Estudio de células gliales Influencia heterogeneidad de crecimiento de los axones se utiliza un método co-cultivo de Nueva

El objetivo general de este procedimiento es estudiar la influencia de la heterogeneidad glial en el crecimiento de axones de DRG y la deión celular. Esto se logra primero Turing de las células gliales de la corteza de rata neonatal. El segundo paso del procedimiento es cultivar y purificar las neuronas DRG del embrión de rata.

El tercer paso del procedimiento es agregar las neuronas DRG purificadas a las células gliológicas. El paso final del procedimiento es observar el crecimiento del exón en el aión celular y llevar a cabo el análisis de tinción y cuantificación celular. En última instancia, se pueden obtener resultados.

Esto demuestra que el crecimiento de las neuronas DRG está influenciado por células gliales heterogéneas a través del registro de lapso de tiempo y la microscopía de inmunofluorescencia. Hola, soy de pertenecer al laboratorio de neuro Imagine en el Departamento de Neurología de UCRA. Hoy os mostramos un procedimiento para estudiar la influencia hidrogenada de las células G en el crecimiento en un nuevo método de cultivo de coches.

En nuestro laboratorio, utilizamos este nuevo método para estudiar la interacción entre las neuronas y las células ggl. Así que vamos a probar el estudio. Con el fin de establecer un cocultivo de neuronas ganglionares gliales y de raíz dorsal o DRG, comenzaremos cultivando células gliales bajo una campana de cultivo de tejidos Cubra los fondos de las placas de cultivo preesterilizadas de 24 pocillos con cubreobjetos de vidrio redondos esterilizados, cubra los cubrebocas en los pocillos de una placa de cultivo de seis pocillos con polilisina e incube durante dos horas a temperatura ambiente.

Lave los cubreobjetos y las placas de cultivo dos veces con agua destilada y séquelos al aire. A continuación, pipetee 200 microlitros o dos mililitros de medio águila modificado dcos o DMEM con 10% de suero bovino fetal o FBS en cada placa de 24 pocillos o seis pocillos, respectivamente. Incubar las placas a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5% al día siguiente.

Esterilice la campana de disección de flujo positivo. Encienda la luz ultravioleta durante 20 minutos y luego rocíe todas las superficies debajo del capó con etanol al 70% y espere 15 minutos antes de usar. Comience con las cabezas de dos cachorros de rata P dos a P seis que fueron anestesiadas por hipotermia.

Luego decapitado en la base del foram y magnum con tijeras de operación. Abra el cráneo a lo largo de la sutura sagital con unas tijeras de iris y despegue el cráneo. Retire el prosencéfalo y colóquelo en un levés frío con L 15 y repita con la segunda cabeza.

Luego trabajando bajo un microscopio estereoscópico. Retire con cuidado las membranas de la duramadre y los pares y los vasos sanguíneos que cubren el cerebro. Aísle la corteza y lávela varias veces con L 15 medio.

Use tijeras de microcirugía para cortar la corteza en pedazos pequeños. A continuación, incubar un medio L 15 que contenga 0,125% de viajes en EDTA a 37 grados centígrados durante 15 minutos. A continuación, transfiera los bloques de tejido a un tubo de 50 mililitros que contenga 20 mililitros de DMEM con 20% de FBS.

Añadir DS hasta una concentración final de 10 microgramos por mililitro. A continuación, utilice una pipeta de pasta pulida al fuego para agitar la solución de tejido aproximadamente 20 veces para separar las células. Finalmente, lavar las células una vez con DMEM que contiene 10%FBS, determine el número de células con un hemocitómetro.

A continuación, siembre las células a 5.000 a 10.000 células por centímetro cuadrado e incube a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Reemplace el medio dos veces por semana para aislar, purificar y cultivar DRG. Primero prepare placas de 24 pocillos con cubreobjetos de vidrio recubiertos de polilisina como se demostró anteriormente.

Agregue 100 microlitros de medio NVF a cada cubreobjetos e incube las placas a 37 grados centígrados al día siguiente. Esterilice la campana de flujo positivo como antes. Luego comience con embriones de rata E 12 a E 15 que se aislaron del útero de una rata embarazada eutanasia con dióxido de carbono bajo el microscopio estereoscópico.

Aísle la médula espinal con los ganglios de la raíz dorsal conectados y transfiéralo a placas de 35 milímetros que contengan levo v refrigerados. L 15 medio. Con pinzas de microcirugía, diseccione cuidadosamente los DRG conectados de la médula espinal enfriada en medio L 15 sin lesionar los DRG y corte los axones conectados.

Por lo general, se aíslan de 20 a 30 GRD de una médula espinal cuando todos los GRD se han aislado de la médula espinal. Todos los DRG aislados en 0,125% viajan en EDTA e incuban durante 20 minutos a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono lavan las células una vez, DMEM con 20% de FBS, luego agregan ADNs y pipetean varias veces usando una pipeta de pasta pulida al fuego para formar una suspensión celular uniforme como se demostró con las células gliales. Realice un segundo lavado en medio MBF, cuente las células, luego siembre las células en los cubrebos preparados en 24 placas de pocillos a 5, 000 células por pocillo incube durante la noche para purificar las neuronas DRG.

De 18 a 24 horas después de la siembra. Reemplace el medio con medio neuro basal que contenga 20 micromolares cinco fluoro dos doxy uridina 72 horas después. Reemplace la mitad del medio con medio neuro basal que carezca de FUDR.

Luego, el medio se reemplaza cada dos días. Aproximadamente 20 días después de la siembra de las células gliales. Alcanzarán la confluencia y estarán listas para el cocultivo con las neuronas 24 horas antes de combinar los dos tipos de células.

Reemplace el medio celular glial con medio MBF. Prepare una suspensión de una sola célula de DRG purificados como se demostró anteriormente. Determine la densidad de celdas.

A continuación, siembra las neuronas a 500 células por centímetro cuadrado sobre las células gliales. El crecimiento de las neuronas y las neuritas en las células gliales se puede analizar en varios puntos de tiempo utilizando software de análisis de imágenes e inmunoquímica con anticuerpos específicos del tipo de célula. Estos son ejemplos de células gliales y neuronas DRG cultivadas por separado y, como cocultivo, las células gliales se vuelven confluentes después de 20 días.

En la cultura. Bajo un microscopio de contraste de fase, fue evidente que las diferentes subpoblaciones de células gliales forman patrones de crecimiento y morfologías distintas. Y por inmunocitoquímica, los astrocitos positivos para GFAP representaron más del 90% del cultivo.

Utilizando nuestro método de tratamiento con FUDR durante 72 horas, la pureza de las neuronas DRG alcanzará hasta el 99% en seis días y exhibirá sus morfologías únicas con una alta densidad de crecimiento de neuritas en un cocultivo de neuronas y células gliales. El crecimiento de las neuronas aian y neuritas DRG ocurrió rápidamente en las células gliales dentro de las cuatro horas posteriores a la siembra El crecimiento de las neuronas aian y neuritas fue influenciado por las subpoblaciones de células gliales, que forman subestructuras de patrones de crecimiento especiales que podrían identificarse fácilmente bajo un microscopio de contraste de fase. Y por inmunocitoquímica solo le mostraré cómo cultivar neuronas DRG con células claras para estudiar la influencia de la heterogeneidad de las células ggl en el crecimiento neurológico.

Al realizar esta sesión, es muy importante recordar manipular el tejido con mucha franqueza y mantener las células en el medio. Nunca los expongas al aire, déjalos secar. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.