Name: El organotípicos rebanada hipocampo modelo de cultivo para el examen de la lesión neuronal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-28T17:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Aprenda a generar cultivos de rebanadas organotípicas de hipocampo para estudiar lesiones neuronales. Este método permite cuantificar la muerte celular en las regiones CA1, CA3 y dentada mediante microscopía de inmunofluorescencia.

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Financiado por el NINDS, Asociación Americana del Corazón, Federación Americana de Investigación del Envejecimiento, March of Dimes

1. Preparación Antes de comenzar, reunir los instrumentos que se requieren cirugía, la disección y medios de cultivo, y siete días de ratas de edad o crías de ratón. El protocolo es el mismo para el ratón y los preparativos de la rata. (I) Los materiales y equipos <ul><li> Tijeras de operación (tramo recto de 6 ", cat # RS6818, Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li> Micro Tijeras de disección, (longitud de 4 ", cat # RS5910. Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li> Pinzas de acero al carbono Dumont (cat # RS-5045.Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li> Vidrio modificado con la "transferencia" pipetas (parte inferior de una pipeta Pasteur eliminado y se alisa el borde) </li><li> Aclar película de plástico cortadas a 2 "x 2" en las plazas (Honeywell, # 812071, Pottsville, PA) </li><li> Cubrir las esponjas 4 en el 3 en (Kendall, cat # 3157, Mansfield, MA) </li><li> 30 mm Millicell inserta la membrana (0,4 m; Millipore, Bedford, MA) </li><li> Mcllwain helicóptero de tejido con una hoja de afeitar de doble filo (chopper McIlwain tejido, la empresa Vibratome, St. Louis, MO) </li><li> Microscopio invertido con cámara CCD y el software de análisis de imagen </li></ul> (Ii) La disección media (DM, 1 litro a pH 7,3) <table border="0"><tbody><tr><td> Salina equilibrada de Hank </td><td> 1 vial (95,2 g/1L) (Sigma: H2387) </td></tr><tr><td> NHCO 3 (4,2 mM) </td><td> 350 mg </td></tr><tr><td> HEPES (10 mM) </td><td> 2,83 g </td></tr><tr><td> Glucosa (33,3 mM) </td><td> 6,0 g </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina (100 veces) </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> BSA (0,3%) </td><td> 300 mg </td></tr><tr><td> MgSO 4 7H 2 O </td><td> 1,44 g </td></tr></tbody></table> (Iii) medio de cultivo (400 ml) <table border="0"><tbody><tr><td> MEM (Invitrogen 11575-032) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> *** Salina equilibrada de Hank (Invitrogen 24020-117) </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> Suero de caballo (Invitrogen 26050-070) </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> Tampón HEPES (1 M; 15630-080 Invitrogen) </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina (100 veces) </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> *** Añadir 12,8 g de glucosa a balancear las sales de 500 ml de Hank antes de medio de cultivo </td></tr></tbody></table> (Iv) los animales 7 días de ratas de edad o crías de ratón postnatal, por lo general una camada al experimento. 2. En el Día de la Cultura <ol><li> Todas las herramientas de disección y la película de Aclar deben ser empapados en EtOH al 70% durante 30 minutos antes de comenzar. La superficie de la campana de la disección, la cuchilla, y el chopper de tejidos deben ser desinfectados con etanol. </li><li> Prepare varias (3-4) 6 placas de cultivo de tejidos, añadir 1 ml de medio de cultivo por pocillo, e insertar una membrana Millipore permeable en cada pozo. Colocar placas de 6 pocillos en el 37 º incubadora hasta el momento de la transferencia de las rebanadas. </li><li> Prepare varias (4-6) 60 mm placas con DM y el lugar en el hielo. </li><li> Rápidamente decapitar con unas tijeras y baño en EtOH al 70%, y rápidamente exponer el cerebro con una incisión sagital del cráneo. Retire con cuidado el cerebro y el lugar de inmediato en frío DM. Separarlo en dos hemisferios y el lugar cada lado medial del hemisferio hacia abajo sobre una esponja cubierta por 2-3 segundos. </li><li> Con cuidado, levante y el lugar del hemisferio en la plaza película Aclar y el lugar en el helicóptero de tejido, cortar el cerebro coronal en 350 secciones micras. Cuando termine, quite suavemente la plaza Alcar con el hemisferio seccionado y se sumergen en el frío DM. </li><li> Utilizando un microscopio de disección, separar las secciones del hipocampo. Para ratas, no debe ser de 5 secciones que abarcan rostral a caudal hipocampo, y para el ratón debe haber secciones 3-4. </li><li> Sacar las placas de 6 pocillos con inserciones de la membrana de la 37 ° tejido incubadora cultura. Transferencia de rodajas de hipocampo de forma individual en las membranas permeables con la pipeta de transferencia de cristal. Si demasiado DM se libera en la membrana, eliminar el exceso de DM con una pipeta Pasteur. Coloque cinco rodajas de hipocampo de cada membrana. Deje por lo menos tres pozos por condición, o rodajas de 15. </li><li> Incubar las placas de cultivo a 37 ° en un 5% de CO incubadora humidificada durante 12-14 días antes de comenzar el experimento de toxicidad. El medio de cultivo se pueden cambiar dos veces por semana. </li></ol> 3. Inducir y cuantificación de lesiones del hipocampo neuronal en Cultura Cortar <ol><li> Después de 12-14 días de cultivo, agregar 5 mg / ml de yoduro de propidio (PI) a los medios de cultivo. Este paso permitirá la visualización y cuantificación de la muerte de células basales. </li><li> Al día siguiente, cuantificar PIfluorescencia en la subregión CA1 (y / o CA3 o dentada, si lo desea) de cada rebanada del hipocampo y obtener decir las medidas de fluorescencia PI representa la muerte de células basales (en adelante, el tiempo = 0 horas, o T 0). Para la adquisición de imágenes y la cuantificación, se utiliza software Openlab (Improvisación, Reino Unido), pero la adquisición de imágenes y otros software de análisis puede ser utilizado para cuantificar la intensidad de fluorescencia. </li><li> Inmediatamente después de la adquisición de la imagen de T 0 PI fluorescencia, inducen daño neuronal por el método de elección (se han utilizado 10 M de NMDA, el oxígeno de glucosa en la privación, o LPS durante una hora para inducir toxicidad neuronal 2,5). Después del estímulo tóxicos, reemplace medio por medio fresco que contiene 5 mg / ml PI y mantener rebanadas durante la noche. </li><li> El día 3, cuantificar significa PI fluorescencia de la condición experimental a las 24 horas, o T-24. </li><li> Después de esta adquisición de imágenes, de inmediato cambio de medio y añadir 10 M de NMDA y 5 mg / ml PI y las rodajas de incubar durante la noche para conseguir la muerte neuronal máximo. </li><li> El día 4, cuantificar media de fluorescencia PI de la muerte neuronal máxima, definida como T max. Calcular la muerte celular por ciento de la siguiente manera: (T 24 - T 0) / (T max-T 0). </li></ol> 4. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2106/2106fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. (A) de la línea de tiempo para la generación de una lesión experimental del hipocampo y la posterior y la adquisición de la imagen. (B) Imágenes representativas de rodajas de hipocampo basal (T 0), 24 horas después de una exposición de 1 hora a 10 M de NMDA (T 24), y después de otros 24 ó 10 M de NMDA para obtener una lesión neuronal máxima (T max).

<ol><li>Stoppin, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37 (2), 173-173 (1991).</li>
<li>McCullough, L., Wu, L., Haughey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+Function+of+the+PGE2+EP2+Receptor+in+Cerebral+Ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective Function of the PGE2 EP2 Receptor in Cerebral Ischemia.</a> J Neurosci. 24 (1), 257-257 (2004).</li>
<li>Czapiga, M., Colton, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+microglia+in+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Function of microglia in organotypic slice cultures.</a> J Neurosci Res. 56, 644-644 (1999).</li>
<li>Newell, D. W., Barth, A., Papermaster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+and+non-glutamate+receptor+mediated+toxicity+caused+by+oxygen+and+glucose+deprivation+in+organotypic+hippocampal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate and non-glutamate receptor mediated toxicity caused by oxygen and glucose deprivation in organotypic hippocampal cultures.</a> J Neurosci. 15, 7702-7702 (1995).</li>
<li>Wu, L., Wang, Q., Liang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+Effects+of+prostaglandin+recetor+signaling+on+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+letter%22%5BJournal%5D)">Divergent Effects of prostaglandin recetor signaling on neuronal survival.</a> Neuroscience letter. 421, 253-253 (2007).</li>
<li>Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R., R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+in+vitro%3A+Analysis+of+morphology+and+adhesion+molecule+expression+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells in vitro: Analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Glia. 18, 319-319 (1996).</li>
</ol>

Hay dos puntos importantes a seguir para asegurar resultados reproducibles y consistentes al replicar los experimentos. En primer lugar, es importante que la edad rodajas de hipocampo de 12-14 días antes de la experimentación. Con el aislamiento de corte, hay una respuesta microglial significativa, y microglia permanecerá activada durante un tiempo, con un retorno a un estado de reposo ramificado que ocurre a los 10 días in vitro 3,6. En segundo lugar, la intensidad media de fluorescencia PI es propo...

el organotípicos rebanada hipocampo modelo de cultivo para el examen de la lesión neuronal

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Cultivo organotípico parte del hipocampo es un método in vitro para examinar los mecanismos de lesión neuronal en el que es relativamente la arquitectura básica y la composición del hipocampo conserva una. El sistema de cultivo organotípico permite el examen de los efectos neuronales, astrocitos y microglia, sino como una preparación ex vivo, no se refiere a los efectos del flujo sanguíneo, o el reclutamiento de células inflamatorias periféricas. A tal fin, este método de cultivo se utiliza con frecuencia para examinar una lesión excitotóxica y de hipoxia en las neuronas piramidales del hipocampo, sino que también ha sido utilizado para examinar la respuesta inflamatoria. En este documento se describen los métodos para la generación de las culturas del hipocampo sector a partir de cerebro de roedores después del parto, la administración de estímulos tóxicos para inducir daño neuronal, y analizando y cuantificando la muerte neuronal del hipocampo.

El organoptypic modelo del hipocampo es una parte la cultura<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para examinar el daño neuronal en una variedad de paradigmas. En este artículo se describen los métodos para la generación de culturas de corte y la cuantificación de la lesión neuronal.

El organotípicos rebanada hipocampo modelo de cultivo para el examen de la lesión neuronal

El cultivo de cortes organotípicos de hipocampo es un método in vitro para examinar los mecanismos de lesión neuronal en el cual la arquitectura y composición básicas de...

El objetivo general de este procedimiento es generar cultivos organotípicos de cortes hipocampales que puedan utilizarse para modelar lesiones neuronales en respuesta a diversos estímulos, incluyendo NMDA, excitotoxicidad, privación de oxígeno y glucosa, o estímulos inflamatorios como el lipopolisacárido o el péptido beta amiloide. Esto se logra primero aislado el cerebro posnatal y seccionando cada hemisferio para generar cortes coronales. El segundo paso del procedimiento consiste en aislar las regiones hipocampales y cultivarlas en insertos de membrana en placas de seis pocillos. Tras cultivar los cortes, se tiñen con yoduro de propidio y se calcula el nivel de muerte neuronal espontánea.Finalmente, los cortes se tratan con un agente neurotóxico y se tiñen nuevamente para medir la respuesta de toxicidad al tratamiento. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren el porcentaje de muerte neuronal en las regiones CA1, CA3 y giro dentado del hipocampo a través de las diferentes condiciones experimentales, mediante la cuantificación de la fluorescencia del yoduro de propidio utilizando microscopía de inmunofluorescencia. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos existentes, como la cultura primaria de neuronas, es que el mecanismo de lesión neuronal se examina en una preparación en la que la arquitectura básica del hipocampo se mantiene relativamente intacta.Y el tercer tipo incluye ejercicio. Las microglías y ROY se conservan antes de comenzar la disección. Inserte una membrana permeable de Millipore en cada una.Añada un mililitro de medio de cultivo a cada pocillo de varias placas de cultivo celular de seis pocillos. Incube las placas en un incubador a 37 grados Celsius.Sumerja brevemente la cabeza decapitada de una cría de rata de siete días en etanol al 70%. Para desinfectarla, use tijeras de disección microquirúrgicas para realizar una incisión sagital a través del cráneo y exponer el cerebro. Use pinzas para extraer rápidamente el cerebro y transfiéralo a una placa de 60 milímetros con medio de disección sobre hielo.Utilice pinzas para separar el cerebro en dos hemisferios. Coloque cada hemisferio con el lado medial hacia abajo sobre una esponja de cubierta seca durante dos o tres segundos para recoger cualquier exceso de humedad. Transfiera el cerebro a un cuadrado de película clar y colóquelo en la plataforma de una cortadora de tejidos, cortando en secciones coronales de 350 micrones comenzando en el rostral.Y continúe suavemente. Levante con cuidado el cuadrado de A clar e introduzca las secciones en un nuevo recipiente con medio de disección frío con hielo. Bajo un microscopio estereoscópico, identifique el hipocampo, una estructura con forma de C invertida que se encuentra debajo de la corteza cerebral y adyacente al estriado.Utilice pinzas para separar el hipocampo de cada sección coronal. Utilice una pipeta de Pasteur modificada según se describe en el texto para transferir cinco secciones del hipocampo a cada membrana. Inserte en las placas de seis pocillos preparadas y calentadas.Elimine cualquier medio excesivo sobre la superficie de la membrana. Incube las placas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 12 a 14 días. Tras 12 a 14 días en cultivo, cambie el medio según se detalla en el texto adjunto, sustituya el medio y añada cinco microgramos por mililitro por pum de yoduro, abreviado pi, para permitir la visualización y cuantificación de la muerte celular basal.Incube las secciones durante la noche a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono bajo un microscopio de fluorescencia invertido conectado a una cámara CCD. Capture imágenes de la sección a 40 x de magnificación en este momento. Registre la fluorescencia de PI correspondiente a los niveles basales de muerte celular en el tiempo igual a cero horas o T cero inmediatamente después de la adquisición de imágenes. Las secciones inducen lesión neuronal con el método preferido para el experimento actual.Aquí, los cortes se incuban con medio fresco que contiene 10 micromolares de NMDA durante una hora a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Después del tratamiento neurotóxico, reemplace el medio con medio de cultivo fresco que contenga cinco microgramos por mililitro de pi.Incubar las secciones durante la noche a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono imagen de la fluorescencia de PI tras el tratamiento neurotóxico. Las mediciones medias de fluorescencia para este punto temporal representan los niveles de muerte celular. Tras 24 horas de lesión experimental, o T 24 horas, reemplace inmediatamente el medio con medio de cultivo fresco que contenga 10 micromolares de NMDA y cinco microgramos por mililitro.Incubar las secciones con PI durante toda la noche a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono para lograr la muerte neuronal máxima. Adquirir el conjunto final de imágenes de fluorescencia de PI, las mediciones de fluorescencia media para este punto temporal. Representan los niveles máximos de muerte celular o Tmax.Cuantifique la fluorescencia de yodo de propidio en la región de interés utilizando software de análisis de imágenes, como se describe en el texto adjunto. Esta es una imagen representativa de la tinción con yodo de propidio de la muerte neuronal basal en la región CA1 del hipocampo. A continuación se muestra una imagen representativa de la muerte neuronal teñida con yodo de propidio.24 horas después de un tratamiento de una hora con NMDA 10 micromolar, observe la tinción más intensa que indica un mayor grado de muerte celular. Esta imagen muestra la tinción máxima de yoduro de propidio tras una incubación nocturna con NMDA 10 micromolar. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar cortes orgánicos de hipocampo y medir el grado de lesión neuronal.

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Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Se describe un método para preparar organotípicos rodajas de hipocampo que se pueden adaptar fácilmente a otras regiones del cerebro. Cortes de cerebro se ponen en membranas porosas y medios de cultivo se le permite formar una interfase. Este método conserva la arquitectura bruto del hipocampo durante un máximo de 2 semanas en la cultura.

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Este video muestra un método para preparar cultivos organotípicos de cortes de hipocampo a partir del cerebro de un cachorro de rata. Describe los pasos involucrados en la disección del hipocampo, el corte y las condiciones de cultivo necesarias para promover la viabilidad y el crecimiento celular en las rodajas del hipocampo, generando en última instancia cultivos de cortes organotípicos.

Preparación de cultivos organotípicos de cortes a partir del hipocampo de un cachorro de rata

El cocultivo de cortes de cerebro organotípicos con células de carcinoma permite visualizar cambios morfológicos por fluorescencia, así como de campo brillante (vídeo) microscopía durante el proceso de la invasión de células de carcinoma de tejido cerebral. Este sistema modelo también permite enfoques de cambio de células y de reposición y ofrece una amplia variedad de manipulaciones y análisis.

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