Name: RHOC GTPasa ensayo de activación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Aprende a cuantificar la forma activa de RhoC GTPasa en células mediante el ensayo de pull down. Este método permite estudiar la función de RhoC y su papel en la señalización celular.

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1. Prepare la proteína de fusión GST- <ol><li> Stocks de glicerol de bacterias competentes JM109 que contiene la primera N-terminal de 90 aminoácidos de la Rhotekin dominio de unión a Rho (RBD) se subclonó en el vector BamH1/EcoR1 pGEX3x se hacen. Para garantizar la eficiencia de alta los siguientes pasos deben realizarse para cada experimento. En nuestra experiencia, recién preparada GST-RBD es la clave para un ensayo de GTPasa activación sólido y preciso. </li><li> Añadir 50 l (aproximado, no descongelar) de las acciones de glicerol y 50 ml de LB amp y crecer 37 ° C durante la noche con agitación. </li><li> Diluir 1:10 en 500 ml de LB-amp y crecer durante 1 h. </li><li> Inducir la producción de proteínas GST-con 0,1 mM IPTG durante 2 horas. </li><li> Distribuir uniformemente en botellas de centrífuga y centrifugar, rotor Sorval GSA3 a 5000 RPM 4 ° C durante 20 min. </li><li> Resuspender el pellet en botellas de centrífuga de 10 ml de solución amortiguadora de lisis *. * Buffer de lisis bacteriana: 20% de sacarosa, 10% de glicerol, 50 mM Tris pH 8,0, 0,2 mM Na 2 S 2 O 5, 2 mM de MgCl 2, 2 mM DTT, Agregar nuevo PMSF, benzamida, aprotinina y leupeptina. </li><li> Sonicar 2-3 minutos (esto depende del tipo de baño de ultrasonidos. Utilizamos una Fischer de Sonic Dismembranator modelo 500 establecido en la marca de 6, ciclo de 50%). </li><li> Centrífuga, Sorvall SS34, 20 min 10.000 rpm a 4 ° C. En este punto, una pequeña alícuota se puede sacar y dirigido por SDS-PAGE. El gel puede ser teñido con Coomassie y una banda debe ser evidente a los 46 kDa. </li><li> Quitar el sobrenadante y agregar 1 ml de 50% glutatione-Sepharose 4B lechada. </li><li> Incubar durante 30 min a 4 ° C con rotación. Lavar 3 veces con tampón de lisis. </li><li> Volver a suspender las cuentas GST-RBD/glutatione-Sepharose a una suspensión del 50% (aproximadamente 1 ml) con tampón GST-peces **. ** GST-Pescados Buffer: 10% de glicerol, 50 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% NP-4, 2 mM MgCl 2, Agregar nuevo PMSF, benzamida, aprotinina y leupeptina </li></ol> 2. De fusión GST-pull down de ensayo <ol><li> Use 5.10 x 10 6 células / ensayo </li><li> Lave las células una vez en PBS enfriado con hielo, mantener las placas de hielo (se utiliza una placa de vidrio plano lleno de hielo) y lisar con 0,5 ml de pescado GST-buffer. </li><li> Incubar 5 min en hielo, las células de la cosecha utilizando una goma de policía o raspador plano, traslado al tubo de microcentrífuga y centrifugar 20,000 rpm 5 min a 4 ° C. </li><li> Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga nuevo. Tomar 50 l para determinar el total Rho (es decir, el PIB + GTP unido). </li><li> Añadir 0,5 ml cuentas GST-RBD/glutatione-Sepharose e incubar a 4 ° C, durante la noche con la rotación. </li><li> Lavar 6 veces con tampón GST-peces. </li><li> Volver a suspender las bolas en 40 l de la muestra buffer 2x-Laemelli En este punto, la concentración de la alícuota total de proteínas Rho tomadas en 2.4 debe ser determinada y 30 g preparado para ser ejecutado en el gel con la muestra de activación correspondiente. </li><li> Muestras de ebullición a 90 ° C durante 5 minutos, centrifugar brevemente y tomar el sobrenadante (es decir, evitar las bolas) cargar y ejecutar en un gradiente de 12 y 20.4% gel SDS-PAGE. </li><li> Corra el gel a no superior a 150 voltios, la transferencia a la membrana con tampón Towbin y corriente constante de 100 W. </li><li> Bloquear la membrana con leche / TBST solución al 5% y la sonda con RHOC specfic-anticuerpo. </li></ol> 3. Resultados representante Los buenos resultados debe producir una única banda de aproximadamente 22 kDa. Malos resultados producen múltiples bandas o un fondo elevado. Esto es indicativo de la degradación de proteínas, el lavado incompleto de muestras o el uso de la antigua GST-RBD. <img src="/files/ftp_upload/2083/2083fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Tres líneas de células independientes que expresan diferentes niveles de RHOC GTPasa se ​​muestran para demostrar los niveles bajos de RHOC activa y total, los altos niveles de RHOC activa y total o RHOC no. La mancha fue despojado entonces y reprobed con un anticuerpo para la actina casa gen mantener a servir como control de carga de la proteína RHOC total. <img src="/files/ftp_upload/2083/2083fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Múltiples bandas o resultados de alta de fondo de la degradación de proteínas, el lavado incompleto de las muestras o el uso de la vieja GST-RBD.

<ol><li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase%2C+a+novel+transforming+oncogene+for+human+mammary+epithelial+cells+that+partially+recapitulates+the+inflammatory+breast+cancer+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype.</a> Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).</li>
<li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase+overexpression+modulates+induction+of+angiogenic+factors+in+breast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase overexpression modulates induction of angiogenic factors in breast cells.</a> Neoplasia. 2 (5), 418-425 (2000).</li>
<li>Golen, K. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversion+of+RhoC+GTPase-induced+inflammatory+breast+cancer+phenotype+by+treatment+with+a+farnesyl+transferase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Reversion of RhoC GTPase-induced inflammatory breast cancer phenotype by treatment with a farnesyl transferase inhibitor.</a> Mol Cancer Ther. 1 (8), 575-583 (2002).</li>
<li>Golen, K. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen+activated+protein+kinase+pathway+is+involved+in+RhoC+GTPase+induced+motility%2C+invasion+and+angiogenesis+in+inflammatory+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Mitogen activated protein kinase pathway is involved in RhoC GTPase induced motility, invasion and angiogenesis in inflammatory breast cancer.</a> Clin Exp Metastasis. 19 (4), 301-311 (2002).</li>
<li>Yao, H., Dashner, E. J., van Golen, C. M., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase+is+required+for+PC-3+prostate+cancer+cell+invasion+but+not+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase is required for PC-3 prostate cancer cell invasion but not motility.</a> Oncogene. 25 (16), 2285-2296 (2006).</li>
<li>Hall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+Collagen+receptor+%28alpha2beta1%29+signaling+promotes+prostate+cancer+cell+invasion+through+RhoC+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Type I Collagen receptor (alpha2beta1) signaling promotes prostate cancer cell invasion through RhoC GTPase.</a> Neoplasia. 10 (8), 797-803 (2008).</li>
<li>Sequeira, L., Dubyk, C. W., Riesenberger, T. A., Cooper, C. R., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+in+PC-3+prostate+cancer+cell+morphology%2C+invasion+and+tumor+cell+diapadesis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases in PC-3 prostate cancer cell morphology, invasion and tumor cell diapadesis.</a> Clin Exp Metastasis. 25, 569-579 (2008).</li>
<li>van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2+Induces+Prostate+Cancer+Transendothelial+Cell+Migration+via+Activation+of+the+Small+GTPase+Rac%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">CCL2 Induces Prostate Cancer Transendothelial Cell Migration via Activation of the Small GTPase Rac.</a> J Cell Biochem. 104, 1587-1597 (2008).</li>
<li>Chatterjee, M., van Golen, K. L. Int J Cancer. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Sander, E. E., ten Klooster, J. P., van Delft, S., van der Kammen, R. A., Collard, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac+downregulates+Rho+activity%3A+reciprocal+balance+between+both+GTPases+determines+cellular+morphology+and+migratory+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rac downregulates Rho activity: reciprocal balance between both GTPases determines cellular morphology and migratory behavior.</a> J Cell Biol. 147 (5), 1009-1022 (1999).</li>
</ol>

El paso más crítico del proceso es la generación de nuevas GST-RBD. No prestar atención a este paso es la razón principal del fracaso. Todos los pasos, desde la generación de la GST-RBD (1,2) a la incubación durante la noche con el lisado celular (2,5), se debe hacer en un solo día. Otro paso importante es asegurarse que hay suficientes células para producir los lisados ​​celulares. Esto es de particular importancia cuando se mira en RHOC GTPasa, que tiende a estar presente en bajos niveles en la célula.

<table><tbody><tr><td>Perlas de glutatión-sefarosa 4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0756-01</td><td></td></tr><tr><td>Geles Criterion 4-20 % Tris-HCl</td><td>Bio-Rad</td><td>345-0032</td><td></td></tr></tbody></table>

rhoc gtpasa ensayo de activación

RhoC GTPase Activation Assay

RHOC GTPasa tiene 91% de homología con RhoA GTPasa. Debido a su prevalencia en las células, muchos reactivos y técnicas para la GTPasa RhoA se han desarrollado. Sin embargo, RHOC GTPasa se expresa en las células del cáncer metastásico en niveles relativamente bajos. Por lo tanto, son pocos los RHOC reactivos específicos se han desarrollado. Hemos adaptado un ensayo de activación de Rho GTPasa para detectar RHOC. Esta técnica utiliza una GST-Rho de unión a proteínas de fusión de dominio para sacar activos GTPasa RHOC. Además, se puede cosechar la proteína total en el comienzo de la prueba para determinar los niveles del total (GTP y GDP unido) GTPasa RHOC. Esto permite la determinación de la GTPasa RHOC activa respecto al total de la celda. Varias versiones comerciales de este procedimiento se han desarrollado sin embargo, los equipos comerciales se han optimizado para RhoA GTPasa y por lo general no funcionan bien para RHOC GTPasa. Partes de la prueba han sido modificados, así como el desarrollo de un anticuerpo específico RHOC.

Este protocolo utiliza un desplegable de ensayo para determinar los niveles de GTPasa RHOC activa dentro de las células.

RHOC GTPasa ensayo de activación

La GTPasa RhoC presenta una homología del 91 % con la GTPasa RhoA. Debido a la prevalencia de esta última en las células, se han desarrollado numerosos reactivos y técnicas para la GTPasa RhoA. ...

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

El método aquí presentado describe un ensayo para seguir la activación de RhoA específicos PIB / GTP Factores de cambio (GEFS) en células cultivadas, haciendo uso de una proteína de fusión GST RhoA mutante que tiene una alta afinidad por GEFs activados. GEFs se precipitan a partir de lisados ​​celulares, detectados por Western Blot y cuantificados por densitometría.

Afinidad La precipitación de los activos Rho GEFs El uso de un GST-etiquetados mutante de la proteína Rho (GST-RhoA (G17A)) a partir de lisados ​​de células epiteliales

Este video muestra un ensayo de competencia para estudiar las proteínas asociadas a la GTPasa. Utilizando la proteína GTPasa unida a nucleótidos inmovilizada en perlas magnéticas, se puede estudiar la unión competitiva entre dos proteínas asociadas que interactúan para el mismo sitio de unión en la GTPasa para evaluar las afinidades de unión de las proteínas asociadas.

Ensayo de unión de competición para estudiar socios de proteínas de unión a GTPasa que compiten entre sí

El ensayo de movilización de calcio basado en fluorescencia que aquí se describe es un sistema de cribado de la farmacología inversa medio de rendimiento para la identificación de ligando funcionalmente la activación (s) de G receptores acoplados a proteínas huérfanas (GPCRs).

Caracterización de G receptores acoplados a proteína por un ensayo de movilización de calcio basado en fluorescencia

Este protocolo compara las afinidades relativas de los socios de unión para las GTPasas de la familia Rho, incluyendo Rac1. In vivo, las proteínas de unión a Rac1 compiten por una única interfaz de unión, cuya conformación está dictada por un nucleótido unido. El nucleótido es importante y difícil de controlar experimentalmente, debido a la alta tasa de hidrólisis.

La comparación de la afinidad de unión a proteínas GTPasa-utilizando ensayos de competición

La adsorción de péptidos a los materiales de plástico durante las diluciones en serie tradicionales basadas en puntas puede afectar significativamente la determinación de la potencia y confundir la comprensión de las relaciones estructura-actividad utilizadas para las fases de identificación y optimización de pistas del descubrimiento de fármacos. Aquí se describen los métodos para la dilución en serie acústica automatizada sin contacto de muestras de péptidos.

Automatizado de dispensación acústica para la dilución en serie del péptido Los agonistas de la potencia Ensayos de Determinación

La unión a trifosfato de guanosina (GTP) es uno de los primeros eventos en la activación de receptores acoplados a proteína G (GPCR). Este protocolo describe cómo caracterizar farmacológicamente las interacciones específicas de GPCR-ligando mediante la monitorización de la unión del análogo de GTP marcado con radio, [35S] guanosina-5'-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPγS), en Respuesta a un ligando de interés.

Medición de la señalización del receptor acoplado a la proteína G mediante unión de GTP marcada con radio

Aquí se describe un protocolo para investigar la Prenilación y guanosina-5'-trifosfato (GTP)-carga de la GTPasa Rho. Este protocolo consta de dos métodos detallados, es decir, ensayo de fraccionamiento de la membrana y un GTPasa-ligado del inmunosorbente. El protocolo puede ser usado para medir la Prenilación y GTP carga de diferentes otras GTPasas pequeñas.

Detección de la pequeña GTPasa Prenilación y GTP obligatorio usar membrana fraccionamiento y GTPasa-linked Immunosorbent Assay

Este informe describe el cribado de diferentes detergentes para la preparación del GPCR visual, la rodonina, y su complejo con mini-Go. Se demuestran métodos bioquímicos que caracterizan la calidad del complejo en diferentes etapas durante la purificación. Este protocolo se puede generalizar a otros complejos de proteínas de membrana para sus futuros estudios estructurales.

Examen estratégico y caracterización del complejo de señalización de proteínas Visual GPCR-mini-G para una cristalización exitosa

En este trabajo, se describe un ensayo de fluorescencia de calcio intracelular de alto rendimiento para placas de 384 pocillos para examinar bibliotecas de moléculas pequeñas en receptores acoplados a proteínas G recombinantes (GPCR). El objetivo, el receptor de cinina de la garrapata de la fiebre del ganado, Rhipicephalus microplus, se expresa en las células CHO-K1. Este ensayo identifica agonistas y antagonistas utilizando las mismas células en un ensayo de "doble adición".

Un ensayo de fluorescencia de calcio de "doble adición" para el cribado de alto rendimiento de receptores acoplados a proteínas G recombinantes

Hemos establecido un ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida para monitorear los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas. Con este ensayo, describimos un protocolo para medir cuantitativamente el nivel de estos acoplamientos interorgánulos en HEK293T células, bajo la condición de tratamiento químico.

Ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida para medir los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas

Aprende a cuantificar la forma activa de RhoC GTPasa en células mediante el ensayo de pull down. Este método permite estudiar la función de RhoC y su papel en la señalización celular.

RHOC GTPasa ensayo de activación

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