Name: Resonancia de spin electrónico micro imágenes en vivo de las especies para la asignación de oxígeno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprende a mapear concentraciones de oxígeno en células vivas mediante microscopía de resonancia de spin electrónico con resolución micrométrica. Este método utiliza cianobacterias fotosintéticas para visualizar gradientes de oxígeno en tres dimensiones bajo diferentes condiciones de iluminación.

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Este trabajo fue parcialmente apoyado por la beca no. 213/09 de la ciencia israelí Fundación, no se conceda ninguna. 2005258 de la fundación BSF, no se conceda ninguna. 201665 del Consejo Europeo de Investigación (CEI), y por el Instituto de Nanotecnología Russell Berrie en el Technion. Reconocemos la ayuda del profesor Noam Adir y Salame Faris de la Facultad de Química Schulich en el Technion en relación con el suministro y manejo de las cianobacterias. La ayuda y el apoyo de Svetlana Yoffis del Technion Micro-Nano Unidad de fabricación es muy apreciada.

1. Resumen de ESR Micro-imágenes En primer lugar, ofrecemos una breve explicación de ESR, microscopía de ESR, y los diversos componentes de nuestro sistema, a continuación, se describirán los experimentos de imagen real. Resonancia de spin electrónico es una técnica espectroscópica en la que se absorbe la radiación electromagnética a una frecuencia específica de moléculas con espines de los electrones no apareados, bajo un campo magnético estático externo (Figura 1). ESR se emplea en grandes áreas de la ciencia, como la química, la biología, la física y la ciencia de materiales, para la detección e identificación de los radicales libres y centros paramagnéticos. Es un poderoso método para estudiar el medio ambiente de las moléculas paramagnéticas en especies vivas y proporciona información sobre la acidez (pH), la viscosidad, el oxígeno y las concentraciones de especies reactivas de oxígeno 3. Para muestras heterogéneas, la información espectral ESR se puede obtener de una manera resuelta espacialmente (es decir, mediante la obtención de una imagen), a través del uso de gradientes de campo magnético 4. Esto es muy similar al método más común de la resonancia magnética (MRI), que observa principalmente spins de protón. Hasta ahora, las técnicas de imagen como ESR se aplicaron para especímenes vivos de tamaño relativamente grande de unos pocos centímetros y milímetros escala de resolución. (Por ejemplo, véase la figura 2, tomada de referencia 5.) Un desarrollo relativamente reciente de la VSG imagen es la ampliación de su capacidad de mirar a los animales pequeños en escala milimétrica resolución de las mediciones de las muestras milimétricas y submilimétricas tamaño con escala micrométrica resolución. Este campo se conoce como microscopio de ESR, que hoy puede ofrecer imágenes 3D ESR con una resolución de acercarse a 1 micra 2 (ver ejemplos representativos en la Figura 3). Un microscopio de ESR es esencialmente similar a un espectrómetro de ESR convencionales. Tiene un imán para generar el campo estático, un sistema de microondas para la excitación de giro y la detección de señales, una sonda para la celebración de la muestra, y una consola computarizada para controlar el proceso de adquisición y manejo de datos. Otros componentes únicos de la imagen de ESR en general y también existente en microscopia ESR son magnéticos fuentes de gradiente de campo, que forman parte del sistema electrónico, y bobinas de gradiente que se encuentran en la sonda de imagen. Más detalles sobre nuestro sistema específico se muestran en la película y el protocolo descrito en la referencia 2. 2. ESR Micro-Preparación de la muestra de imágenes Esta etapa se describe el método para la preparación de muestras para la velocidad de sedimentación globular de micro-imágenes experimento. Al final de esta etapa las células se colocan en el fondo de un recipiente de vidrio especialmente preparadas ESR muestra de microscopio con una solución radical tritilo tampón 6. Este protocolo describe la medición de las células de cianobacterias y, por tanto, para otros tipos de células, los ajustes adecuados puede ser necesaria en la etapa de preparación de la muestra. <ol><li> En primer lugar, algunos cuadrados de papel absorbente con un tamaño de ~ 400 400 micras se toman y se inserta en un tubo Eppendorf que posteriormente se llena con 1,2 ml de la suspensión de las cianobacterias (en una concentración de 40 mg / ml). </li><li> La suspensión se centrifuga durante 2 minutos a 6000 rpm en una microcentrífuga. </li><li> A continuación, el búfer de sobrenadante se elimina por completo a excepción de ~ 50 l que se dejan para evitar la deshidratación cianobacterias. Como resultado de este proceso, el papel absorbente está saturado por las células de cianobacterias. </li><li> Con unas pinzas finas, algunas fibras se extraen de la de papel y se coloca en el fondo de una taza-como titular de la muestra preparada especialmente de vidrio 7. Después de que un 3 mm de tritilo de BG-11 una solución 8, 9 (ver Esquema 1) se añade el soporte de muestras con la ayuda de una jeringa bien. El titular se sella con pegamento curable UV, dejando una pequeña salida de aire abierto. <table border="1"><tbody><tr><td> Archivo 4 </td><td> Stock 3 </td><td> Stock 2 </td><td> Stock 1 </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 2.86g/liter </td><td> K 2 HPO 4: 3H 2 O 4.0g/liter </td><td> MgSO 4: 7H 2 O 7.5g/liter </td><td> Na 2 Mg EDTA 0.1g/liter </td></tr><tr><td> MnCl2: 4H 2 O 1.81g/liter </td><td></td><td></td><td> Citrato férrico amónico 0.6g/liter </td></tr><tr><td> ZnSO4: 7H 2 O 0.222g/liter </td><td></td><td></td><td> El ácido cítrico: 1H2O 0.6g/liter </td></tr><tr><td> CuSO 4: 5H 2 O 0.079g/liter </td><td></td><td></td><td> CaCl2: 2H 2 O 3.6g/liter </td></tr><tr><td> COCl 2 : 6H 2 O 0.050g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaMoO 4: 2H 2 O 0.391g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Esquema 1. Preparación de BG-11 medianas. </li></ol> 3. ESR Micro-imágenes de los experimentos <ol><li> Para comenzar con el experimento de imágenes, a su vez en la velocidad de sedimentación globular de micro-sistema de imágenes e insertar la muestra en el resonador que va dentro de la sonda de imagen. </li><li> Ahora, usando el software de control por ordenador, configure el sistema en "Tune" y el modo de encontrar la frecuencia de resonancia de microondas de la sonda, que será utilizado para las mediciones de ESR. </li><li> A continuación, establezca el campo magnético estático en el valor que coincide con la frecuencia de microondas aplicada, establecer los parámetros de tiempo de la secuencia de pulsos y observar la señal de ESR para asegurarse de que el sistema funciona bien y la muestra está bien preparado. </li><li> A continuación, establezca los parámetros de imagen, tales como el número de píxeles, la fuerza de los gradientes, y la duración de los pulsos de gradiente a sus valores requeridos. </li><li> Después de la instalación, conseguir tres imágenes 3D ESR por una secuencia de eco de Hahn imagen de pulso (Figura 4) con una separación entre impulsos, los valores de  500, 600 y 700 ns. </li><li> La luz proyectada en la muestra se activa o desactiva en función de las condiciones experimentales necesarias. </li><li> Durante la adquisición, los datos se guardan automáticamente. Archivos de datos en bruto tesis se procesan a través de scripts de software Matlab para proporcionar imágenes de la concentración de tritilo radical y el tiempo de relajación T 2 del mapa, que se traduce en una imagen de la concentración de oxígeno a través de pre-existentes de calibración. </li></ol> 4. Resultados representante Los resultados del experimento son varias tridimensional ESR micro-imágenes grabadas en diferentes valores de τ. Típicas imágenes de los datos en bruto se proporcionan en la figura 5. Los tres mejores imágenes, medido bajo condiciones de oscuridad, son muy similares, excepto por la reducción en la intensidad de la señal. Por otro lado, el patrón cambia la imagen a la radiación de la luz debido a los tiempos de relajación en diferentes partes de la muestra. Estos datos se pueden procesar de 1 a obtener una imagen de amplitud, como se muestra en la Figura 6 y también las imágenes del tiempo de relajación, T 2 (Figura 7). La T 2 imágenes se traducen en valores de concentración de oxígeno a través de una curva de calibración pre-existente que une a la concentración de oxígeno en el tiempo de relajación a través de la ecuación: <img src="/files/ftp_upload/2122/2122eq.jpg" alt="Ecuación 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Ecuación 1"> Aquí, T 2 0 es el tiempo de relajación spin-spin de la sonda en condiciones de anoxia (dependiendo de la concentración de la sonda, C, y su coeficiente de difusión, D), y k es una constante de proporcionalidad. En la mayoría de los casos, el coeficiente de difusión no varía mucho de las muestras en vivo (aunque, si es necesario, puede, en principio, ser directamente evaluadas también por ESR 6, 10), y la concentración de giro se obtiene durante el proceso de imágenes. Por lo tanto, esta relación se puede utilizar para medir directamente la concentración de oxígeno. Volviendo a la Figura 6, es evidente de la imagen de la amplitud que las células de cianobacterias se localizaron principalmente en el lado derecho del titular de la muestra. Por otra parte, sobre la base de la figura 7, está claro que la luz se inicia la producción de O 2 y causa un aumento significativo en la solución de O 2 de la concentración, sobre todo en los voxels cerca de las cianobacterias. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Los niveles de energía de resonancia de spin electrónico. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: imagen típica de la concentración de oxígeno de un ratón con tumores. La imagen de la izquierda muestra la información anatómica, basada en una imagen de resonancia magnética. Un radical libre estable orgánica se inyectó a los ratones y sus características ESR proporcionan la concentración de oxígeno en su entorno (derecha). ESR-basada en los resultados se superponen a la imagen anatómica MRI. Campo de visión es de 32 mm. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: Dos ejemplos de alta resolución de micro-escala ESR imágenes de la muestra photolithographically generado con N @ C 60 en polvo (izquierda) y los cristales CFIG paramagnético (derecha) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4: Típica Hahn imágenes que muestran la secuencia de pulsos de microondas (MW) y el gradiente, G x, y G y G z pulsos. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5: Típica de datos sin ESR micro-imágenes: a, b, c son los datos en bruto de la muestra cianobacteria sin iluminación de la luz medida para τ = 500600700 ns, respectivamente. Los literales d, e, y son las mismas que a, b, c, pero con una iluminación de luz. La intensidad se representan en la escala arbitraria (pero es consistente dentro de cada conjunto de tres imágenes en bruto oscuras o claras de datos) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6: la imagen de amplitud correspondiente a la concentración de radicales en la solución (escala arbitraria). <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig7.jpg" alt="Figura 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 7"> Figura 7: T 2 imágenes y el correspondiente [O 2] Los valores en negro (izquierda) y luz (derecha) las condiciones.

<ol><li>Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-imaging+of+Oxygen+Concentration+near+Live+Photosynthetic+Cells+by+Electron+Spin+Resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance.</a> Biophysical Journal. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESR+imaging+in+solid+phase+down+to+sub-micron+resolution%3A+methodology+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications.</a> J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).</li>
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</ol>

Este protocolo muestra cómo ESR micro-imagen se pueden aplicar a la concentración de oxígeno del mapa cerca de vivir pequeñas muestras. Una resolución espacial de aproximadamente 30 x 30 x 100 m se demuestra, con casi micromolar sensibilidad concentración de oxígeno y sub-femtomol sensibilidad absoluta de oxígeno por voxel. El uso de ESR micro-imágenes para el mapeo de oxígeno cerca de las células complementa las técnicas disponibles actualmente sobre la base de micro-electrodos o de fluorescencia / fosforescencia. Además, con la sonda paramagnética adecuada, será de fácil aplicación para intracelular de oxígeno micro-imagen, una capacidad que otros métodos resulta muy difícil de lograr. En un futuro próximo tenemos la intención de mejorar aún más esta metodología para ofrecer imágenes en directo de la muestra con una resolución de unos pocos micrones, proporciona parámetros de contraste, tales como la concentración de superóxido, la acidez (pH), el coeficiente de difusión de la sonda y, por supuesto, la concentración de oxígeno. Estas funciones son complementarias a las actuales metodologías basadas en la óptica, tanto en términos de tipo de cambio y también de las características de las muestras (por ejemplo, la falta de transparencia muestras de espesor y, en algunos casos, las mediciones intracelulares vs extracelular).

<table><tbody><tr><td>Centrífuga </td><td>Kendro</td><td>Heraus, 75003235</td><td></td></tr><tr><td>Radical triarilmetilo (trifenilmetilo) perdeuterado</td><td>Novosibirsk</td><td></td><td>Sintetizado en Novosibirsk utilizando el método descrito en la referencia &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Buffer BG-11</td><td></td><td></td><td>Para la preparación de instrucciones, véase el Esquema 1 y las referencias 8, 9.</td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>Hamilton Co</td><td>Microliter 7000.5</td><td></td></tr><tr><td>Curado por luz ultravioleta</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA63 o NOA61.</td><td></td></tr></tbody></table>

resonancia de spin electrónico micro imágenes en vivo de las especies para la asignación de oxígeno

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

Este protocolo describe una resonancia de spin electrónico (ESR) micro-método para imágenes tridimensionales de mapeo de los niveles de oxígeno en el entorno inmediato de las células vivas con una resolución de escala micrométrica 1. El oxígeno es una de las moléculas más importantes en el ciclo de vida. Que sirve como receptor terminal de electrones de la fosforilación oxidativa en las mitocondrias y se utiliza en la producción de especies reactivas del oxígeno. Las mediciones de oxígeno son importantes para el estudio de las funciones mitocondriales y metabólicos, vías de señalización, los efectos de los diversos estímulos, permeabilidad de la membrana, y la diferenciación de la enfermedad. El consumo de oxígeno es por lo tanto, un marcador informativo del metabolismo celular, que es ampliamente aplicable a diferentes sistemas biológicos de las mitocondrias en las células de organismos completos. Debido a su importancia, muchos métodos han sido desarrollados para las mediciones de oxígeno en los sistemas vivos. Los intentos actuales para proporcionar imágenes de alta resolución de oxígeno se basan principalmente en la fluorescencia óptica y los métodos de fosforescencia que no ofrecen resultados satisfactorios, ya que emplean sondas con fotografías de alta toxicidad y sensibilidad con poco oxígeno. ESR, que mide la señal de las sondas paramagnéticas exógenos en la muestra, es conocida por proporcionar mediciones muy precisas de la concentración de oxígeno. En un caso típico, las mediciones de ESR mapa LineShape ampliación de la sonda y / o relajación, acortando el tiempo que están vinculados directamente a la concentración de oxígeno local. (El oxígeno es paramagnética, por lo tanto, al chocar con la sonda paramagnética exógenos, que falta de su tiempo de relajación.) Tradicionalmente, este tipo de experimentos se llevan a cabo con una resolución baja, a escala milimétrica ESR para obtener imágenes de pequeños animales. Aquí mostramos como ESR imágenes también se pueden realizar en la escala micrométrica para el examen de las pequeñas muestras vivas. ESR micro-imagen es una metodología relativamente nueva que permite la adquisición de resolver espacialmente las señales de ESR con una resolución de 1 micra acercarse a temperatura ambiente 2. El principal objetivo de este protocolo de papel es mostrar cómo este nuevo método, junto con el nuevo desarrollo sensibles al oxígeno, sondas, se puede aplicar a la cartografía de los niveles de oxígeno en pequeñas muestras vivas. Una resolución espacial de aproximadamente 30 x 30 x 100 m se demuestra, con casi micromolar sensibilidad concentración de oxígeno y sub-femtomol sensibilidad absoluta de oxígeno por voxel. El uso de ESR micro-imágenes para el mapeo de oxígeno cerca de las células complementa las técnicas disponibles actualmente sobre la base de micro-electrodos o de fluorescencia / fosforescencia. Además, con la sonda paramagnética adecuada, sino que también será de fácil aplicación para intracelular de oxígeno micro-imagen, una capacidad que otros métodos resulta muy difícil de lograr.

Este protocolo describe un método de tres dimensiones escala micrométrica imágenes de la concentración de oxígeno en el entorno inmediato de las células vivas por microscopía electrónica de resonancia de spin.

Resonancia de spin electrónico micro imágenes en vivo de las especies para la asignación de oxígeno

Este protocolo describe un método de microimagen por resonancia de espín electrónico (ESR) para el mapeo tridimensional de los niveles de oxígeno en el entorno inmediato...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en obtener imágenes tridimensionales a escala micrométrica de la concentración de oxígeno en el entorno inmediato de células vivas mediante microscopía de resonancia paramagnética electrónica o ESR. El protocolo se demostrará en cianobacterias, que son células fotosintéticas comunes. Esto se logra primero preparando una muestra de células de cianobacterias dentro del portaobjetos para microscopía ESR.Inmerso en una solución estable de radicales orgánicos. El portamuestras se coloca dentro de la sonda de imagen, que a su vez se introduce en el electroimán estático del sistema de microscopía de RES. Ahora, se adquieren varias imágenes microscópicas tridimensionales de resonancia de espín electrónico de la solución de radicales orgánicos mediante el microscopio de RES.Esto se lleva a cabo con varias variantes de secuencias de pulsos y a menudo bajo diversas condiciones externas, como en condiciones de luz y oscuridad. A continuación, el ordenador procesa las imágenes de datos brutos para extraer los tiempos de relajación tridimensionales con resolución espacial del radical. Estos tiempos de relajación proporcionan una medida directa de la concentración de oxígeno mediante una calibración previa, lo que permite obtener mapas tridimensionales completos de oxígeno de las muestras analizadas bajo diversas condiciones externas.Se obtienen resultados que muestran claramente la falta de producción de oxígeno por las cianobacterias cuando no se aplica luz. Además, se demuestra que bajo irradiación luminosa, se generan un gradiente de oxígeno significativo y heterogeneidad de oxígeno cerca de las células de cianobacterias. Hola, soy Al del laboratorio de BLA en la Facultad S de Química del Technion, el Instituto Tecnológico de Israel en Haifa.Hoy les mostraremos un procedimiento para mapear las concentraciones de oxígeno cerca de células vivas de manera tridimensional con alta resolución espacial mediante microscopía de punta de brazo férrea. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la tasa de consumo de oxígeno y la actividad metabólica de las células. Así que comencemos.La resonancia de espín electrónico o ESR es una técnica espectroscópica en la que la radiación electromagnética a una frecuencia específica es absorbida por especies paramagnéticas que poseen espín de electrón desapareado y que se encuentran bajo un campo magnético estático externo. Es un método potente para estudiar el entorno de moléculas paramagnéticas en especies vivas, incluyendo las concentraciones de oxígeno y especies reactivas de oxígeno. Aquí se muestra una imagen típica de la concentración de oxígeno en un ratón con tumor, para muestras heterogéneas.La información espectral de RES se puede obtener de manera espacialmente resuelta mediante el uso de gradientes de campo magnético. Se inyectó un radical orgánico estable y libre en el ratón, y sus características de RES proporcionan la concentración de oxígeno en su entorno. Los resultados basados en RES se superponen a una imagen anatómica de MRI. Hasta ahora, tales técnicas de imagen por RSE de especímenes vivos solo se habían llevado a cabo con muestras relativamente grandes a escala de milímetros. La microscopía de RSE de resolución implica la medición de muestras de tamaño milimétrico y submilimétrico, proporcionando imágenes tridimensionales de RSE con una resolución cercana a un micrón.A continuación se presentan dos ejemplos de imágenes de ESR de alta resolución a escala micrométrica, de una muestra generada con polvo de NNC 60 y cristales paramagnéticos de ferrocianuro de litio. Un microscopio de ESR es similar a un espectrómetro convencional de ESR, ya que posee un imán para generar el campo estático, un sistema de microondas para la excitación de espines y la detección de señales, una sonda para sostener la muestra y una consola informática para controlar el proceso de adquisición y el manejo de datos. Otros componentes del sistema incluyen controladores electrónicos de gradiente de campo magnético y bobinas de gradiente ubicadas en la sonda de imagen.Las bobinas de gradiente también tienen una abertura que permite la irradiación de luz sobre la muestra. Se aplica a la muestra un aire húmedo controlado en temperatura para garantizar una deshidratación mínima durante el experimento. Las principales características únicas de la microscopía de RES son el pequeño tamaño de la sonda y de las bobinas de gradiente, la mayor sensibilidad de espín del sistema y la alta intensidad de los generadores de gradiente de campo magnético. Antes de comenzar este procedimiento, prepare una suspensión de cianobacterias a una concentración de 40 miligramos por mililitro.Para comenzar la preparación de la muestra para microimagen de RES, tome unos cuantos cuadrados de papel absorbente de aproximadamente 400 por 400 micrones utilizando pinzas finas. Luego, insértelos en un tubo einor. Posteriormente, llene el tubo con 1.2 mililitros de la suspensión de cianobacterias.Luego, centrifugue la suspensión durante dos minutos a 6.000 RPM en una microcentrífuga; tras la centrifugación, retire completamente el sobrenadante excepto aproximadamente 50 microlitros, que se dejan para evitar la deshidratación de las cianobacterias. Este proceso provoca la saturación del papel absorbente con las células de cianobacterias. A continuación, prepare un portaobjetos especial de vidrio en forma de copa, extraiga algunas fibras del papel usando pinzas finas y colóquelas en el fondo del portaobjetos.A continuación, agregue tres milimolares de tridel y solución BG 11, que se prepara según lo descrito en el protocolo escrito mediante un octavo de jeringa. Luego, selle el portamuestras con adhesivo curable por UV aplicando el adhesivo entre los bordes del portamuestras de vidrio y su cubreobjetos correspondiente, dejando abierta una pequeña salida de aire. Finalmente, cure el adhesivo con luz UV durante dos segundos.Para comenzar el experimento de imagen, encienda el sistema de microimagen ESR e inserte la muestra en el resonador que va dentro de la sonda de imagen. Ahora, utilizando el software de control del ordenador, configure el sistema en modo de sintonización y encuentre la frecuencia de microondas de resonancia de la sonda, que se utilizará para las mediciones de ESR. A continuación, ajuste el campo magnético estático al valor que coincida con la frecuencia de microondas aplicada.Establezca los parámetros de temporización para la secuencia de pulsos y observe la señal de RES para asegurarse de que el sistema funcione correctamente y de que la muestra esté bien preparada. Luego, configure los parámetros de imagen, como el número de píxeles, la intensidad de los gradientes y la duración de los pulsos de gradiente, a sus valores requeridos. Tras la configuración, adquiera tres imágenes tridimensionales de RES mediante una secuencia de pulsos de imagen con eco Han, con valores de separación interpulsos tau de 500, 600 y 700 nanosegundos.En este momento, encienda la proyección de luz sobre la muestra si es necesario para las condiciones experimentales durante toda la adquisición; los datos se guardan automáticamente. Tras el proceso de adquisición de datos, los archivos de datos en bruto mediante un script de software MATLAB. Utilizando el software, genere imágenes de la concentración del radical trill y del tiempo de relajación.T dos se utiliza para mapear y luego traducir estas imágenes a una imagen de concentración de oxígeno mediante una curva de calibración preexistente que vincula la concentración de oxígeno con el tiempo de relajación. Aquí, T dos cero es el tiempo de relajación espín-espín del indicador bajo condiciones anóxicas, que depende de la concentración C del indicador y de su coeficiente de difusión D. Se muestran imágenes típicas de datos brutos procedentes de varios experimentos tridimensionales de imágenes por resonancia paramagnética electrónica realizados en cianobacterias. Estas imágenes se adquirieron con diferentes valores de tau, bien en condiciones de oscuridad o de luz.Bajo condiciones de oscuridad, los resultados son muy similares, excepto por una intensidad reducida para los valores más grandes de T debido al tiempo de relajación espín-espín T dos. Por el contrario, bajo irradiación luminosa, el patrón de la imagen cambia debido a los diferentes tiempos de relajación a lo largo de la muestra. Luego, estos datos se procesan para obtener una imagen de amplitud a partir de esta imagen.Es evidente que la cianobacteria se encuentra principalmente en el lado derecho del portaobjetos. Las dos imágenes se traducen en valores de concentración de oxígeno mediante una curva de calibración preexistente que relaciona la concentración de oxígeno con el tiempo de relajación. Los resultados se muestran para cianobacterias en presencia y ausencia de luz.Es evidente que la producción de oxígeno se inicia con la luz y provoca un aumento significativo en la concentración de oxígeno en la solución. Esto conduce a una disminución del radical T dos, principalmente en los vóxeles cercanos a las fibras de papel absorbente con las cianobacterias. Acabamos de mostrarle cómo preparar una muestra que contiene células vivas con radical libre estable para la obtención de mapas de concentración de oxígeno mediante microscopía de R E E S. Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantenerlo lo más breve posible para asegurar la reproductibilidad y evitar la degradación de la muestra.Así que eso es todo. Gracias por vernos y buena suerte con su experimento.

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Time-lapse microscopía de marcadores autofagia marcados con fluorescencia permite la monitorización de la respuesta de la autofagia dinámico con alta resolución temporal. Usando la autofagia específico y los marcadores de orgánulos en una combinación de 3 colores diferentes, podemos seguir la aportación de una proteína a la formación autophagosome en un contexto espacial y temporal robusto.

Imágenes de células vivas de las primeras autofagia Eventos: Omegasomes y más allá

Un método nuevo de resonancia paramagnética electrónica (EPR), rápidos de escaneo de EPR (RS-EPR), se demuestra para la imagen espacial espectral 2D que es superior a la técnica tradicional de onda continua (CW) y abre nuevos lugares para formación de imágenes in vivo. Los resultados se demostraron a 250 MHz, pero la técnica es aplicable a cualquier frecuencia.

El rápido escaneo de electrones resonancia paramagnética abre nuevas vías para Imaging fisiológicamente parámetros importantes<em&gt; En Vivo</em

Describimos el uso de una novedosa cámara de duración de luminiscencia de dominio de frecuencia para mapear distribuciones 2D O2 con láminas de sensor óptico. El sistema de cámaras y los procedimientos de análisis de imágenes se describen junto con la preparación, calibración y aplicación de láminas de sensores para visualizar el microambiente O2 en la rizoesfera de plantas acuáticas.

Luminescence Lifetime Imaging of O2 con un sistema de cámara basado en dominio de frecuencia

El protocolo describe la generación de esferoides de alto rendimiento para la bioimpresión utilizando el análisis multiparamétrico de su oxigenación y muerte celular en un microscopio de fluorescencia estándar. Este enfoque se puede aplicar para controlar la viabilidad de los esferoides y realizar la estandarización, lo cual es importante en el modelado de tejido 3D, el microambiente tumoral y la biofabricación (micro) tisular exitosa.

Biofabricación asequible asistida por microscopía de oxígeno de esferoides multicelulares

Este artículo describe el uso de un nuevo y rápido generador de imágenes ópticas para la obtención de imágenes macroscópicas de la vida útil de la fotoluminiscencia de muestras que emiten descomposición larga. Se describen los procedimientos de integración, adquisición de imágenes y análisis, junto con la preparación y caracterización de los materiales del sensor para la obtención de imágenes y la aplicación del generador de imágenes en el estudio de muestras biológicas.

Macro Imager de vida útil de fluorescencia para aplicaciones biomédicas

Presentamos un protocolo para visualizar directamente las actividades metabólicas en células reguladas por aminoácidos utilizando microscopía de dispersión Raman estimulada con sonda de óxido de deuterio (agua pesada D2O) (DO-SRS), que se integra con microscopía de fluorescencia por excitación de dos fotones (2PEF).

Imagen química bioortogonal del metabolismo celular regulado por aminoácidos aromáticos

Se obtuvieron imágenes cuantitativas de mapas cuantitativos de oxígeno en 3D de tumores murinos de forma no invasiva mediante resonancia paramagnética de electrones de pulso. Para la anatomía y la estructura vascular se utilizaron el ultrasonido en modo B y el Doppler de potencia. Las imágenes de ambas modalidades se superpusieron para el análisis tumoral multiparamétrico.

Evaluación de la hipoxia tumoral: imágenes de oxígeno en 3D in vivo mediante resonancia paramagnética electrónica 

Utilizando una plataforma multimodal que combina modalidades de imágenes ópticas sin etiquetas, hemos desarrollado un protocolo para visualizar y cuantificar la dinámica y el metabolismo celular. A través de imágenes a través de fluorescencia multifotónica, generación de segundos armónicos y microscopía de dispersión Raman estimulada, podemos generar una visión holística del entorno celular y molecular.

Plataforma de imagen óptica multimodal para el estudio del metabolismo celular

Introdujimos una técnica de imagen novedosa llamada Tomografía de Interferencia Óptica Multicapa (OMLIT), que permite la imagen imparcial de todas las células en muestras cerebrales a mesoescala y puede integrarse perfectamente en el flujo de trabajo de imagen de la microscopía electrónica de barrido serial basada en cinta en la misma muestra.

Un método de imagen óptica compatible con microscopía electrónica de barrido para el mapeo cerebral mesoscópico de todas las células

Aprende a mapear concentraciones de oxígeno en células vivas mediante microscopía de resonancia de spin electrónico con resolución micrométrica. Este método utiliza cianobacterias fotosintéticas para visualizar gradientes de oxígeno en tres dimensiones bajo diferentes condiciones de iluminación.

Resonancia de spin electrónico micro imágenes en vivo de las especies para la asignación de oxígeno

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