Estudio de células gliales Influencia heterogeneidad de crecimiento de los axones se utiliza un método co-cultivo de Nueva

El objetivo general de este procedimiento es estudiar la influencia de la heterogeneidad glial sobre el crecimiento de los axones del ganglio dorsal de la raíz (DRG) y la despolarización celular. Esto se logra primero convirtiendo las células gliales del cortex de rata neonatal. El segundo paso del procedimiento consiste en cultivar y purificar las neuronas del ganglio dorsal de la raíz (DRG) de embrión de rata.

El tercer paso del procedimiento consiste en agregar las neuronas de los ganglios dorsales purificadas sobre las células gliales. El paso final del procedimiento es observar el crecimiento de los exones en el axón celular y realizar tinción celular y análisis de cuantificación. Finalmente, se pueden obtener los resultados.

Ese estudio muestra que el crecimiento de las neuronas del ganglio dorsal está influenciado por células gliales heterogéneas mediante grabaciones de lapso de tiempo y microscopía de inmunofluorescencia. Hola, soy del laboratorio de neuroimagen del Departamento de Neurología de la UCRA. Hoy les mostraremos un procedimiento para estudiar la influencia heterógena de las células gliales sobre el crecimiento mediante un nuevo método de cultivo celular.

En nuestro laboratorio, utilizamos este nuevo método para estudiar la interacción entre neuronas y células gliales. Así que comencemos el estudio. Con el fin de establecer un cultivo conjunto de células gliales y neuronas del ganglio de la raíz dorsal o DRGs, comenzaremos cultivando células gliales bajo una campana de cultivo de tejidos. Forre los fondos de placas de cultivo preesterilizadas de 24 pocillos con cubreobjetos circulares de vidrio esterilizados, recubra los cubreobjetos en los pocillos de una placa de cultivo de seis pocillos con polilisina e incube durante dos horas a temperatura ambiente.

Lave las laminillas y las placas de cultivo dos veces con agua destilada y deje secar al aire. A continuación, pipetee 200 microlitros o dos mililitros de medio de Eagle modificado con DCOS o DMEM con 10% de suero bovino fetal o FBS en cada placa de 24 pocillos o de 6 pocillos, respectivamente. Incube las placas a 37 grados Celsius en 5% de dióxido de carbono al día siguiente.

Sterilice la cabina de flujo laminar. Encienda la luz ultravioleta durante 20 minutos y luego rocíe todas las superficies dentro de la cabina con etanol al 70 % y espere 15 minutos antes de usarla. Comience con las cabezas de dos crías de rata P2 a P6 que fueron anestesiadas mediante hipotermia.

Luego, seccionar la cabeza en la base del foramen magno con tijeras quirúrgicas. Abrir el cráneo a lo largo de la sutura sagital utilizando tijeras de iris y retirar el cráneo. Extraer el prosencéfalo y colocarlo en L-15 de Leibovitz frío, y repetir el procedimiento con la segunda cabeza.

Luego, trabaje bajo un microscopio estereoscópico. Retire cuidadosamente las membranas duras y piamadre y los vasos sanguíneos que cubren el cerebro. Aísle la corteza y lávela varias veces con medio L 15.

Utilice tijeras de microcirugía para cortar la corteza en pequeños trozos. A continuación, incube en un medio L 15 que contiene 0,125 % de tripsina en EDTA a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Después, transfiera los fragmentos de tejido a un tubo de 50 mililitros que contenga 20 mililitros de DMEM con 20 % de FBS.

Añada DS hasta una concentración final de 10 microgramos por mililitro. Luego, use una pipeta de pasta pulida con llama para agitar la solución de tejido aproximadamente 20 veces con el fin de separar las células. Finalmente, lave las células una vez con DMEM que contenga 10% de FBS y determine el número de células con un hemocitómetro.

Luego siembre las células a una densidad de 5.000 a 10.000 células por centímetro cuadrado e incube a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Cambie el medio dos veces por semana para aislar, purificar y cultivar los DRG. Primero prepare placas de 24 pocillos con cubreobjetos de vidrio recubiertos con polilisina, como se demostró anteriormente.

Añada 100 microlitros de medio NVF a cada cubreobjetos e incube las placas a 37 grados Celsius al día siguiente. Esterilice la cabina de flujo laminar como antes. A continuación, comience con embriones de rata de E12 a E15 que fueron aislados del útero de una rata preñada sacrificada con dióxido de carbono bajo el microscopio estereoscópico.

Aísle las médulas espinales con los ganglios de la raíz dorsal conectados y transfiéralas a placas de 35 milímetros que contengan medio L 15 frío. Utilizando pinzas de microcirugía, disecar cuidadosamente los ganglios de la raíz dorsal conectados de las médulas espinales en medio L 15 frío sin dañar los ganglios de la raíz dorsal, cortando los axones conectados.

Normalmente se aíslan entre 20 y 30 ganglios de la raíz dorsal de un cordón espinal cuando todos los ganglios de la raíz dorsal se han aíslado de los cordones espinales. Lave las células una vez con DMEM que contenga 20 % de suero bovino fetal, luego agregue ADN y pipetee varias veces utilizando una pipeta de vidrio pulida al fuego para formar una suspensión celular uniforme, como se demostró con las células gliales. Realice un segundo lavado en medio MBF, cuente las células y siembre las células sobre laminillas preparadas en placas de 24 pozos a una densidad de 5.000 células por pozo, e incube durante la noche para purificar las neuronas del ganglio de la raíz dorsal.

18 a 24 horas después de sembrar. Reemplace el medio con medio neurobasal que contenga 20 micromolares de cinco fluorouracilo dos desoxiuridina 72 horas después. Reemplace la mitad del medio con medio neurobasal sin FUDR.

Luego, el medio se reemplaza cada dos días. Aproximadamente 20 días después de sembrar las células gliales, alcanzarán confluencia y estarán listas para co-cultivarse con neuronas 24 horas antes de combinar ambos tipos celulares.

Sustituya el medio de las células gliales por medio MBF. Prepare una suspensión individual de DRG purificados como se demostró previamente. Determine la densidad celular.

Luego siembre los neuronas a 500 células por centímetro cuadrado sobre las células gliales. La viabilidad neuronal y el crecimiento de los neuritos sobre las células gliales pueden analizarse en diferentes puntos temporales utilizando software de análisis de imágenes e inmunoquímica con anticuerpos específicos para cada tipo celular. A continuación se muestran ejemplos de células gliales y neuronas del ganglio dorsal cultivadas por separado y en co-cultivo; las células gliales se vuelven confluentes después de 20 días.

En cultivo. Bajo un microscopio de contraste de fases, fue evidente que las diferentes subpoblaciones de células gliales forman patrones de crecimiento y morfologías distintos. Y mediante inmunocitoquímica, se observó que los astrocitos positivos para GFAP representaban más del 90 % del cultivo.

Utilizando nuestro método de tratamiento con FUDR durante 72 horas, la pureza de las neuronas del ganglio dorsal de la raíz alcanzará hasta un 99 % en seis días y exhibirán sus morfologías únicas con una alta densidad de crecimiento de neuritas en un cultivo conjunto de neuronas y células gliales. La adhesión neuronal y la elongación de neuritas se produjeron fácilmente sobre las células gliales dentro de las cuatro horas posteriores a la siembra; la adhesión neuronal y el crecimiento de neuritas fueron influenciados por subpoblaciones de células gliales, que forman subestructuras de patrones de crecimiento especiales que pueden identificarse fácilmente mediante microscopía de contraste de fase. Y mediante inmunocitoquímica, simplemente les mostraré cómo cultivar neuronas del ganglio dorsal de la raíz con células claras para estudiar la influencia de la heterogeneidad de las células gliales sobre el crecimiento neuronal.

Al realizar esta sesión, es muy importante recordar manipular el tejido con mucho cuidado y mantener las células en el medio. Nunca exponerlas al aire ni dejar que se sequen. Eso es todo.

Gracias por ver el video y mucha suerte con sus experimentos.