Name: Doble fluorescencia In situ La hibridación en las secciones del cerebro fresco (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Aprende la hibridación in situ de doble fluorescencia en secciones de cerebro fresco para detectar dos transcritos simultáneamente con resolución de célula única. Este método permite estudiar la organización molecular de circuitos neuronales.

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El trabajo apoyado por subvenciones del NIH / NIDCD y la Fundación de Schmitt a la PR.

Este protocolo fue desarrollado y perfeccionado sobre la base de los métodos estándar de hibridación radiactivos y no radiactivos in situ, desarrollado previamente por nosotros y otros para detectar una o dos especies de transcripción en el tejido cerebral 1-7. El protocolo se describe a continuación tiene una longitud total de 2 o 3 días, dependiendo del número de interrupciones del procedimiento elegido por el usuario final. Todos los pasos detallados a continuación se llevarán a cabo a temperatura ambiente, con la excepción de la etapa de hibridación riboprobe y se lava después de la hibridación. Las soluciones y tampones necesarios para todas las etapas de este método se puede encontrar al final de este protocolo. 1. Preparación del tejido y corte <ol><li> Decapitar y extracto de cerebro de sujetos en rápido, y colocarlo en un molde de plástico de tamaño adecuado. </li><li> Cubren el cerebro con Tissue-Tek medio de inclusión y rápidamente colocar el molde de plástico en un baño de dry-ice/alcohol de congelación rápida. El tejido congelado se puede almacenar a -80 ° C hasta su uso. </li><li> El uso de un criostato, recoger dos o tres secciones del cerebro por diapositiva en Superfrost Plus diapositivas cargado. Espesor de las secciones debe ser 10-12 micras. Las diapositivas se pueden almacenar a -80 ° C hasta su uso. </li></ol> 2. Preparación de Sephadex G50 columnas para la purificación de la sonda "Columnas de Sephadex se pueden adquirir de fuentes comerciales, sin embargo, a continuación una alternativa de bajo costo para la generación de columnas, que se requiere para la purificación de la sonda. <ol><li> Cantidad adecuada de hidratos de Sephadex G50 en polvo con RNasa libre, agua tratada con DEPC (por ejemplo, 2 g de polvo en 100 ml de agua tratada con DEPC), una breve solución de mezclar y almacenar a temperatura ambiente para precipitar el exceso de Sephadex G50. </li><li> Aspirar el sobrenadante (la capa superior de agua) después de Sephadex G50 precipitación. </li><li> Repita el proceso por encima del 3 - 5 veces. </li><li> Después del lavado final, volver a suspender las Sephadex G50 solución en buffer TE (1:1), y se almacenan a 4 ° C hasta su uso. </li><li> Coloque el autoclave lana de vidrio en una jeringa estéril de 1 y comprimir con el émbolo para hacer una capa compacta en la parte inferior, y luego colocar la jeringa en un tubo Falcon de 15 ml. </li><li> Mezcle bien la solución de Sephadex G50 en TE. Llene la jeringa / columna con esta solución. </li><li> Centrifugar la columna durante 30 segundos a 1000 rpm. </li><li> Repita este procedimiento hasta que la columna está casi completamente lleno de Sephadex G50 cuentas. </li><li> Aplicar 200 l de tampón de columna de lavado a la columna y centrifugar durante 2 min a 1000 rpm. Desechar el filtrado. </li><li> Aplicar 200 l de tampón de columna de bloqueo a la columna y girar durante 2 min a 1000 rpm. Repita este paso 4-5 veces para equilibrar la columna. Las columnas pueden ser almacenadas a 4 ° C hasta su uso si sellado con Parafilm. </li></ol> 3. Etiquetado y purificación de ribosondas A continuación se detallan la generación y purificación de un riboprobe sola. Para dFISH, la preparación de cada sonda implicará la misma metodología, excepto que una de las sondas serán marcadas con digoxigenina (DIG)-etiquetados UTP mientras que el otro con biotina-etiquetados UTP. <ol><li> Prepare una solución concentrada (&gt; 150 ng / l) y se purifica solución linealizada cDNA de interés para generar uno u otro sentido (control) o riboprobes antisentido. </li><li> En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, agregar 0,5-1 g de agua purificada plantilla de cDNA, 2 l de tampón 5X etiquetado sonda, 1 l de DIG 10 veces (o biotina)-etiquetado mezcla, 0,5 l de RNasin y 1 l de la correspondiente ARN polimerasa , y llevar el volumen final de la solución a 10 ml con RNasa libre (tratada con DEPC) de agua. </li><li> Incube la solución en un baño de agua a 37 ° C durante 2 horas. </li><li> Añadir 1 l de tRNA (stock; 20 mg / l), y 39 l de tampón de columna de bloqueo a la solución. </li><li> Prepare la columna de Sephadex G50 para la purificación de la sonda. Con este fin, se añaden 50 l buffer de bloqueo a la columna y girar durante 10 segundos a 1000 rpm. Repita este paso 2-3 veces para equilibrar la columna (es decir, la totalidad de 50 l aplicada a la columna se recuperan después de un ciclo de centrifugado). </li><li> Aplique la solución de prueba a la columna de Sephadex G50, la posición de un tubo de microcentrífuga nuevo en la parte inferior de la columna, y girar durante 3 minutos a 1000 rpm para obtener el purificada 50 l de solución riboprobe. </li><li> Evaluar la calidad y el rendimiento de riboprobe etiquetados utilizando una norma de formaldehído-agarosa ARN gel, o un espectrofotómetro. </li></ol> 4. Posterior a la fijación, acetilación y de hibridación <ol><li> Eliminar secciones de la 80 ° C congelador y permitir una temperatura ambiente que se equilibre. Posteriormente, se incuban las secciones de un frío, recién hechas solución de paraformaldehído al 3% durante 5 min. </li><li> Brevemente enjuague secciones en phosphate solución salina (PBS) dos veces. </li><li> Deshidratar secciones a través de una serie estándar de alcohol (70, 95 y 100%, 2 minutos cada uno), y dejar que se seque al aire. </li><li> Incubar las secciones en una solución de acetilación de 10 min. </li><li> Enjuague las secciones 3 veces en 2 veces la SSPE. </li><li> Deshidratar secciones, una vez más a través de la serie estándar de alcohol se ha descrito anteriormente, y permitir que se seque al aire. </li><li> Preparar un volumen adecuado de solución de hibridación y añadir tanto riboprobes a la solución (concentración de la sonda: 1 ng / l para cada sonda). Volumen total de la solución de hibridación se determina en función del número de secciones que se han hibridado (16 l de solución de hibridación por sección). </li><li> Aplicar volumen adecuado de la solución de hibridación en las diapositivas de tejidos y cubreobjetos asegurar que el aire no superposición de las burbujas de los tejidos. </li><li> Coloque los portaobjetos en un soporte de diapositivas de metal. Titular de sumergirse en un baño de aceite mineral a los 65 ° C durante la noche. Asegúrese de que los cubreobjetos son hacia arriba (es decir, la parte lateral del soporte de diapositivas debe estar en contacto con el fondo del recipiente de aceite mineral). </li></ol> 5. La hibridación después de Lava <ol><li> Al día siguiente, retirar con cuidado el soporte de diapositivas del baño de aceite mineral y brevemente se aclare en cloroformo para eliminar el exceso de grasa de las diapositivas. </li><li> Coloque los portaobjetos en una solución de 2X PES durante 5-10 minutos. Cubreobjetos debe desprenderse de diapositivas, mientras que en la solución. </li><li> Transferencia de las diapositivas de una nueva solución de 2X SSPE, y mantenerlos durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Transferencia de secciones en una solución que contiene la SSPE 2X más el 50% de formamida. La temperatura de esta solución debe coincidir con la temperatura utilizada en el procedimiento de hibridación noche a la mañana. Mantenga las diapositivas en esta solución durante 1,5 horas. </li><li> Transferencia de las secciones a una solución 0.1X PEES pre-calentado a la misma temperatura de la etapa de hibridación. Incubar las secciones en esta solución durante 30 minutos. Repita este paso para un período adicional de 30 min. </li></ol> 6. Detección y visualización de ribosondas <ol><li> Transferencia de diapositivas para amortiguar TNT a las que 0,3% de peróxido de hidrógeno se ha añadido, durante 10 minutos. </li><li> Lávese las secciones de TNT buffer, 3 veces (10 minutos cada uno). </li><li> El uso del lápiz Dako, dibujar un pozo en la zona que contiene las secciones del cerebro. Es importante destacar que se debe tener precaución para que los artículos no se sequen. </li><li> Aplicar 150 l de tampón TNB a cada diapositiva, e incubar las secciones en esta solución durante 30 minutos, en una cámara húmeda. </li><li> Retire el exceso de solución TNB diapositivas inclinación. </li><li> Aplicar 150 ml de solución contiene TNB conjugado con peroxidasa anti-DIG anticuerpos, y se desliza almacenar en una cámara húmeda durante 2 horas. Concentración de anticuerpos debe determinarse individualmente para cada una transcripción de interés antes de realizar dFISH. </li><li> Lávese las secciones de TNT buffer, 3 veces, 10 minutos cada uno. </li><li> Aplicar 150 ml de Alexa 594-conjugado solución tyramide de trabajo para cada diapositiva, y almacenarlos en una cámara húmeda durante 1 hora. Esta solución debe prepararse de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Lávese las secciones de TNT buffer, 3 veces, 10 minutos cada uno. </li><li> Secciones se incuban en un tampón de TNT a las que 0,3% de peróxido de hidrógeno se ha añadido durante 10 - 30 min. </li><li> Lávese las secciones de TNT buffer, 3 veces, 10 minutos cada uno. </li><li> Aplicar 150 l de tampón TNB por diapositiva, y mantenerlas en una cámara húmeda durante 30 minutos. </li><li> Retire el exceso de solución TNB diapositivas inclinación. </li><li> Añadir 150 ml de solución de TNB que contienen conjugado de peroxidasa anti-biotina de anticuerpos, y se desliza almacenar en una cámara húmeda durante 2 horas. </li><li> Lávese las secciones de TNT buffer, 3 veces, 10 minutos cada uno. </li><li> Aplicar 150 ml de un Alexa 488-conjugado solución tyramide de trabajo a las diapositivas y las secciones se incuban durante 1 hora. Esta solución debe prepararse de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. </li><li> Lávese las secciones de TNT buffer, 3 veces, 10 minutos cada uno. </li><li> Añadir 150 ml de solución de Hoechst (1:1000 en buffer de TNT) a las secciones y los mantienen en la cámara húmeda durante 2 min. </li><li> Lave las secciones de TNT buffer; 3 veces, 5 minutos cada uno. </li><li> Cubreobjetos secciones con un medio de fluorescencia compatible con el montaje (por ejemplo, Vectashield o prolongar Antifade). </li></ol> 7. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2102/2102fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Mostramos aquí los resultados obtenidos dFISH representante en el cerebro pinzón cebra. Se muestran microfotografías obtenidas de la caudomedial nidopallium (NCM), el análogo de pájaro cantor de la corteza auditiva de mamíferos. Secciones del cerebro se hibridó con una riboprobe biotinilado dirigido contra parvalbúmina (A), un marcador de una subpoblación de neuronas inhibitorias, y una marcada con DIG riboinvestigación dirigida contra el Zenk dependiente de la actividad del gen (B), un marcador fiable para impulsada canción neuronas. C) Superposición de (A) y (B) muestra una población de neuronas inhibitorias que se activan por la experiencia auditiva. Flechas y puntas de flecha indican las células marcadas exclusivamente con cada uno de los dos riboprobes y asteriscos muestran las neuronas representante co-expresión de ambas transcripciones de interés. Barra de escala = 25 micras.

<ol><li>Jin, L., Lloyd, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Lab+Anal%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: methods and applications.</a> J Clin Lab Anal. 11, 2-9 (1997).</li>
<li>Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization.</a> Clin Lab Med. 10, 215-236 (1990).</li>
<li>Komminoth, P., Werner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+and+signal+amplification%3A+approaches+to+increase+the+sensitivity+of+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22+Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Target and signal amplification: approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization.</a> Histochem Cell Biol. 108, 325-3233 (1997).</li>
<li>Kessler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+digoxigenin%3Aanti-digoxigenin+%28DIG%29+technology--a+survey+on+the+concept+and+realization+of+a+novel+bioanalytical+indicator+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Probes%22%5BJournal%5D)">The digoxigenin:anti-digoxigenin (DIG) technology--a survey on the concept and realization of a novel bioanalytical indicator system.</a> Mol Cell Probes. 5, 161-205 (1991).</li>
<li>Panoskaltsis-Mortari, A., Bucy, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+with+digoxigenin-labeled+RNA+probes%3A+facts+and+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization with digoxigenin-labeled RNA probes: facts and artifacts.</a> Biotechniques. 18, 300-307 (1995).</li>
<li>Qian, X., Lloyd, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+signal+amplification+methods+for+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Recent developments in signal amplification methods for in situ hybridization.</a> Diagn Mol Pathol. 12, 1-13 (2003).</li>
<li>Mello, C. V., Jarvis, E. D., Denisenko, N., Rivas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+song-regulated+genes+in+the+brain+of+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of song-regulated genes in the brain of songbirds.</a> Methods Mol Biol. 85, 205-217 (1997).</li>
<li>Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+participate+in+the+brain%27s+response+to+birdsong+auditory+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons participate in the brain's response to birdsong auditory stimulation.</a> Eur J Neurosci. 20, 1318-1330 (2004).</li>
<li>Velho, T. A., Pinaud, R., Rodrigues, P. V., Mello, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-induction+of+activity-dependent+genes+in+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Co-induction of activity-dependent genes in songbirds.</a> Eur J Neurosci. 22, 1667-1678 (2005).</li>
<li>Tremere, L. A., Jeong, J. K., Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol+shapes+auditory+processing+in+the+adult+brain+by+regulating+inhibitory+transmission+and+plasticity-associated+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Estradiol shapes auditory processing in the adult brain by regulating inhibitory transmission and plasticity-associated gene expression.</a> J Neurosci. 29, 5949-5963 (2009).</li>
<li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li>
<li>Pinaud, R., Jeong, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplex+fluorescence+in+situ+hybridization+in+the+study+of+gene+co-regulation+in+the+vertebrate+brain.+Methods+Mol+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Duplex fluorescence in situ hybridization in the study of gene co-regulation in the vertebrate brain. Methods Mol Biol.</a> 611, 115-129 (2010).</li>
</ol>

Hemos utilizado este protocolo para estudiar cómo el cerebro de los vertebrados es neuroquímico y funcionalmente organizada, y para determinar la conducta relevante impacto estímulos sensoriales de la maquinaria del genoma de las neuronas en el cerebro adulto 80-10. Hemos utilizado con éxito este método en el tejido cerebral de ratones, ratas y pájaros, pero anticipamos que este protocolo se adapta fácilmente a las secciones del cerebro obtenidas de una gran variedad de especies de vertebrados y, quizás, los ...

Soluciones <ol><li> Columna de tampón de lavado: 10 mM Tris-HCl, NaCl 0,15 M, 0,05 mM EDTA, 50 mg / l tRNA, SDS 0,1% en 50 ml de agua tratada con DEPC. </li><li> Columna de tampón de bloqueo: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA en 50 ml de agua tratada con DEPC. </li><li> TNT búfer: 60 ml de 1 M Tris-HCl, 18 ml de 5 M NaCl y 1,8 ml de Triton X-100 en 600 ml de agua tratada con DEPC. </li><li> TNB búfer: 100 mM Tris-HCl, 8,3 mg / l de BSA, NaCl 0,15 M y el 3% Triton X-100 en agua tratada con DEPC. </li><li> Tampón TE: 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 y 1 mM EDTA, pH 7,5. </li><li> Solución de la acetilación: 2.7 ml de trietanolamina más 0,5 ml de anhídrido acético en 200 ml de agua tratada con DEPC. </li><li> Solución de hibridación: formamida al 50%, 2x SSPE, 2 mg / l tRNA, 1 mg / l de BSA y 1 mg / l poli A en el agua tratada con DEPC. Se necesita 16 litros por sección. </li></ol>

doble fluorescencia in situ la hibridación en las secciones del cerebro fresco

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Aquí se describe una versión modificada de un fluorescente doble<em&gt; In situ</emHibridación&gt; (dFISH) método optimizado para la detección de dos mRNAs de interés en nuevas secciones del cerebro congelado. Nuestro grupo ha utilizado con éxito este enfoque para el estudio de genes co-regulación. Más específicamente, hemos utilizado este método para explorar dFISH la organización anatómica, propiedades neuroquímicas, y el impacto de la experiencia sensorial en el centro de los circuitos sensoriales, con una resolución única célula. Este protocolo ha sido validado en el tejido cerebral de ratones, ratas y pájaros, pero se espera que sea fácilmente adaptable a otras especies de vertebrados, así como a una amplia gama de tejidos no neuronales. En esta película una demostración detallada de las principales etapas de este procedimiento.

Este protocolo consiste en un no-radiactivos<em&gt; In-situ</emProcedimiento&gt; hibridación que permite la identificación simultánea de dos especies de transcripción, en una resolución única célula, en secciones finas de cerebro de los vertebrados.

Doble fluorescencia In situ La hibridación en las secciones del cerebro fresco

Aquí describimos una versión modificada de un método de hibridación in situ fluorescente doble (dFISH), optimizada para la detección de dos ARNm de interés en muestras frescas de...

Hola, soy investigador asociado posdoctoral en el laboratorio AL de ayuda en la Universidad de Rochester. Les mostraremos el proceso de hibridación por digestión en secciones de cerebro congeladas frescas para detectar simultáneamente dos transcritos de ARNm con resolución a nivel celular único. Este método puede ayudar a responder preguntas en el campo de la neurociencia, como aquellas relacionadas con la organización anatómica, funcional, molecular y neuroquímica de un circuito cerebral específico.Aunque este método puede proporcionar información sobre la coagulación génica en neuronas del cerebro AV, también puede aplicarse a otros sistemas, como roedores, así como a una variedad de tejidos nerviosos. Para comenzar este procedimiento, hidrate una cantidad adecuada de polvo SDX G 50 con RNAs mediante agua.Mezcle brevemente la solución y déjela a temperatura ambiente durante dos a cinco minutos. Este paso separa las perlas SDX de la dextrosa presente en el polvo comercial de sedex tras la precipitación con Sedex G 50. Retire el sennet y repita el proceso tres a cinco veces; tras el lavado final, reuspenda la solución de SX G 50 en tampón TE en una proporción de uno a uno entre tampón y volumen de perlas, y almacénela a cuatro grados Celsius hasta su uso.A continuación, prepare las columnas. Coloque algodón de autoclave en una jeringa estéril de un mililitro y comprímalo con el émbolo para formar una capa compacta en la base. Luego coloque la jeringa en un tubo cónico de 15 mililitros.Llene las columnas con solución Sedex G 50 mediante centrifugación a 1000 rotaciones por minuto durante 30 segundos utilizando una centrífuga Beckman equipada con un rotor fijo en ángulo C 0 6 5 0. Después de la centrifugación, lave cada columna aplicando 200 microlitros de tampón de lavado de columnas y centrifugando durante dos minutos a 1000 rotaciones por minuto.Como antes. Finalmente, aplique 200 microlitros de tampón de bloqueo de la columna a cada columna y centrifugue durante dos minutos a 1000 rotaciones por minuto. Repita este paso de cuatro a cinco veces para equilibrar la columna.Almacene las columnas preparadas a cuatro grados Celsius hasta que la sonda RIBA esté marcada y lista para la purificación para la hibridación doble de fluorescencia en C dos o el procedimiento D FISH mostrado aquí; se preparan dos sondas de ARN, una marcada con doxigenina o DIG y la otra con biotina. Comience el marcado de las sondas preparando las soluciones de marcado de la sonda de riboproteína e incube las reacciones de marcado en un baño de agua a 37 grados Celsius durante dos horas. Al final de la incubación de dos horas, agregue un microlitro de ARNt de 20 microgramos por microlitro y 39 microlitros de tampón bloqueador de columna a cada reacción de marcado.Luego prepare las columnas EDEX G 50 para la purificación de la sonda añadiendo 50 microlitros de tampón bloqueante a cada columna y centrifugando durante tres minutos a 2000 rotaciones por minuto. Repita este paso de dos a tres veces para equilibrar las columnas. Cuando las columnas estén listas, coloque un tubo EEND orph nuevo en la parte inferior de la columna.Aplique la solución de sonda a la columna Sedex G 50 y centrifugue durante tres minutos a 2000 rotaciones por minuto. Para obtener los 50 microlitros purificados de la solución de sonda de ribosoma, evalúe la calidad y el rendimiento de la sonda de ribosoma marcada y purificada. Antes de proceder a la hibridación utilizando un criostato, recoja dos o tres secciones cerebrales sobre portaobjetos con carga super frost plus.El grosor de la sección debe ser de 10 a 12 micrones. Las laminillas pueden almacenarse a menos 80 grados Celsius hasta su uso. Incube las secciones en una solución fría de paraformaldehído al 3%, recién preparada, durante cinco minutos.Luego, enjuague brevemente las secciones dos veces en PBS. A continuación, deshidrate las secciones mediante una serie estándar de alcohol del 70, 95 y 100 % de etanol durante dos minutos en cada solución. Después de deshidratar las secciones, incúbelas en una solución de acetilación recién preparada durante 10 minutos.Luego, lave las secciones tres veces en SSPE al dos por ciento y deshidrate las secciones tras la acetilación nuevamente mediante la serie estándar de alcohol, tal como se acaba de mostrar. Ahora inicie la hibridación con la sonda ribo. Aplique un volumen adecuado de la solución de hibridación al tejido, cubra las laminillas con cubreobjetos y coloque las laminillas en un portaportas metálico.Sumerja el portaportas en un baño de aceite mineral ajustado a 65 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, retire cuidadosamente el portaportas del baño de aceite mineral y enjuáguelo brevemente con cloroformo para eliminar el exceso de aceite de los portaobjetos.Coloque los portaobjetos en una solución de SSPE 2 veces durante cinco a 10 minutos para retirar la cubreobjetos. Después de retirar la cubreobjetos, transfiera los portaobjetos a una nueva solución de SSPE 2 veces y déjelos durante una hora a temperatura ambiente. Al comienzo de este paso de incubación, caliente previamente la solución de SSPE 2 veces más 50 % formamida a la misma temperatura que la utilizada en la hibridación. Proceda al finalizar la incubación de una hora.Transfiera los portaobjetos a la solución de SSPE dos veces precalentada y incube durante 1,5 horas. Al comienzo de este paso de incubación, precaliente una solución de SSPE 0,1 veces a la misma temperatura que en el paso de hibridación. Finalice los lavados posteriores a la hibridación transfiriendo los portaobjetos a la solución de SSPE 0,1 veces PRECALENTADA e incube durante 30 minutos.Repita este lavado una vez. Las secciones cerebrales ya están listas para la detección y visualización de las sondas de riboprobes hibridadas. Añada 0,3 % de peróxido de hidrógeno al tampón TNT e incube las laminillas en esta solución durante 10 minutos. A continuación, lave las laminillas en tampón TNT tres veces durante 10 minutos cada vez utilizando un lápiz desecante.Dibuje un círculo alrededor del área que contiene las secciones cerebrales. Aplique 150 microlitros de tampón TNB a cada portaobjetos e incube las secciones en esta solución durante 30 minutos. Asegúrese de que las secciones no se sequen durante este paso.A continuación, aplique 150 microlitros de solución TT NB que contiene anticuerpo anti DIG conjugado con peroxidasa y almacene los portaobjetos en una cámara húmeda durante dos horas. Al final de la incubación de dos horas, lave las secciones con tampón TNT tres veces durante 10 minutos. En cada ocasión, aplique 150 microlitros de la solución de trabajo de T IDE conjugada con Alexa 5 9 4 a cada portaobjetos y almacene los portaobjetos en una cámara húmeda durante una hora.Al final de una hora, lave los cortes en tampón TNT tres veces durante 10 minutos. Incube los cortes cada vez en una solución de peróxido de hidrógeno al 0,3 % en tampón TNT durante 10 a 30 minutos. El tiempo de incubación en la solución de peróxido de hidrógeno depende de la abundancia de ARNm y debe probarse previamente al ensayo de hibridación in situ fluorescente.Luego deseche las secciones en tampón TNT tres veces durante 10 minutos cada vez. Aplique 150 microlitros de tampón TMB por portaobjetos y mantenga los portaobjetos en una cámara húmeda durante 30 minutos. Retire el exceso de solución TMB inclinando los portaobjetos.Añada 150 microlitros de solución de TMB que contiene anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa y almacene los portaobjetos en una cámara húmeda durante dos horas. Luego lave las secciones con tampón TNT tres veces durante 10 minutos. Cada vez, aplique 150 microlitros de una solución de trabajo de ácaro conjugado con Alexa 488 a los portaobjetos e incube las secciones durante una hora.Luego, lave los cortes en tampón TNT tres veces durante 10 minutos cada vez. Ahora que ambas sondas de ribo están marcadas con anticuerpos, incube los cortes en 150 microlitros de solución huésped durante dos minutos. A continuación, lave los cortes en tampón TNT tres veces durante cinco minutos cada vez, agregue un medio de montaje compatible con fluorescencia, como Vector Shield o Prolonged Antifa, a los cortes, cúbralos con un cubreobjetos y observe al microscopio fluorescente.Estas microfotografías representativas son de un experimento con pez D, utilizando secciones cerebrales de pinzón cebra, específicamente de la región NCM, el equivalente en aves cantoras de la corteza auditiva de los mamíferos. Las secciones cerebrales fueron hibridadas con dos sondas: una sonda ribo marcada con biotina dirigida contra la parvalbúmina, un marcador para una subpoblación de neuronas inhibitorias, y una sonda ribo marcada con DIG dirigida contra el gen dependiente de la actividad zinc, un marcador confiable para neuronas activadas por el canto. Una superposición de las dos imágenes muestra una población celular de neuronas inhibitorias que son activadas por la experiencia auditiva.Las flechas indican células marcadas exclusivamente con la sonda ribo para par. Las flechas de albúmina indican células marcadas exclusivamente con la sonda RIBA para neuronas representativas de zinc que coexpresan ambos transcritos de interés, marcadas con un asterisco. Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener la bancada limpia y utilizar soluciones, plásticos y material de vidrio libres de contaminación.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo detectar simultáneamente dos especies de MA, con resolución a nivel de célula individual en cortes cerebrales recién congelados, para estudiar la co-regulación génica en el cerebro de rata. Gracias por ver el video. Buena suerte con sus experimentos.

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Aquí se describe un método rápido y sencillo a las células de la imagen marcados con fluorescencia en rodajas de cerebro semi-espesa. Mediante la fijación, corte, limpieza y ópticamente el tejido cerebral se describe la forma de imagen estándar de epifluorescencia y confocal se puede utilizar para visualizar las células individuales y las redes neuronales en el tejido nervioso intacto.

Un enfoque rápido para imágenes de fluorescencia de alta resolución en rodajas de cerebro semi-gruesa

Fuente: Jolly, S., et.al. Combinación de hibridación de doble fluorescencia in situ con inmunomarcaje para la detección de la expresión de tres genes en secciones de cerebro de ratón. J. Vis. Exp. (2016). Este video demuestra el uso de la hibridación in situ de doble fluorescencia para visualizar la expresión de dos dianas de ARN en secciones del cerebro de ratón. El protocolo implica la detección secuencial de ARN mediante sondas marcadas con isotiocianato de fluoresceína y digoxigenina,...

 Realización de hibridación in situ de doble fluorescencia para detectar la expresión génica en secciones del cerebro de ratón

Fuente: Baleriola, J., et. al., Detección de ARNm localizados axonalmente en secciones cerebrales mediante hibridación in situ de alta resolución.  J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra la detección de ARNm dentro de axones colinérgicos en cortes fijos de hipocampo de ratón utilizando hibridación fluorescente in situ y tinción de anticuerpos. La microscopía de fluorescencia revela la localización espacial de los ARNm marcados con sonda y la colina acetiltransferasa en las neuronas...

Inmunotinción de neuronas en cortes de cerebro de ratón después de la hibridación fluorescente in situ

situ (ISH) &gt; 'jove_content permite la visualización de ARN en células y tejidos. Aquí mostramos cómo la combinación de RNAscope ISH con inmunohistoquímica o colorantes histológicos se puede utilizar con éxito para detectar ARNm localizados en axones en secciones de cerebros humanos y de ratones.

La detección de ARNm axón localizado en las secciones cerebrales Uso de alta resolución<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación

Este protocolo describe en detalle cómo transfectar específicamente diferentes regiones en el sistema nervioso central C57BL/6 a través de la electroporación en el útero. En este protocolo se incluyen instrucciones detalladas para las transfecciones de regiones que se desarrollan en la corteza, el hipocampo, el tálamo, el hipotálamo, el núcleo septal lateral y el cuerpo estriado.

Específica Striatum Cortex, hipocampo, Thalamus-, hipotálamo, núcleo-septal lateral y<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporación en el ratón C57BL / 6

La localización de la expresión génica a tipos específicos de células puede ser un desafío debido a la falta de anticuerpos específicos. En este trabajo describimos un protocolo para la detección simultánea de la triple expresión génica mediante la combinación de hibridación in situ de ARN de doble fluorescencia con inmunotinción.

La combinación de doble fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación con Immunolabelling para la detección de la expresión de tres genes en las secciones de cerebro de ratón

La técnica de flotación libre permite a los investigadores realizar tinciones histológicas, incluida la inmunohistoquímica en secciones de tejido fijo para visualizar estructuras biológicas, tipo de célula y expresión y localización de proteínas. Esta es una técnica histoquímica eficiente y confiable que puede ser útil para investigar una multitud de tejidos, como el cerebro, el corazón y el hígado.

Tinciones histológicas con secciones de tejido flotante libre

Este protocolo describe un método para combinar la hibridación fluorescente in situ (FISH) y la inmunohistoquímica de fluorescencia (IHC) en secciones de cerebro de ratón frescas congeladas y fijas, con el objetivo de lograr una señal de FISH y IHC de fluorescencia multimarca. IHQ se dirigió a proteínas citoplasmáticas y unidas a la membrana.

Combinación de hibridación in situ de fluorescencia múltiple con inmunohistoquímica fluorescente en secciones de cerebro de ratón frescas, congeladas o fijas

Presentamos un protocolo detallado para la microscopía correlativa de luz y electrónica posterior a la inclusión de Epon utilizando una proteína fluorescente llamada mScarlet. Este método puede mantener la fluorescencia y la ultraestructura simultáneamente. Esta técnica es susceptible de una amplia variedad de aplicaciones biológicas.

Microscopía electrónica y de luz correlativa de inclusión posterior a Epon

La hibridación in situ iterativa de fluorescencia asistida por expansión (EASI-FISH) es una técnica robusta que combina la microscopía de expansión con la hibridación in situ de fluorescencia (FISH) para detectar la expresión de múltiples genes en tejido grueso. Este protocolo describe los avances recientes en el método y su adaptación para etiquetar el sistema nervioso central intacto de Drosophila.

Detección múltiple de la expresión génica en el cerebro intacto de Drosophila mediante hibridación in situ de fluorescencia iterativa asistida por expansión

Este estudio presenta un protocolo simplificado para el procesamiento de tejidos que involucra decapitación, fijación, criosección, tinción de fluorescencia, inmunotinción e imágenes, que puede extenderse a imágenes confocales y multifotónicas. El método mantiene una eficacia comparable a las disecciones complejas, evitando la necesidad de habilidades motoras avanzadas. El análisis cuantitativo de imágenes ofrece un amplio potencial de investigación.

Criosección directa de cabezas de Drosophila para mejorar la tinción de fluorescencia cerebral y la inmunotinción

Aprende la hibridación in situ de doble fluorescencia en secciones de cerebro fresco para detectar dos transcritos simultáneamente con resolución de célula única. Este método permite estudiar la organización molecular de circuitos neuronales.

Doble fluorescencia In situ La hibridación en las secciones del cerebro fresco

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