Doble fluorescencia In situ La hibridación en las secciones del cerebro fresco

Hola, soy investigador asociado posdoctoral en el laboratorio AL de ayuda en la Universidad de Rochester. Les mostraremos el proceso de hibridación por digestión en secciones de cerebro congeladas frescas para detectar simultáneamente dos transcritos de ARNm con resolución a nivel celular único. Este método puede ayudar a responder preguntas en el campo de la neurociencia, como aquellas relacionadas con la organización anatómica, funcional, molecular y neuroquímica de un circuito cerebral específico.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la coagulación génica en neuronas del cerebro AV, también puede aplicarse a otros sistemas, como roedores, así como a una variedad de tejidos nerviosos. Para comenzar este procedimiento, hidrate una cantidad adecuada de polvo SDX G 50 con RNAs mediante agua.

Mezcle brevemente la solución y déjela a temperatura ambiente durante dos a cinco minutos. Este paso separa las perlas SDX de la dextrosa presente en el polvo comercial de sedex tras la precipitación con Sedex G 50. Retire el sennet y repita el proceso tres a cinco veces; tras el lavado final, reuspenda la solución de SX G 50 en tampón TE en una proporción de uno a uno entre tampón y volumen de perlas, y almacénela a cuatro grados Celsius hasta su uso.

A continuación, prepare las columnas. Coloque algodón de autoclave en una jeringa estéril de un mililitro y comprímalo con el émbolo para formar una capa compacta en la base. Luego coloque la jeringa en un tubo cónico de 15 mililitros.

Llene las columnas con solución Sedex G 50 mediante centrifugación a 1000 rotaciones por minuto durante 30 segundos utilizando una centrífuga Beckman equipada con un rotor fijo en ángulo C 0 6 5 0. Después de la centrifugación, lave cada columna aplicando 200 microlitros de tampón de lavado de columnas y centrifugando durante dos minutos a 1000 rotaciones por minuto.

Como antes. Finalmente, aplique 200 microlitros de tampón de bloqueo de la columna a cada columna y centrifugue durante dos minutos a 1000 rotaciones por minuto. Repita este paso de cuatro a cinco veces para equilibrar la columna.

Almacene las columnas preparadas a cuatro grados Celsius hasta que la sonda RIBA esté marcada y lista para la purificación para la hibridación doble de fluorescencia en C dos o el procedimiento D FISH mostrado aquí; se preparan dos sondas de ARN, una marcada con doxigenina o DIG y la otra con biotina. Comience el marcado de las sondas preparando las soluciones de marcado de la sonda de riboproteína e incube las reacciones de marcado en un baño de agua a 37 grados Celsius durante dos horas. Al final de la incubación de dos horas, agregue un microlitro de ARNt de 20 microgramos por microlitro y 39 microlitros de tampón bloqueador de columna a cada reacción de marcado.

Luego prepare las columnas EDEX G 50 para la purificación de la sonda añadiendo 50 microlitros de tampón bloqueante a cada columna y centrifugando durante tres minutos a 2000 rotaciones por minuto. Repita este paso de dos a tres veces para equilibrar las columnas. Cuando las columnas estén listas, coloque un tubo EEND orph nuevo en la parte inferior de la columna.

Aplique la solución de sonda a la columna Sedex G 50 y centrifugue durante tres minutos a 2000 rotaciones por minuto. Para obtener los 50 microlitros purificados de la solución de sonda de ribosoma, evalúe la calidad y el rendimiento de la sonda de ribosoma marcada y purificada. Antes de proceder a la hibridación utilizando un criostato, recoja dos o tres secciones cerebrales sobre portaobjetos con carga super frost plus.

El grosor de la sección debe ser de 10 a 12 micrones. Las laminillas pueden almacenarse a menos 80 grados Celsius hasta su uso. Incube las secciones en una solución fría de paraformaldehído al 3%, recién preparada, durante cinco minutos.

Luego, enjuague brevemente las secciones dos veces en PBS. A continuación, deshidrate las secciones mediante una serie estándar de alcohol del 70, 95 y 100 % de etanol durante dos minutos en cada solución. Después de deshidratar las secciones, incúbelas en una solución de acetilación recién preparada durante 10 minutos.

Luego, lave las secciones tres veces en SSPE al dos por ciento y deshidrate las secciones tras la acetilación nuevamente mediante la serie estándar de alcohol, tal como se acaba de mostrar. Ahora inicie la hibridación con la sonda ribo. Aplique un volumen adecuado de la solución de hibridación al tejido, cubra las laminillas con cubreobjetos y coloque las laminillas en un portaportas metálico.

Sumerja el portaportas en un baño de aceite mineral ajustado a 65 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, retire cuidadosamente el portaportas del baño de aceite mineral y enjuáguelo brevemente con cloroformo para eliminar el exceso de aceite de los portaobjetos.

Coloque los portaobjetos en una solución de SSPE 2 veces durante cinco a 10 minutos para retirar la cubreobjetos. Después de retirar la cubreobjetos, transfiera los portaobjetos a una nueva solución de SSPE 2 veces y déjelos durante una hora a temperatura ambiente. Al comienzo de este paso de incubación, caliente previamente la solución de SSPE 2 veces más 50 % formamida a la misma temperatura que la utilizada en la hibridación. Proceda al finalizar la incubación de una hora.

Transfiera los portaobjetos a la solución de SSPE dos veces precalentada y incube durante 1,5 horas. Al comienzo de este paso de incubación, precaliente una solución de SSPE 0,1 veces a la misma temperatura que en el paso de hibridación. Finalice los lavados posteriores a la hibridación transfiriendo los portaobjetos a la solución de SSPE 0,1 veces PRECALENTADA e incube durante 30 minutos.

Repita este lavado una vez. Las secciones cerebrales ya están listas para la detección y visualización de las sondas de riboprobes hibridadas. Añada 0,3 % de peróxido de hidrógeno al tampón TNT e incube las laminillas en esta solución durante 10 minutos. A continuación, lave las laminillas en tampón TNT tres veces durante 10 minutos cada vez utilizando un lápiz desecante.

Dibuje un círculo alrededor del área que contiene las secciones cerebrales. Aplique 150 microlitros de tampón TNB a cada portaobjetos e incube las secciones en esta solución durante 30 minutos. Asegúrese de que las secciones no se sequen durante este paso.

A continuación, aplique 150 microlitros de solución TT NB que contiene anticuerpo anti DIG conjugado con peroxidasa y almacene los portaobjetos en una cámara húmeda durante dos horas. Al final de la incubación de dos horas, lave las secciones con tampón TNT tres veces durante 10 minutos. En cada ocasión, aplique 150 microlitros de la solución de trabajo de T IDE conjugada con Alexa 5 9 4 a cada portaobjetos y almacene los portaobjetos en una cámara húmeda durante una hora.

Al final de una hora, lave los cortes en tampón TNT tres veces durante 10 minutos. Incube los cortes cada vez en una solución de peróxido de hidrógeno al 0,3 % en tampón TNT durante 10 a 30 minutos. El tiempo de incubación en la solución de peróxido de hidrógeno depende de la abundancia de ARNm y debe probarse previamente al ensayo de hibridación in situ fluorescente.

Luego deseche las secciones en tampón TNT tres veces durante 10 minutos cada vez. Aplique 150 microlitros de tampón TMB por portaobjetos y mantenga los portaobjetos en una cámara húmeda durante 30 minutos. Retire el exceso de solución TMB inclinando los portaobjetos.

Añada 150 microlitros de solución de TMB que contiene anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa y almacene los portaobjetos en una cámara húmeda durante dos horas. Luego lave las secciones con tampón TNT tres veces durante 10 minutos. Cada vez, aplique 150 microlitros de una solución de trabajo de ácaro conjugado con Alexa 488 a los portaobjetos e incube las secciones durante una hora.

Luego, lave los cortes en tampón TNT tres veces durante 10 minutos cada vez. Ahora que ambas sondas de ribo están marcadas con anticuerpos, incube los cortes en 150 microlitros de solución huésped durante dos minutos. A continuación, lave los cortes en tampón TNT tres veces durante cinco minutos cada vez, agregue un medio de montaje compatible con fluorescencia, como Vector Shield o Prolonged Antifa, a los cortes, cúbralos con un cubreobjetos y observe al microscopio fluorescente.

Estas microfotografías representativas son de un experimento con pez D, utilizando secciones cerebrales de pinzón cebra, específicamente de la región NCM, el equivalente en aves cantoras de la corteza auditiva de los mamíferos. Las secciones cerebrales fueron hibridadas con dos sondas: una sonda ribo marcada con biotina dirigida contra la parvalbúmina, un marcador para una subpoblación de neuronas inhibitorias, y una sonda ribo marcada con DIG dirigida contra el gen dependiente de la actividad zinc, un marcador confiable para neuronas activadas por el canto. Una superposición de las dos imágenes muestra una población celular de neuronas inhibitorias que son activadas por la experiencia auditiva.

Las flechas indican células marcadas exclusivamente con la sonda ribo para par. Las flechas de albúmina indican células marcadas exclusivamente con la sonda RIBA para neuronas representativas de zinc que coexpresan ambos transcritos de interés, marcadas con un asterisco. Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener la bancada limpia y utilizar soluciones, plásticos y material de vidrio libres de contaminación.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo detectar simultáneamente dos especies de MA, con resolución a nivel de célula individual en cortes cerebrales recién congelados, para estudiar la co-regulación génica en el cerebro de rata. Gracias por ver el video. Buena suerte con sus experimentos.