Fabricación de materiales de origen biológico inyectable para ingeniería de tejidos del miocardio

Los geles de matriz producidos a partir de tejido pericárdico y miocárdico descelularizado conservan componentes nativos de la matriz extracelular, incluyendo diversas proteínas, péptidos y glucosaminoglicanos. Estas matrices tisulares pueden utilizarse en ingeniería de tejidos. En este video, los geles de matriz se fabrican descelularizando tejido pericárdico para obtener una matriz extracelular acelular.

La matriz extracelular se procesa luego para crear una versión líquida solubilizada. A continuación, se evalúa la matriz solubilizada en un modelo animal pequeño para determinar su viabilidad como andamio inyectable. El análisis histológico e inmunohistoquímico demuestra que, in vivo, el material inyectado forma un andamio fibroso poroso que permite la infiltración de células vasculares.

Hola, mi nombre es Sonia Zeki. Soy estudiante de posgrado en el laboratorio de la Dra. Karen Chrisman en la Universidad de California en San Diego. Hoy fabricaremos matriz extracelular solubilizada a partir de tejido descelularizado y demostraremos pruebas in vivo para aplicaciones en ingeniería de tejidos cardíacos.

Estas técnicas son importantes para el desarrollo de una terapia con biomateriales inyectables para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca. Posterior al infarto de miocardio, se muestra el procedimiento quirúrgico realizado por Pam, filmado por McGuffin, un neurocirujano veterinario en nuestro laboratorio. Comencemos.

Comience este protocolo descelularizando el tejido para dejar únicamente la matriz extracelular o MEC: coloque primero el pericardio porcino en un vaso de precipitados con agua desionizada y lávelo agitando durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después del lavado, coloque el tejido en PBS 1X que contenga SDS al 1% y penicilina-estreptomicina al 1%, y agite continuamente durante 24 horas a temperatura ambiente. Al día siguiente, devuelva el tejido al agua desionizada y agite continuamente durante cinco horas, agitando en un tubo de 50 mililitros hasta que desaparezca toda la espuma.

La tinción con hematina y eosina debe revelar la ausencia de núcleos en el tejido descelularizado. Coloque el resto del tejido descelularizado en un tubo cónico de 15 a 50 mililitros. A continuación, coloque el tejido en el congelador a menos 80 grados Celsius.

Liofilice las muestras congeladas mediante secado por congelación bajo presión muy baja y temperatura muy baja hasta que estén completamente secas. Dependiendo del sistema utilizado y del contenido de agua de las muestras, este proceso puede tardar entre 12 y 72 horas. Una vez que el tejido descelularizado esté completamente seco, transfiéralo a un molino Wiley Minim.

Con un tamiz de malla 40, triture el tejido hasta obtener un polvo fino. Una vez que la mayor parte de la muestra haya pasado a través del filtro, retire el frasco de recolección. Esta muestra ahora se denomina matriz extracelular o polvo de ECM.

Puede realizarse un segundo paso de liofilización en este momento, si no se continúa inmediatamente con el siguiente paso. Esto asegura la precisión del peso registrado para solubilizar la MEC. Pese la cantidad deseada de polvo de MEC en un vial estéril.

Añada solución estéril filtrada de cloruro de hidrógeno que contenga un miligramo por mililitro. Pepcid al vial de centelleo con el polvo de ECM de modo que el ECM alcance una concentración de 10 miligramos por mililitro. Añada una barra de agitación y coloque el vial en la placa agitadora.

Agite continuamente durante 48 a 60 horas, raspando periódicamente las paredes del vial con una cuchara o espátula estéril WHE, para asegurar la digestión de todo el polvo de MEC. A medida que el MEC se digiere, pasará a solución.

Una vez que la MEC se haya solubilizado, coloque la muestra en hielo y ajuste el pH a 7,4 utilizando hidróxido de sodio y ácido clorhídrico. Una vez ajustado el pH, agregue PBS 10 veces concentrado para que la concentración final de la solución sea PBS 1 vez. Por ejemplo, si tiene 900 microlitros de solución de MEC, tras el ajuste de pH, debe añadirse 100 microlitros de PBS 10 veces concentrado.

Determine la concentración de la solución de MEC solubilizada sumando los volúmenes agregados para la neutralización y los volúmenes retirados para probar el pH. Luego, añada PBS 1× para alcanzar la concentración final deseada aquí. Seis miligramos por mililitro.

El día de la cirugía, prepare una inyección de 75 microlitros de MEC solubilizada en una jeringa de 0,1 mililitros con una aguja de calibre 30. Mantenga la anestesia de una rata hembra Harlan Dolly intubada con un 2,5% de fluoruro de isoflurano. Aplique un parche ocular y luego verifique la anestesia realizando una compresión del dedo del pie.

Administre tres mililitros de solución de Ringer con lactato mediante inyección subcutánea en la región abdominal inferior para hidratar. A continuación, coloque al animal en posición supina sobre la mesa quirúrgica y sujete suavemente las extremidades con cinta adhesiva. Utilice una máquina de afeitar para eliminar el vello abdominal y aspire el vello suelto.

Realice una serie de inyecciones de 50 microlitros de lidocaína al 2% a lo largo de una diagonal que vaya desde el apéndice xifoides hasta la parte inferior derecha del abdomen. Luego, limpie tres veces con Betadine comenzando desde el centro y moviéndose hacia afuera. Repita la limpieza con alcohol isopropílico.

Luego cubra al animal con una gasa quirúrgica que tenga una ventana circular preformada. Sujete con una gasa quirúrgica. Utilizando un escalpelo número 10.

Realice una incisión de tres a cuatro centímetros desde el proceso xifoides hasta el lado inferior derecho del abdomen. Localice el proceso xifoides y diséquelo verticalmente hacia abajo a través del músculo hacia la derecha, teniendo cuidado de evitar el vaso grande situado a la derecha. A continuación, use tijeras para cortar lateralmente a través del músculo, exponiendo el diafragma.

Tenga cuidado para evitar el hígado utilizando un trozo de sutura Vicryl 3-0 de 36 pulgadas de longitud y un par de hemostatos. Pase una aguja a través del proceso xifoides y tire de la sutura hasta la mitad. Una los extremos de la sutura con cinta adhesiva y fíjelos a un punto por encima y detrás del animal, elevando el xifoides y exponiendo el diafragma con otro trozo de sutura Vicryl 3-0 de 36 pulgadas de longitud.

Introduzca una aguja a través del músculo más cercano al apéndice xifoides y, nuevamente, pásela y sujete el extremo a otro punto situado a la derecha de la mesa quirúrgica, exponiendo completamente la cavidad quirúrgica. A continuación, utilizando un pequeño par de pinzas microscópicas dentadas, agarre el centro del diafragma, extráigalo y realice una incisión muy pequeña con tijeras romas. Una vez realizada esta abertura, los pulmones se retraerán.

Realice una incisión vertical de dos a tres centímetros a través del diafragma para visualizar el corazón. Luego, inserte un hisopo de tres pulgadas a la izquierda de la cavidad y empuje los pulmones hacia un lado. Sujete el hisopo en su lugar utilizando una pinza de toalla.

Con otro hisopo, mueva el pulmón derecho para localizar la bolsa pericárdica. Luego, utilizando un par de pinzas microfinas y un par de pinzas grandes dentadas, rompa la bolsa pericárdica para exponer el ápice del corazón. Sujete el ápice del corazón con las pinzas microfinas dentadas derechas e inserte la aguja para inyectar la matriz solubilizada con el bisel orientado hacia la izquierda.

A un tercio del camino desde el ápice paralelo a la superficie epicárdica. Asegúrese de evitar la vena cardíaca magna. Inyecte el gel de matriz solubilizado y espere unos segundos antes de retirar la aguja.

El tejido debe blanquearse en el sitio de inyección; seque la sangre en la cavidad y retire la pinza de gasa y el hisopo que sostienen el pulmón derecho utilizando hemostatos microcurvos; haga un nudo inicial con un trozo de sutura de prolina 5-0 de 30 pulgadas de longitud. Luego, use pinzas microdentadas para cerrar el diafragma con una sutura continua y una aguja cónica antes de cerrar por completo. Introduzca un tubo de succión PE 160 y cierre alrededor utilizando una jeringa de 10 mililitros para evacuar la cavidad torácica.

Al tensar la sutura, el diafragma debe quedar cóncavo. Reduzca el flujo de óxido nitroso al 1%. Retire ambas suturas de Vicryl 3-0 que mantienen abierta la cavidad. Hidrate el músculo eliminando el exceso con un hisopo o gasa estéril.

Utilice una nueva longitud de sutura 3-0 para cerrar la capa muscular con puntos intermitentes. Luego apague el isoflurano. Limpie el área y use grapas para cerrar la piel.

Luego, aplique una pomada antibiótica triple en el sitio de la incisión. Permita que la rata se recupere bajo oxígeno al 100 %. Cuando el animal comience a respirar por sí solo, retire el tubo traqueal.

Una vez que el animal esté nuevamente de pie, administre una inyección subcutánea de 0,05 miligramos por kilogramo de analgésico clorhidrato de buprenorfina y devuélvalo a su jaula de alojamiento sobre una toalla estéril. El tejido cardíaco de ratas inyectadas con geles de matriz solubles se seccionó y tiñó con hemat, eoin y toin para el análisis macroscópico del tejido en diferentes puntos temporales. Tras la cirugía, en los puntos temporales tempranos, la región inyectada aparece como una red fibrosa rosada que se ha diseminado intersticialmente en puntos temporales posteriores.

Se observa la afluencia de células después de dos semanas. Se aprecia la degradación de la matriz inyectada. Si la matriz extracelular se marcó con biotina antes de la inyección, puede visualizarse de manera más directa tiñendo la biotina con estreptavidina conjugada a HRP para observar el crecimiento y la formación de vasos en la región de inyección de la matriz.

Las muestras aquí han sido doblemente marcadas con un fitzil. La selectina conjugada, que se une a las células endoteliales mostradas en verde, y un anticuerpo antis músculo liso contra la actina mostrado en rojo. Las células madre también pueden identificarse cerca de la región de inyección.

Aquí han sido visualizados mediante una tinción de inmunohistoquímica para C kit. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear matriz extracelular solubilizada a partir de tejido descelularizado y probarla in vivo para aplicaciones de ingeniería de tejidos cardíacos. No olvide que, aunque utilizamos tejido pericárdico, este procedimiento general puede modificarse para usarse con cualquier fuente de tejido.

Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.