Focalización de estructuras profundas del cerebro con microinyecciones de entrega de medicamentos, vectores virales, o trasplantes de células
1 de diciembre de 2010
En este artículo, se muestra un método para fabricar agujas capilar de vidrio con una luz de 50 micras. Esta técnica reduce significativamente el daño cerebral, minimiza la difusión pasiva de las drogas y permite una segmentación precisa en el cerebro de roedores.
El objetivo general de este procedimiento consiste en realizar microinyecciones altamente precisas en estructuras cerebrales profundas para la administración de fármacos, vectores virales o trasplantes celulares. Esto se logra primero produciendo agujas de capilar de vidrio con una luz de 50 micrómetros. El segundo paso del procedimiento es llenar hasta un 50 % la aguja con aceite mineral por capilaridad e insertar el émbolo por el extremo más ancho del tubo.
El tercer paso del procedimiento consiste en cargar la aguja con la sustancia o la suspensión celular que desea inyectar. El paso final del procedimiento es introducir la punta de la aguja e inyectar la sustancia a un flujo muy bajo en una estructura cerebral profunda. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran una localización muy precisa de sustancias en el cerebro mediante inyecciones microscópicas con un tubo capilar de vidrio.
Hola, soy Oscar González del Laboratorio de Neurociencia en la Escuela de Psicología de la Universidad de Colima, México. Hoy les mostraremos un procedimiento para realizar microinyecciones con un tubo capilar de vidrio con el fin de administrar fármacos en el cerebro de ratón. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar células madre neurales adultas.
Así que comencemos. El uso de agujas de capilar de vidrio con un lumen de 50 micrómetros para microinyecciones en el cerebro reduce significativamente el daño cerebral, minimiza la difusión pasiva de fármacos y permite un posicionamiento preciso en el cerebro de roedores. Antes de realizar las microinyecciones, es necesario construir las agujas de vidrio.
Comience colocando el tubo de vidrio capilar en un electrodo de alta resistencia de un tirador de micropipetas. A continuación, encienda el electrodo del tirador de micropipetas. Para calentar el centro del tubo de vidrio y ablandar localmente el tubo, estire el tubo de vidrio a lo largo de su eje longitudinal una distancia inicial de tres a cinco milímetros, suficiente para provocar una reducción del diámetro del tubo de vidrio en la zona localizada.
Continúe estirando el tubo de vidrio hasta que se rompa. Repita estos pasos para crear dos agujas idénticas de un solo canal. Ahora coloque las agujas de vidrio en una microherrería.
Un ángulo de 30 grados es suficiente para biselar la punta. Finalmente, coloque las agujas bajo el microscopio y verifique que ambas tengan el diámetro interno correcto. Para la mayoría de los fármacos hidrófilos, un diámetro interno de 30 a 50 micrómetros es ideal con las agujas construidas.
Veamos cómo usarlos para microinyecciones. Para comenzar, llene la aguja construida con aceite mineral desde el extremo más ancho. Deje que el aceite mineral entre por capilaridad hasta que alcance aproximadamente el 50 % de la longitud del tubo capilar.
Coloque grasa de alto vacío alrededor del extremo más ancho de la aguja e introduzca el émbolo a través de ella. Empuje suavemente el aceite mineral hasta que salga una pequeña gota por la punta de la aguja de vidrio. Ahora sujete firmemente la aguja en el portaagujas del microinyector y comience a preparar el animal para la inyección.
Primero, coloque una almohadilla calefactora en el soporte estereotáxico para animales para mantener la temperatura corporal del animal a 37 grados Celsius. Afeite la cabeza del ratón anestesiado y luego colóquelo y asegúrelo en el dispositivo estereotáxico. Utilizando barras para las orejas y un sujetador para los dientes, use una hoja de bisturí para incisionar la piel desde las orejas hasta la línea craneal Lambda.
Pulir el cráneo con un hisopo de algodón para secarlo y retirar la piel del campo quirúrgico. A continuación, utilice la punta de la aguja de vidrio para señalar el vértice de la sutura bgma y establecer allí la posición inicial de la inyección. Ahora establezca el punto sobre el cráneo que se perforará moviendo los ejes X e Y del dispositivo estereotáxico sobre el cráneo.
Utilizando un microtaladro de investigación, taladre cuidadosamente orificios en las coordenadas seleccionadas con pinzas finas. Retire con cuidado la capa ósea más profunda y rompa la membrana dura madre. Observará algo de líquido cefalorraquídeo escapándose.
Para confirmar que la aguja puede pasar por los orificios perforados, baje lentamente la aguja de vidrio utilizando el eje Z del dispositivo estereotáxico. Ahora aspire un microlitro del fármaco que se va a inyectar y colóquelo sobre un pequeño trozo de parafina. Coloque la parafina sobre el cráneo.
Aspire el fármaco girando la rueda del microinyector mientras verifica a través del microscopio que el líquido ascienda hacia la aguja de vidrio. Retire la película de parafina y restablezca la coordenada cero. Ahora mueva la aguja hasta las coordenadas seleccionadas y baje el soporte hasta que la punta de la aguja de vidrio toque suavemente la superficie del cerebro, y establezca la coordenada Z en cero.
Introduzca la aguja de vidrio en el parénquima cerebral a la profundidad deseada. Inyecte el fármaco lentamente a una velocidad de aproximadamente un nanolitro por segundo. Una vez inyectado el volumen deseado, deje que el fármaco se difunda en el parénquima durante dos minutos y luego proceda a retirar la aguja de forma suave y lenta.
Finalmente, pegue la herida quirúrgica y retire al animal del dispositivo estereotáxico. Coloque al animal en una jaula precalentada para la recuperación de la anestesia. Ahora mostraremos algunos resultados de microinyección.
Se inyectó lisofosfatidilcolina o lyin en el cuerpo calloso, lo que produce desmielinización de los haces de sustancia blanca, con el fin de minimizar la lesión cerebral provocada por la aguja de vidrio. Solo se inyectaron 20 litros de lyin. La desmielinización se representa por la ausencia de expresión de la proteína básica de la mielina en los haces de sustancia blanca; se obtiene una inyección muy precisa y un trayecto de aguja muy estrecho minimiza la lesión cerebral.
Acabamos de mostrarle cómo construir agujas de vidrio para realizar microinyecciones en estructuras cerebrales profundas. Al realizar este procedimiento, es importante recordar tener todos los equipos y materiales listos para su uso en la sala quirúrgica. Eso es todo.
Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.
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Descripción general
Este artículo presenta un método para crear agujas de capilar de vidrio con un lumen de 50-μm, lo que permite microinyecciones precisas en estructuras cerebrales profundas. Esta técnica minimiza el daño cerebral y reduce la difusión pasiva de fármacos, permitiendo una administración dirigida en modelos de roedores.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Técnicas de microinyección
- Sistemas de administración de fármacos
Antecedentes
- Las microinyecciones son esenciales para administrar sustancias directamente en el cerebro.
- Los métodos tradicionales pueden causar daño cerebral significativo y una entrega ineficiente de fármacos.
- Las agujas de capilar de vidrio ofrecen una solución para un direccionamiento preciso.
- Este estudio se centra en mejorar el proceso de microinyección.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para crear agujas de capilar de vidrio con un lumen de 50-μm.
- Mejorar la precisión en la administración de fármacos en estructuras cerebrales profundas.
- Minimizar el daño cerebral durante el proceso de inyección.
Métodos Utilizados
- Producción de agujas de capilar de vidrio con un lumen de 50 μm.
- Llenado de la aguja con aceite mineral para facilitar la inyección.
- Carga de la aguja con la sustancia deseada o suspensión celular.
- Inyección de la sustancia a baja velocidad de flujo en áreas cerebrales específicas.
Resultados principales
- El método permite la localización precisa de sustancias en el cerebro.
- Reducción significativa del daño cerebral en comparación con los métodos tradicionales.
- Entrega eficiente de fármacos, vectores virales o trasplantes celulares.
- Eficacia demostrada en modelos de roedores.
Conclusiones
- La técnica desarrollada mejora la precisión de las microinyecciones.
- Proporciona un método confiable para la administración de fármacos en la investigación en neurociencia.
- Este enfoque puede aplicarse a diversas sustancias, mejorando los resultados experimentales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La administración precisa de agentes terapéuticos a estructuras cerebrales profundas sigue siendo un desafío crítico en el desarrollo de fármacos en neurociencia, particularmente en modelos de animales pequeños donde el trauma procedimental puede alterar los resultados. Este método de microinyección mejora la fidelidad del acoplamiento al blanco al minimizar el daño tisular inducido por la inyección y la difusión pasiva, mejorando así la fiabilidad de los estudios de intervención farmacológica y genética. El enfoque facilita la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento al permitir una administración reproducible y de bajo volumen de fármacos, vectores virales o trasplantes celulares con menor variabilidad biológica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite una interrogación precisa de hipótesis terapéuticas en núcleos cerebrales profundos al reducir los efectos fuera del blanco derivados del trauma por inyección.
- Valor operativo: Facilita la administración consistente de compuestos o herramientas genéticas entre estudios, mejorando la reproducibilidad en los flujos de trabajo de validación de dianas.
- Confianza predictiva: Minimiza la variabilidad del procedimiento que podría ocultar respuestas farmacológicas o biológicas reales.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados con carga mínima de lesiones para ensayos posteriores de cribado de compuestos en vías del sistema nervioso central.
- Valor operativo: Permite inyecciones estandarizadas y de bajo volumen (20–100 nl), adecuadas para formatos de ensayo de alta precisión que requieren un control estricto de la farmacocinética.
- Reutilización de la plataforma: Adaptable a diversas sustancias (fármacos, vectores virales, células) mediante el ajuste del tamaño de la luz de la aguja, lo que permite campañas de cribado multimodal.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Mejora la fidelidad del modelo de enfermedad al reducir lesiones confusas derivadas de los procedimientos de inyección, aumentando así la relevancia traslacional.
- Valor operativo: Facilita intervenciones reproducibles en estudios longitudinales, apoyando regímenes de dosificación crónica o trasplantes celulares.
- Avance ajustado al riesgo: Incrementa la confianza en los datos de interacción con el blanco, ayudando en las decisiones de avance o interrupción en programas preclínicos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se enmarca en el continuo de descubrimiento que va desde la validación del blanco hasta la optimización del fármaco líder, donde una administración precisa al SNC es esencial para evaluar la modulación del blanco y la participación de la vía.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis en estructuras cerebrales profundas mediante la administración precisa de sondas farmacológicas o genéticas.
- Selección: Permite dosificaciones cuantitativas y reproducibles para la evaluación de compuestos in vivo, esencial para estudios de respuesta a la dosis y ocupación del blanco.
- Análisis: Genera lecturas limpias al minimizar el ruido inducido por el procedimiento, mejorando la detección de señales en mediciones de biomarcadores o eficacia.
- Investigación Traductiva: Favorece la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica al garantizar una administración consistente y de bajo trauma a través de las distintas fases del estudio.
- Reutilización Empresarial: Representa una capacidad estandarizada y adaptable para la administración en el SNC aplicable a múltiples proyectos y modalidades.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista derivada de los artefactos de inyección.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización entre laboratorios y estudios mediante parámetros definidos de preparación de agujas e inyección.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al reducir estudios fallidos debido a la variabilidad del procedimiento o efectos fuera del blanco.
- Impacto en la cartera: Permite una priorización más confiable de objetivos del SNC basada en datos farmacológicos y genéticos más limpios.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microcirugía, coordinación estereotáctica y fabricación de agujas utilizando un extractor de pipetas y un microsoplete.
- Depende del acceso a instrumentación especializada, incluyendo un marco estereotáctico, microinyector y microscopio para la visualización de la aguja.
- Necesita la estandarización del tamaño del lumen de la aguja (50 µm) y del protocolo de llenado (50% de aceite mineral) para obtener un rendimiento consistente entre diferentes usuarios.
- La adaptación a distintos sistemas modelo puede requerir el ajuste de coordenadas y la validación de la profundidad de penetración de la aguja.
- Las limitaciones prácticas incluyen la habilidad técnica necesaria para la elaboración y biselado de las agujas, así como el bajo rendimiento inherente a la microinyección manual.
