después del recubrimiento de avadon.
Lave la punta cinco veces más con DPBS. A continuación, reticular la fibronectina biotinilada en el avadon añadiendo una solución de un miligramo por mililitro. Deslizar gota a gota sobre la punta e incubar durante cinco minutos.
Por último, vuelve a lavar la punta cinco veces con DPBS dejando la última gota en la punta. Una vez que se haya preparado la punta, móntela en un escáner FM. Después de montar la punta FM, coloque un faldón protector de silicona alrededor del soporte.
A continuación, configure el microscopio de visualización de vídeo. A continuación, alinee la punta FM en el centro del campo de visión. Ajuste la palanca óptica colocando el rayo láser en el extremo del voladizo.
A continuación, cambie el objetivo al objetivo de gran aumento adecuado para la obtención de imágenes de una sola célula. A continuación, lleve la célula, que será estimulada mecánicamente, al campo de visión y elija un lugar donde la punta A FM deba aterrizar en la superficie de la célula. Finalmente, baje la punta FM hasta que toque esa celda específica.
Después de poner la punta en contacto con la celda, espere aproximadamente 20 minutos. Esto permite que se forme una fuerte adhesión focal en el punto de contacto FM en la superficie de la célula. Después del período de espera, el procedimiento de estimulación mecánica puede comenzar a prepararse para el experimento de estimulación mecánica.
Cambie de la cámara de video a la cámara E-M-C-C-D para permitir la visualización de las células fluorescentes para la obtención de imágenes. A continuación, adquiera una imagen inicial de la célula en reposo. Utilice un disco giratorio y microscopía vocal para la visualización del acto en el citoesqueleto en todo el cuerpo celular.
Por el contrario, use el césped para visualizar las adherencias focales para estimular la célula. Utilice el voladizo para aplicar un movimiento ascendente controlado en pasos discretos cada tres a cinco minutos. Al adquirir los datos A FM, es importante que el operador monitoree constantemente el voltaje de la posición Z del piso para determinar la sincronización adecuada para el poste vertical.
Simultáneamente a una adquisición de datos FM, registre una imagen confocal o de césped de la célula después de cada tirón vertical utilizando el software de libro de diapositivas. Finalmente, retire la punta FM de la célula al finalizar el experimento de estimulación. Un transfect vascular de células musculares lisas con actina, MRFP y vcul.
La GFP se visualizó utilizando un FM en la superficie de la célula apical. La misma célula se fotografió utilizando césped en la superficie de la célula basal. Aquí las dos imágenes se superponen.
También se adquirió una imagen de la misma celda utilizando un disco giratorio confocal en todo el cuerpo de la celda y se muestra como una proyección máxima de una pila 3D. Se muestran buenos solapamientos entre las imágenes Confocal A FM y el disco giratorio. Su célula de músculo liso vascular transfectada con MRFP de actina fue estimulada mecánicamente por el A FM y se obtuvieron imágenes mediante microscopía confocal de disco giratorio.
Los errores indican fibras actuantes que muestran una reestructuración notable ante una estimulación FM. Algunas fibras de acción polimerizan mientras que otras se despolimerizan debido a la estimulación mecánica, otras fibras de acción se agrupan. Debido a la reestructuración de actos, acabamos de mostrarle cómo estimular mecánicamente una cultura de venta de vidas usando EFM mientras registramos simultáneamente el reordenamiento de CY usando métodos de imágenes ópticas.
Al realizar este procedimiento, es importante recordar que un experimento FM es extremadamente ruidoso, sensible. Así que eso es todo. Gracias por ver y buena suerte con sus declaraciones.
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Descripción general
Este estudio presenta un protocolo para utilizar un microscopio integrado de fuerza atómica e imagen óptica con el fin de estimular mecánicamente células vivas en cultivo. La metodología incluye una guía paso a paso y muestra datos representativos sobre las respuestas de células vivas a la estimulación mecánica.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología celular
- Estimulación mecánica
- Imagenología de células vivas
Antecedentes
- Comprender la respuesta celular a los estímulos mecánicos es fundamental en biología celular.
- La microscopía de fuerza atómica permite la manipulación precisa de células.
- La imagenología de células vivas proporciona información en tiempo real sobre los procesos celulares.
- La adhesión focal desempeña un papel clave en la adhesión celular y la respuesta.
Objetivo del estudio
- Instruir en el manejo de un microscopio especializado para estudios con células vivas.
- Mostrar los efectos de la estimulación mecánica sobre células vivas.
- Proporcionar un protocolo detallado para que los investigadores puedan replicar el estudio.
Métodos Utilizados
- Las células que expresan proteínas de fusión GFP se cultivan en placas de vidrio.
- La punta del microscopio de fuerza atómica (AFM) está recubierta con fibronectina biotinilada.
- La punta de AFM funcionalizada se utiliza para crear adhesiones focales con la superficie celular.
- La estimulación mecánica se aplica mediante un movimiento ascendente controlado de la punta de AFM.
Resultados principales
- Las células reforzaron su adhesión al sustrato tras la estimulación.
- Se observó la reorganización del citoesqueleto de actina en respuesta a fuerzas mecánicas.
- La imagen de fluorescencia en tiempo real capturó las respuestas celulares dinámicas.
- El protocolo demostró con éxito la eficacia de la técnica.
Conclusiones
- El microscopio integrado estudia eficazmente las respuestas de células vivas a estímulos mecánicos.
- Este método puede mejorar la comprensión de la mecánica celular y la adhesión.
- Las aplicaciones futuras podrían incluir la exploración de diversos tipos celulares y condiciones.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Comprender cómo las células vivas detectan y se adaptan a las fuerzas mecánicas es fundamental para reducir los riesgos en la validación de dianas en las vías de mecanotransducción. Este enfoque integrado de imagen óptica y microscopía de fuerza atómica permite la resolución en tiempo real a nivel subcelular de la dinámica del citoesqueleto y de las adhesiones, proporcionando una mayor confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al vincular estímulos mecánicos con la reorganización estructural. El método facilita la reducción de riesgos mecanicistas mediante la visualización directa del remodelado del actinio inducido por la fuerza y el refuerzo de las adhesiones focales, aportando información clave para las decisiones de avance o interrupción en la selección preclínica de dianas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas al revelar cómo la estimulación mecánica desencadena la reorganización del citoesqueleto de actina y el refuerzo de las adhesiones focales.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de objetivos mediante la observación directa de la dinámica citoesquelética dependiente de la fuerza en células adherentes vivas.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al vincular entradas mecánicas con salidas estructurales, reduciendo la ambigüedad en la participación de objetivos mecanosensibles.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo posteriores mediante el establecimiento de protocolos reproducibles para la estimulación mecánica y la obtención de imágenes en tiempo real.
- Valor operativo: Aborda la estandarización de ensayos y la obtención de resultados cuantitativos mediante el movimiento controlado de la punta de microscopía de fuerza atómica (AFM) y lecturas de fluorescencia sincronizadas.
- Escalabilidad: Destaca la reutilización de la plataforma en diferentes tipos de células adherentes, lo que permite la evaluación confiable de compuestos en campañas de cribado de mecanobiología.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Traductiva: Analiza la relevancia de la enfermedad mediante la demostración del acoplamiento estructural apical-basal, en el que la estimulación apical induce una reorganización en todo el cuerpo celular.
- Avance Ajustado al Riesgo: Describe la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al capturar respuestas dinámicas que informan el alineamiento de biomarcadores en las vías de mecanotransducción.
- Reducción Mecanicista del Riesgo: Se centra en el valor predictivo de reducción de riesgos al mostrar cómo la aplicación de fuerza conduce a la polimerización, despolimerización y agrupación de actina, aclarando así el mecanismo de acción.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la comprobación de hipótesis hasta la identificación de compuestos activos, facilitando la comprensión mecanicista antes del cribado de compuestos.
- Biología del Descubrimiento: Explica cómo el método apoya la comprobación de hipótesis mediante la aplicación de estimulación mecánica controlada y la observación en tiempo real de la remodelación del citoesqueleto.
- Selección: Describe la preparación del ensayo a través de la formación reproducible de adhesiones focales y la obtención de imágenes cuantitativas de la dinámica de la actina utilizando modalidades TIRF y confocal.
- Análisis: Destaca mediciones como los eventos de polimerización/despolimerización de actina y los cambios en la intensidad de las adhesiones focales, que permiten comparar estados estimulados frente a estados en reposo.
- Investigación Traducional: Relaciona el método con la continuidad preclínica al mostrar cómo la estimulación mecánica apical propaga cambios estructurales a través del cuerpo celular, lo cual es relevante para la transmisión de fuerzas a nivel tisular.
- Reutilización Empresarial: Presenta el método como una capacidad reutilizable para estudiar dianas mecanosensibles en modelos celulares vasculares, epiteliales y mesenquimales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos, reducción de la ambigüedad mecanicista en las vías de mecanotransducción.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad de la estimulación mecánica y del imagenado multimodal.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas en programas de mecanobiología.
- Impacto en la cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo, basadas en la observación directa de la adaptación celular inducida por fuerzas.
Consideraciones de Implementación
- Conocimientos científicos especializados necesarios en el manejo de AFM, imagenología de células vivas y dinámica del citoesqueleto.
- Los equipos necesarios incluyen un sistema integrado de AFM-TIRF-confocal con amortiguación de vibraciones y dos cámaras EM-CCD.
- La estandarización entre equipos requiere el cumplimiento estricto del protocolo en cuanto a la funcionalización del punzón, la formación de adhesiones focales y el momento de la estimulación.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen la variación en la rigidez del sustrato, las proteínas de recubrimiento y los tipos celulares, manteniendo al mismo tiempo la especificidad de la estimulación apical.
- Las limitaciones prácticas incluyen la sensibilidad al ruido durante las mediciones con AFM y la necesidad de condiciones ambientales controladas para minimizar la deriva.
