El organotípicos rebanada hipocampo modelo de cultivo para el examen de la lesión neuronal

El objetivo general de este procedimiento es generar cultivos organotípicos de cortes de hipocampo que se puedan utilizar para modelar la lesión neuronal en respuesta a una variedad de estímulos, incluidos NMDA, excitotoxicidad por oxígeno, privación de glucosa o estímulos inflamatorios como el lipopolisacárido o el péptido beta amiloide. Esto se logra primero aislando el cerebro postnatal y cortando cada hemisferio para generar sucesos coronales. El segundo paso del procedimiento es aislar las regiones del hipocampo y cultivarlas en insertos de membrana en seis placas de pocillos. Después de cultivar las secciones, las secciones se tiñen con yoduro de propidio y se calcula el nivel de muerte neuronal espontánea.

Finalmente, las rodajas se tratan con un agente neurotóxico y se vuelven a tinturar para medir la respuesta de toxicidad al tratamiento. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el porcentaje de muerte neuronal en las regiones CA uno, CA tres y dentadas del hipocampo en condiciones experimentales a través de la cuantificación de la fluorescencia de yoduro de propidio mediante microscopía de inmunofluorescencia. La principal ventaja de la técnica mínima sobre la ya existente, al igual que un cultivo neuronal primario, es el mecanismo de lesión neuronal en el que se examina la arquitectura básica del hipocampo está relativamente intacta.

Y el tercer tipo incluye el ejercicio. La microglía y la grasa se conservan antes de comenzar la disección. Inserte una membrana permeable a miliporos en cada uno.

Pues añade un mililitro de medio de cultivo a cada pocillo de varios. Placas de cultivo de tejidos de seis pocillos. Calienta las placas en una incubadora a 37 grados centígrados.

Sumerja brevemente la cabeza decapitada de un cachorro de rata al 70% en etanol al 70%. Para desinfectarlo se utilizaron tijeras de micro disección para hacer una incisión sagital a través del cráneo para exponer el cerebro. Use fórceps para extraer rápidamente el cerebro y transferirlo a un plato de 60 milímetros de medio de disección en hielo.

Use fórceps para separar el cerebro en dos hemisferios. Coloque cada hemisferio con el lado medial hacia abajo sobre una esponja de cubierta seca durante dos o tres segundos para recoger el exceso de humedad. Transfiera el cerebro a un cuadrado de una película clar y colóquelo en la plataforma de un corte de tejido coronal en secciones de 350 micras comenzando en el rosland.

Y continuando mimosamente. Levante suavemente el cuadrado A clar y sumerja las rodajas en un plato fresco de medio de disección helado. Bajo un microscopio de disección, identifique el hipocampo, una estructura en forma de CS que se encuentra debajo de la corteza cerebral, mimada hasta el cuerpo estriado.

Use fórceps para separar el hipocampo de cada sección coronal. Utilice una pipeta Pasteur modificada como se describe en el texto para transferir cinco cortes de hipocampo a cada membrana. Inserte en las placas calientes preparadas de seis pocillos.

Elimine cualquier exceso de medio en la superficie de la membrana. Incubar las placas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 12 a 14 días. Cambiando el medio como se detalla en el texto adjunto después de 12 a 14 días en cultivo, cambie el medio y agregue cinco microgramos por mililitro por pomo de yoduro, abreviado pi para permitir la visualización y cuantificación de la muerte basocelular.

Incubar las rodajas durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono bajo un microscopio de fluorescencia invertida conectado a una cámara CCD Esta vez capture imágenes de la rebanada con un aumento de 40x. El punto captura la fluorescencia PI correspondiente a los niveles basales de muerte celular en un tiempo igual a cero horas o T cero inmediatamente después de la obtención de imágenes. Los cortes inducen lesiones neuronales con el método preferido para el experimento actual.

Aquí, las rodajas se incuban con medio fresco que contiene 10 micromolares NMDA durante una hora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de un tratamiento neurotóxico. Reemplace el medio con un medio de cultivo fresco que contenga cinco microgramos por mililitro pi.

Incubar las rodajas durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono imagen de la fluorescencia PI después del tratamiento neurotóxico. Las mediciones medias de fluorescencia para este punto de tiempo representan los niveles de muerte celular. Después de 24 horas de lesión experimental, o T 24 horas, reemplace inmediatamente el medio con un medio de cultivo fresco que contenga 10 micromolares NMDA y cinco microgramos por mililitro.

PI incuba las rodajas durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono para lograr la máxima muerte neuronal. Adquiera el conjunto final de imágenes de fluorescencia PI, las mediciones medias de fluorescencia para este punto de tiempo. Representan los niveles máximos de muerte celular o Tmax.

Cuantifique la fluorescencia PI en la región de interés utilizando un software de análisis de imágenes como se describe en el texto adjunto. Esta es una imagen representativa de la tinción PI de la muerte neuronal basal en la región aproximadamente uno del hipocampo. Aquí hay una imagen representativa de la muerte neuronal teñida con PI.

24 horas después de un tratamiento de una hora con NMDA de 10 micromolares, observe la tinción más intensa que indica un mayor grado de muerte celular. Esta imagen muestra la tinción máxima de PI después de una incubación nocturna con NMDA de 10 micromolares. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar un corte orgánico del hipocampo y el nivel de medición de una lesión neuronal.