Name: Estudio de células gliales Influencia heterogeneidad de crecimiento de los axones se utiliza un método co-cultivo de Nueva (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Aprenda a estudiar la influencia de la heterogeneidad de células gliales en el crecimiento axonal mediante un sistema de co-cultivo in vitro con neuronas DRG de rata. Este método permite analizar la adhesión neuronal y el desarrollo de axones.

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Este estudio fue apoyado por FMMU nueva búsqueda de fundación y en parte la financiación del NIH.

1. Cultivo de células glía Las células gliales pueden ser cultivadas de diferentes regiones del sistema nervioso central. Todo el proceso se muestra en la figura del proceso. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111process.jpg" alt="Proceso 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Un proceso de"> Día 1 de recubrimiento placa de cultivo y cubreobjetos <ol><li> Seco ronda esterilizados cubreobjetos de vidrio para microscopio en un autoclave. </li><li> La placa cubreobjetos esterilizados en la placa esterilizada cultivo de 24 pocillos. </li><li> Cubra el cubreobjetos con poli-lisina y se incuba durante 2 horas a temperatura de la raíz. </li><li> Escudo de 6 y placas de cultivo de la misma manera que en el paso 3. </li><li> Lave el cubreobjetos y 6-así placa de cultivo de dos veces con agua destilada y secar al aire en el capó cultura. </li><li> Añadir 200 l medio DMEM (con 10% de SFB) en cada pocillo de 24 y placa y 2 mL en cada pocillo de 6 pocillos y ponerlos en la incubadora por debajo de 37 grados con 5% de CO 2 </li></ol> Día 2 corteza de aislamiento y cultivo de células gliales <ol><li> Esterilizar la campana de flujo positivo de disección. </li><li> Encienda la luz UV durante 20 minutos. </li><li> Rocíe todas las superficies con alcohol al 70% y esperar 15 minutos antes de su uso. </li><li> cambian de tiempo: las crías de rata Anestesie (P2-P6) por hipotermia, y decapitar a la base de la magna framen con unas tijeras de operación. </li><li> Abrir el cráneo a lo largo de la sutura sagital con una tijera iris y se desprenda del cráneo. </li><li> Quitar el cerebro anterior y ponerlos en frío L15, bajo microscopio estereoscópico, limpiar cuidadosamente la membrana dura y pia con los vasos sanguíneos, aislar la corteza y lavar varias veces con medio L15. </li><li> Cortar la corteza en trozos pequeños con tijeras de microcirugía. </li><li> Agregar 0,125% de tripsina-EDTA preparada con medio L15 en pedazos la corteza y se incuban en 37 grados durante 15 minutos. </li><li> Transferencia de bloques de tejido en 20 ml de medio DMEM con FBS al 20% en 50 ml de tubo, agregar la solución de DNasa acciones a 10ug/mL concentración final, se aspira la solución de los tejidos arriba y hacia abajo durante 20 horas con el fuego cristal pulido Pasteure pipeta, recoger la suspensión de células individuales. </li><li> Lave la suspensión de células una vez con medio DMEM, volver a suspender las células en DMEM con FBS al 10%, recuento de células bajo el microscopio de las células de las semillas con un hemocitómetro, en 5000-10000/cm 2. Mantener las células en un incubador de grado 37 5%, el cambio de la mitad de la media dos veces por semana. </li></ol> 2. Ganglios dorsales neuronas raíz Aislamiento, cultivo y purificación Día 1 Prepare Cultura Material <ol><li> Cubra el cubreobjetos esterilizados con poli-lisina cubreobjetos de lavado, dos veces con destilar el agua y el aire seco, ponerlos en placas de 24 pocillos. </li><li> Añadir medio Neurobasal 100μL con un 2% B27 y 2.5S NGF (50 ng / ml), se puso la placa en 37 grados de CO 2 al 5%. </li></ol> Día 2 Aislar GRD a partir de embriones <ol><li> Esterilizar la campana de flujo en la misma forma que el cultivo de células gliales. </li><li> La eutanasia a una rata preñada (E15) por sobredosis de CO 2, el abdomen esterilizados en un 70% de etanol, los embriones fueron aisladas de útero y la puesta en frío L15. </li><li> Aislar a la médula espinal con los ganglios de la raíz dorsal conectada en microscopio estereoscópico y la transferencia a los platos refrigerados de 35 mm con medio L15. </li><li> Recoger única suspensión de células y lavar una vez con NBF medio (medio Neurobasal contiene 2% de B27 y 2.5S NGF (50 ng / ml)). </li></ol> Día 3 Purificar neuronas DRG <ol><li> 18h-24h después de la siembra de neuronas, añadir un 1 mM de solución concentrada de acciones FUDR a la cultura de las neuronas a una concentración final de 20 my un volumen final de 200 mL. </li><li> 72 horas más tarde, reemplace la mitad de la media con medio Neurobasal contiene 2% de B27 y 2.5S NGF (50ng/mL) sin FUDR. Después de eso, el cambio del medio día por medio. </li></ol> 3. Cocultivo neuronas DRG con las células gliales <ol><li> Cuando el cultivo de células gliales llegó a la confluencia (alrededor de 20 días después de la siembra), que estaban listos para co-cultivo con las neuronas. </li><li> 24 horas antes de la adición de las neuronas purificadas, las células gliales medio se cambió a medio Neurobasal contiene 2% de B27 y 2.5S NGF (50 ng / mL). </li><li> Neuronas purificada fueron recolectadas en pozos cultura, la suspensión células individuales se obtiene al pasar a través de una pipeta mecánica Pasteure pulidas al fuego. </li><li> Después de contar el número, las neuronas se sembraron a 500/cm 2 en las células gliales confluentes en un medio de Neurobasal contiene 2% de B27 y 2.5S NGF (50ng/mL). </li><li> Adhesión de las neuronas y el crecimiento de las neuritas en las células gliales pueden ser registrados y analizados en diferentes momentos por el software de análisis de imagen y inmunocitoquímica, utilizando anticuerpos tipo de células específicas. </li></ol> 4. Resultados representante <ol><li> Cultivo de células gliales: Después de la siembra, las células gliales que confluyen alrededor de 20 días. Bajo microsc de contraste de faseopa, que se puede identificar fácilmente que las diferentes subpoblaciones de células gliales forman morfológicas diferentes subestructuras patrón de crecimiento y los astrocitos GFAP positivos representaron más del 90%, como se muestra mediante la técnica de immuocytochemisty (Figura 1, Figura 2). </li><li> DRG neuronas cultura: En este método, después de 72 horas de tratamiento FUDR, la pureza de las neuronas DRG llegará tan alto como 99% en los 6 días, las neuronas DRG mostró sus morfologías únicas y con un alto crecimiento de neuritas densidad (Figura 3, Figura 4). </li><li> Co-cultivo de células gliales y las neuronas: las neuronas DRG adherencia y crecimiento de las neuritas se produjo con facilidad en las células gliales en las 4 horas después de la siembra, la observación cuidadosa mostró que la adhesión neuronal y el crecimiento de las neuritas se vieron influidos por las subpoblaciones de células gliales, que forman especiales subestructuras patrón de crecimiento, esto podría ser fácilmente identificados bajo el microscopio de contraste de fase y por inmunocitoquímica (Figura 5, Figura 6). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Morfología de las células gliales confluentes. Cortical células gliales se chapada en cubreobjetos recubiertos polilisina y se cultivaron durante 20 días, tenga en cuenta el patrón de crecimiento diferente de las células gliales, las células en la parte izquierda dispuestos en forma radiada. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Confluente células gliales marcado por proteína ácida glial fibrilar (GFAP) de anticuerpos. Tenga en cuenta la disposición emitida por GFAP (rojo) células positivas en el lado derecho. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Neuronas dorsales ganglios de la raíz crecieron in vitro sin necesidad de tratamiento FUDR. La contaminación de las células formadas DRG fondo de las neuronas. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Neuronas dorsales ganglios de la raíz crecieron in vitro después del tratamiento FUDR. Las células de fondo contaminantes se había eliminado por completo. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Neuronas dorsales ganglios de la raíz cultivada en células gliales. Adherencia y crecimiento de las neuritas neuronas se inhibieron en las células radiadas organizado y limitado en las células gliales lado derecho. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Neuronas dorsales ganglios de la raíz que crece en las células gliales marcado por anticuerpos neurofilamentos. El neuritas (verde) se inhibió en la radiación dispuestos células gliales lado izquierdo y limitada en el lado derecho, todas las células gliales se marcaron con anticuerpos GFAP (rojo).

<ol><li>Rossignol, S., Schwab, M., Schwartz, M., Fehlings, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury%3A+time+to+move%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury: time to move?</a> J Neurosci. 27 (44), 11782-11792 (2007).</li>
<li>Yiu, G., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+inhibition+of+CNS+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial inhibition of CNS axon regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+and+magic+of+glia%3A+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li>
<li>Matyash, V., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+astrocyte+morphology+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in astrocyte morphology and physiology.</a> Brain Res Rev. , (2009).</li>
<li>Wanner, I. B., Deik, A., Torres, M., Rosendahl, A., Neary, J. T., Lemmon, V. P., Bixby, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vitro+model+of+the+glial+scar+inhibits+axon+growth.+Glia%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A new in vitro model of the glial scar inhibits axon growth. Glia.</a> 56 (15), 1691-1709 (2008).</li>
<li>Kuffler, D. P., Sosa, I. J., Reyes, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+chondroitin+sulfate+proteoglycan+inhibits+dorsal+root+ganglion+neuron+neurite+outgrowth+and+substrate+specificity+via+a+soma+and+not+a+growth+cone+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Schwann cell chondroitin sulfate proteoglycan inhibits dorsal root ganglion neuron neurite outgrowth and substrate specificity via a soma and not a growth cone mechanism.</a> J Neurosci Res. 87 (13), 2863-2871 (2009).</li>
<li>Kleitman, N., Wood, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+culture+method+for+the+study+of+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Culturing+nerve+cells%22%5BJournal%5D)">Tissue culture method for the study of myelination.</a> Culturing nerve cells. , P559-P559 (1998).</li>
</ol>

Este protocolo experimento fue diseñado para alcanzar dos metas para estudiar las células gliales, la influencia de la heterogeneidad, especialmente los astrocitos en la adhesión neuronal y el crecimiento de las neuritas. El primer objetivo era mantener la heterogeneidad de los astrocitos en lo posible, en este experimento, la confluencia de las células gliales cultura astrocitos enriquecido se mezcla la cultura primaria sin ningún tipo de tratamiento químico y la propagación de la digestión, lo cual puede dañar las cél...

<table><tbody><tr><td>DMEM (glucosa alta)</td><td>Invitrogen</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>Medio L15</td><td>Invitrogen</td><td>11415-114</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino fetal (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10437-077</td><td></td></tr><tr><td>Medio Neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>poli-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td>grado para cultivo</td></tr><tr><td>NGF (2.5S)</td><td>Invitrogen</td><td>13257-019</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>tripsina-EDTA al 0.25 %</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo contra neurofilamento</td><td>Abcam</td><td>ab24575</td><td></td></tr></tbody></table>

estudio de células gliales influencia heterogeneidad de crecimiento de los axones se utiliza un método co-cultivo de nueva

Study Glial Cell Heterogeneity Influence on Axon Growth Using a New Coculture Method

En el sistema nervioso central de los mamíferos, axones dañados después de una lesión no son capaces de regenerar a sus objetivos originales y la recuperación funcional es muy pobre 1. El fracaso de la regeneración axonal es el resultado combinado de varios factores, incluyendo el ambiente hostil de células gliales, las moléculas inhibidoras de mielina y disminución de la relación intrínseca capacidad de regeneración de las neuronas 2. Los astrocitos son el tipo de células gliales más predominante en el sistema nervioso central y desempeñan un papel importante en las funciones del axón en la fisiología y la patología de condiciones 3. A diferencia de los oligodendrocitos homólogos, los astrocitos son una población celular heterogénea compuesta por diferentes sub-poblaciones de astrocitos con diversas morfologías y la expresión génica 4. La importancia funcional de esta heterogeneidad, como su influencia en el crecimiento axonal, es prácticamente desconocida. Para el estudio de las células gliales, especialmente la función de la heterogeneidad de los astrocitos en el comportamiento de las neuronas, que estableció un nuevo método de cultivo de alta co-purificado neuronas raíz dorsal ganglios con células gliales obtenido de la corteza cerebral de rata. Mediante esta técnica, hemos sido capaces de comparar directamente la adhesión neuronal y el crecimiento de los axones en las subpoblaciones astrocitos diferentes en las mismas condiciones. En este informe, le damos el protocolo detallado de este método para el aislamiento de los astrocitos y la cultura, los ganglios de la raíz dorsal neuronas aislamiento y purificación, y el co-cultivo de neuronas DRG con los astrocitos. Este método también podría extenderse a otras regiones del cerebro para estudiar la interacción celular específica o regionales entre las neuronas y células gliales.

En este protocolo, que describe un nuevo método para estudiar la influencia de la heterogeneidad de las células gliales en el crecimiento del axón con una<em&gt; In vitro</em&gt; Co-cultura del sistema. Rata células gliales corticales se cultivaron hasta la confluencia con cocultured y altamente purificado rata dorsal neuronas de los ganglios de la raíz. Influencia de diferentes células de la glía en la adhesión de las neuronas y crecimiento de los axones se comparó directamente en la misma cultura. Este método proporciona una nueva forma de estudiar directamente la influencia de células gliales heterogeneidad en la adhesión neuronal y el crecimiento del axón.

Estudio de células gliales Influencia heterogeneidad de crecimiento de los axones se utiliza un método co-cultivo de Nueva

En el sistema nervioso central de todos los mamíferos, los axones seccionados tras una lesión son incapaces de regenerarse hacia sus objetivos originales y la recuperación funcional es...

El objetivo general de este procedimiento es estudiar la influencia de la heterogeneidad glial sobre el crecimiento de los axones del ganglio dorsal de la raíz (DRG) y la despolarización celular. Esto se logra primero convirtiendo las células gliales del cortex de rata neonatal. El segundo paso del procedimiento consiste en cultivar y purificar las neuronas del ganglio dorsal de la raíz (DRG) de embrión de rata.El tercer paso del procedimiento consiste en agregar las neuronas de los ganglios dorsales purificadas sobre las células gliales. El paso final del procedimiento es observar el crecimiento de los exones en el axón celular y realizar tinción celular y análisis de cuantificación. Finalmente, se pueden obtener los resultados.Ese estudio muestra que el crecimiento de las neuronas del ganglio dorsal está influenciado por células gliales heterogéneas mediante grabaciones de lapso de tiempo y microscopía de inmunofluorescencia. Hola, soy del laboratorio de neuroimagen del Departamento de Neurología de la UCRA. Hoy les mostraremos un procedimiento para estudiar la influencia heterógena de las células gliales sobre el crecimiento mediante un nuevo método de cultivo celular.En nuestro

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Investigación

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Neurociencia

Hemos desarrollado una novela de varios compartimientos de neuronas co-cultivo plataforma de microsistemas para la investigación in vitro de interacción axón-glia del SNC. La plataforma es capaz de conducir hasta seis experimentos independientes en paralelo y se fabrica utilizando un nuevo desarrollo de macro / micro método de fabricación de híbridos.

Un compartimiento de Multi-CNS neuronas-glia Co-cultivo de microfluidos Plataforma

Este estudio describe los procedimientos de instalación de un axón neuronal y la novela (astro) glia plataforma de co-cultivo. En este sistema de co-cultivo, la manipulación de la interacción directa entre un solo axón (y células gliales único) se hace factible, permitiendo un análisis mecanicista de la neurona mutuo de señalización gliales.

Análisis de imágenes de Neuron a la interacción glía en la Plataforma Cultura Microfluidic (MCP)-basada en Axón Neuronal y Sistema Glia Co-cultura

Este video ilustra un método para establecer un cocultivo indirecto neurona-astrocito utilizando un enfoque compartimentado. En esta configuración, las neuronas y los astrocitos están separados espacialmente, pero comparten un medio condicionado. Los factores neurotróficos liberados por los astrocitos promueven la diferenciación neuronal y la formación de conexiones sinápticas, lo que sugiere interacciones neurona-glía.

Una técnica de cocultivo indirecto neurona-astrocito para estudiar las interacciones neurona-glía

Este video muestra el modelo de coculturación de un explante de ganglio de raíz dorsal y células de Schwann. En condiciones de cocultivo, el ácido ascórbico promueve la diferenciación de las células de Schwann en formas mielinizantes. Las células de Schwann mielinizantes envuelven los axones varias veces para crear una vaina de mielina, que es esencial para la función nerviosa.

Co-cultivo de un explante de ganglios de raíz dorsal con células de Schwann para la mielinización de neuronas

Ganglios de la raíz dorsal (DRG) son estructuras que contienen las neuronas sensoriales del sistema nervioso periférico. Cuando disociado, pueden ser co-cultivadas con células madre-SC como derivadas de tejido adiposo (ASC), que proporciona un valioso modelo para estudiar la regeneración in vitro en los nervios y la mielinización, imitando el entorno en vivo en el sitio de la lesión.

Ganglios de raíz dorsal neuronas y las células madre derivadas de la adiposa diferenciada: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultivo modelo para estudiar la regeneración de los nervios periféricos

Este protocolo describe el co-cultivo de neuronas-astrocito indirecta para el análisis de las interacciones neurona compartimentada-glia.

La indirecta neurona-astrocito Coculture Ensayo: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Puesta en marcha de la investigación detallada de las interacciones neurona-glía

En este protocolo, nuestro objetivo es describir un método reproducible para combinar disociado humanas pluripotentes células madre derivadas neuronas y astrocitos juntos en 3D esfera cocultures, mantener estas esferas en condiciones flotantes libres y posteriormente medición de la actividad de circuito sináptico de las esferas con inmunoanálisis y matriz micropozo-microcanal grabaciones.

Microcircuito sináptica modelado con 3D Cocultures de astrocitos y neuronas de células madre pluripotentes humanas

Aquí presentamos un sistema de cultivo monocapa mixto ex-vivo para el estudio de la migración de células de glioma humano (hGC) en tiempo real. Este modelo proporciona la capacidad de observar interacciones entre hGCs y axones mielinados y no mielinizados dentro de una cámara compartimentada.

Monitoreo en tiempo real de la migración de células de glioma humano en cocultivos de axón-oligodendrocitos de ganglios de raíz dorsal

Aquí, presentamos un enfoque simple utilizando medios de cultivo específicos que permiten el establecimiento de culturas enriquecidas con neuronas y astrocitos, o cultivos de neurona-glia de la corteza embrionaria, con alto rendimiento y reproducibilidad.

Un modelo de cultivo celular para estudiar el papel de las interacciones de neuronas y glia en isquemia

Presentamos un modelo in vitro para evaluar la capacidad neurorregenerativa olfativa ensheathing glia (OEG), después de una lesión neuronal. Se basa en un cocultivo de neuronas ganglionas de retina adultas axotomizadas (RGN) en monocapas OEG y posterior estudio de regeneración axonal, mediante el análisis de marcadores axoales y somatodendriáticos RGN.

Cocultura de neuronas ganglionas retinal de rata axotomizada con glia olfativa, como modelo in vitro de regeneración axonal adulta

Aquí, presentamos un ensayo de co-cultivo fácil de usar para analizar la migración de glioblastoma (GBM) en neuronas modeladas. Desarrollamos una macro en el software FiJi para una fácil cuantificación de la migración de células GBM en las neuronas, y observamos que las neuronas modifican la capacidad invasiva de las células GBM.

Co-cultivo De Glioblastoma Células Madre-como En Las Neuronas Modeladas Para Estudiar La Migración Y Las Interacciones Celulares

Aprenda a estudiar la influencia de la heterogeneidad de células gliales en el crecimiento axonal mediante un sistema de co-cultivo in vitro con neuronas DRG de rata. Este método permite analizar la adhesión neuronal y el desarrollo de axones.

Estudio de células gliales Influencia heterogeneidad de crecimiento de los axones se utiliza un método co-cultivo de Nueva

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