Resonancia de spin electrónico micro imágenes en vivo de las especies para la asignación de oxígeno

El objetivo general del siguiente experimento consiste en obtener imágenes tridimensionales a escala micrométrica de la concentración de oxígeno en el entorno inmediato de células vivas mediante microscopía de resonancia paramagnética electrónica o ESR. El protocolo se demostrará en cianobacterias, que son células fotosintéticas comunes. Esto se logra primero preparando una muestra de células de cianobacterias dentro del portaobjetos para microscopía ESR.

Inmerso en una solución estable de radicales orgánicos. El portamuestras se coloca dentro de la sonda de imagen, que a su vez se introduce en el electroimán estático del sistema de microscopía de RES. Ahora, se adquieren varias imágenes microscópicas tridimensionales de resonancia de espín electrónico de la solución de radicales orgánicos mediante el microscopio de RES.

Esto se lleva a cabo con varias variantes de secuencias de pulsos y a menudo bajo diversas condiciones externas, como en condiciones de luz y oscuridad. A continuación, el ordenador procesa las imágenes de datos brutos para extraer los tiempos de relajación tridimensionales con resolución espacial del radical. Estos tiempos de relajación proporcionan una medida directa de la concentración de oxígeno mediante una calibración previa, lo que permite obtener mapas tridimensionales completos de oxígeno de las muestras analizadas bajo diversas condiciones externas.

Se obtienen resultados que muestran claramente la falta de producción de oxígeno por las cianobacterias cuando no se aplica luz. Además, se demuestra que bajo irradiación luminosa, se generan un gradiente de oxígeno significativo y heterogeneidad de oxígeno cerca de las células de cianobacterias. Hola, soy Al del laboratorio de BLA en la Facultad S de Química del Technion, el Instituto Tecnológico de Israel en Haifa.

Hoy les mostraremos un procedimiento para mapear las concentraciones de oxígeno cerca de células vivas de manera tridimensional con alta resolución espacial mediante microscopía de punta de brazo férrea. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la tasa de consumo de oxígeno y la actividad metabólica de las células. Así que comencemos.

La resonancia de espín electrónico o ESR es una técnica espectroscópica en la que la radiación electromagnética a una frecuencia específica es absorbida por especies paramagnéticas que poseen espín de electrón desapareado y que se encuentran bajo un campo magnético estático externo. Es un método potente para estudiar el entorno de moléculas paramagnéticas en especies vivas, incluyendo las concentraciones de oxígeno y especies reactivas de oxígeno. Aquí se muestra una imagen típica de la concentración de oxígeno en un ratón con tumor, para muestras heterogéneas.

La información espectral de RES se puede obtener de manera espacialmente resuelta mediante el uso de gradientes de campo magnético. Se inyectó un radical orgánico estable y libre en el ratón, y sus características de RES proporcionan la concentración de oxígeno en su entorno. Los resultados basados en RES se superponen a una imagen anatómica de MRI.

Hasta ahora, tales técnicas de imagen por RSE de especímenes vivos solo se habían llevado a cabo con muestras relativamente grandes a escala de milímetros. La microscopía de RSE de resolución implica la medición de muestras de tamaño milimétrico y submilimétrico, proporcionando imágenes tridimensionales de RSE con una resolución cercana a un micrón.

A continuación se presentan dos ejemplos de imágenes de ESR de alta resolución a escala micrométrica, de una muestra generada con polvo de NNC 60 y cristales paramagnéticos de ferrocianuro de litio. Un microscopio de ESR es similar a un espectrómetro convencional de ESR, ya que posee un imán para generar el campo estático, un sistema de microondas para la excitación de espines y la detección de señales, una sonda para sostener la muestra y una consola informática para controlar el proceso de adquisición y el manejo de datos. Otros componentes del sistema incluyen controladores electrónicos de gradiente de campo magnético y bobinas de gradiente ubicadas en la sonda de imagen.

Las bobinas de gradiente también tienen una abertura que permite la irradiación de luz sobre la muestra. Se aplica a la muestra un aire húmedo controlado en temperatura para garantizar una deshidratación mínima durante el experimento. Las principales características únicas de la microscopía de RES son el pequeño tamaño de la sonda y de las bobinas de gradiente, la mayor sensibilidad de espín del sistema y la alta intensidad de los generadores de gradiente de campo magnético. Antes de comenzar este procedimiento, prepare una suspensión de cianobacterias a una concentración de 40 miligramos por mililitro.

Para comenzar la preparación de la muestra para microimagen de RES, tome unos cuantos cuadrados de papel absorbente de aproximadamente 400 por 400 micrones utilizando pinzas finas. Luego, insértelos en un tubo einor. Posteriormente, llene el tubo con 1.2 mililitros de la suspensión de cianobacterias.

Luego, centrifugue la suspensión durante dos minutos a 6.000 RPM en una microcentrífuga; tras la centrifugación, retire completamente el sobrenadante excepto aproximadamente 50 microlitros, que se dejan para evitar la deshidratación de las cianobacterias. Este proceso provoca la saturación del papel absorbente con las células de cianobacterias. A continuación, prepare un portaobjetos especial de vidrio en forma de copa, extraiga algunas fibras del papel usando pinzas finas y colóquelas en el fondo del portaobjetos.

A continuación, agregue tres milimolares de tridel y solución BG 11, que se prepara según lo descrito en el protocolo escrito mediante un octavo de jeringa. Luego, selle el portamuestras con adhesivo curable por UV aplicando el adhesivo entre los bordes del portamuestras de vidrio y su cubreobjetos correspondiente, dejando abierta una pequeña salida de aire. Finalmente, cure el adhesivo con luz UV durante dos segundos.

Para comenzar el experimento de imagen, encienda el sistema de microimagen ESR e inserte la muestra en el resonador que va dentro de la sonda de imagen. Ahora, utilizando el software de control del ordenador, configure el sistema en modo de sintonización y encuentre la frecuencia de microondas de resonancia de la sonda, que se utilizará para las mediciones de ESR. A continuación, ajuste el campo magnético estático al valor que coincida con la frecuencia de microondas aplicada.

Establezca los parámetros de temporización para la secuencia de pulsos y observe la señal de RES para asegurarse de que el sistema funcione correctamente y de que la muestra esté bien preparada. Luego, configure los parámetros de imagen, como el número de píxeles, la intensidad de los gradientes y la duración de los pulsos de gradiente, a sus valores requeridos. Tras la configuración, adquiera tres imágenes tridimensionales de RES mediante una secuencia de pulsos de imagen con eco Han, con valores de separación interpulsos tau de 500, 600 y 700 nanosegundos.

En este momento, encienda la proyección de luz sobre la muestra si es necesario para las condiciones experimentales durante toda la adquisición; los datos se guardan automáticamente. Tras el proceso de adquisición de datos, los archivos de datos en bruto mediante un script de software MATLAB. Utilizando el software, genere imágenes de la concentración del radical trill y del tiempo de relajación.

T dos se utiliza para mapear y luego traducir estas imágenes a una imagen de concentración de oxígeno mediante una curva de calibración preexistente que vincula la concentración de oxígeno con el tiempo de relajación. Aquí, T dos cero es el tiempo de relajación espín-espín del indicador bajo condiciones anóxicas, que depende de la concentración C del indicador y de su coeficiente de difusión D. Se muestran imágenes típicas de datos brutos procedentes de varios experimentos tridimensionales de imágenes por resonancia paramagnética electrónica realizados en cianobacterias. Estas imágenes se adquirieron con diferentes valores de tau, bien en condiciones de oscuridad o de luz.

Bajo condiciones de oscuridad, los resultados son muy similares, excepto por una intensidad reducida para los valores más grandes de T debido al tiempo de relajación espín-espín T dos. Por el contrario, bajo irradiación luminosa, el patrón de la imagen cambia debido a los diferentes tiempos de relajación a lo largo de la muestra. Luego, estos datos se procesan para obtener una imagen de amplitud a partir de esta imagen.

Es evidente que la cianobacteria se encuentra principalmente en el lado derecho del portaobjetos. Las dos imágenes se traducen en valores de concentración de oxígeno mediante una curva de calibración preexistente que relaciona la concentración de oxígeno con el tiempo de relajación. Los resultados se muestran para cianobacterias en presencia y ausencia de luz.

Es evidente que la producción de oxígeno se inicia con la luz y provoca un aumento significativo en la concentración de oxígeno en la solución. Esto conduce a una disminución del radical T dos, principalmente en los vóxeles cercanos a las fibras de papel absorbente con las cianobacterias. Acabamos de mostrarle cómo preparar una muestra que contiene células vivas con radical libre estable para la obtención de mapas de concentración de oxígeno mediante microscopía de R E E S. Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantenerlo lo más breve posible para asegurar la reproductibilidad y evitar la degradación de la muestra.

Así que eso es todo. Gracias por vernos y buena suerte con su experimento.