Gramicidina basado en ensayo de fluorescencia, para la determinación de moléculas pequeñas posibles para modificar las propiedades bicapa lipídica

El objetivo general de este procedimiento es medir los cambios inducidos por fármacos en las propiedades de la bicapa detectados por las proteínas que abarcan la bicapa. Esto se logra fabricando primero sles unilaterales grandes cargados de flúor. El segundo paso del procedimiento es dopar las vesículas con gramina.

El tercer paso del procedimiento es agregar un enfriador externo y medir la tasa de enfriamiento del fluoro interno. Cuatro. El paso final del procedimiento es cuantificar el cambio en la actividad de enfriamiento de fluor por gramina ajustando una función exponencial estirada al curso del tiempo de fluorescencia. En última instancia, se pueden obtener resultados para evaluar si los archivos amfi pueden alterar las propiedades de la bicapa lipídica.

Hola, soy Ola Anderson. Hola, soy Helson. Hola, soy Richie Kapo.

Y yo soy Leah Sanford, del laboratorio del Dr. Olaf Anderson en el Departamento de Fisiología y Biofísica del Weill Cornell Medical College. Hoy le mostraremos un procedimiento para medir los cambios en las propiedades de la biocapa lipídica. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar los efectos de fármacos y moléculas pequeñas sobre las propiedades biliares lipídicas.

Así que comencemos El primer día de este procedimiento, retire el lípido del congelador y deje que se equilibre a temperatura ambiente. Una vez equilibrado, agregue 0,6 mililitros de 25 miligramos por mililitro, solución de lípidos y cloroformo a un matraz de fondo redondo de 25 mililitros. A continuación, seque la solución bajo gas nitrógeno mientras gira continuamente el matraz hasta que todo el cloroformo se haya evaporado.

Y una fina película blanca de lípidos cubre toda la mitad inferior del matraz, seca aún más el lípido en un desecado al vacío durante la noche. Prepare una solución de 100 milimolares de nitrato de sodio, 25 milimolares, A NTS y 10 milimolares de HEPs de pH siete. Al ajustar el pH de esta solución, evite cualquier solución que contenga cloruro.

Como el Quencher de talio forma un complejo insoluble con el cloruro en el segundo día, rehidrate los lípidos en 1,67. Un mililitro de esta solución electrolítica para obtener una suspensión lipídica de 10 milimolares. Una vez que se haya alcanzado la concentración correcta, cubra con una película para y un vórtice la suspensión, proteja completamente la muestra de la luz con papel de aluminio y déjela envejecer a temperatura ambiente durante la noche.

En el tercer día, sonicate la mezcla durante un minuto en un sonicate de baja potencia. Luego congele y descongele la muestra con cinco minutos en hielo seco, seguidos de cinco minutos en agua tibia, repita el ciclo de congelación y descongelación de cuatro a cinco veces. Extruya la suspensión lipídica con un mini extrusor Avanti.

Configure la mini extrusora con un filtro de policarbonato de 0,1 micras y los soportes de filtro extruyen la suspensión hacia adelante y hacia atrás 21 veces, de modo que una suspensión casi translúcida termina en la jeringa opuesta, lo que da como resultado una gran vesícula ular o una suspensión LUV. Retire el NTS A externo pasando la suspensión extruida sobre una columna de duling PD 10 que se haya equilibrado con tampón de sodio. Agregue 1,5 mililitros de la suspensión LUV más un mililitro de tampón de sodio a la columna.

Una vez que la solución esté completamente incorporada en la columna, eluya los liposomas con tres mililitros de tampón de sodio y recoja el eluido. La solución madre de LUV rellena de NTS A resultante debe contener alrededor de cuatro a cinco milimolares de lípidos y parecer translúcida. Blanco lechoso.

Proteja la solución de la luz con papel de aluminio y guárdela a 13 grados centígrados 24 horas antes de usarla a fondo. La solución madre LUV llena de NTS A. Como los UUV tienen una densidad superior a un gramo por mililitro y/o sedimento.

A continuación, diluya la solución madre LUV llena de A NTS. De uno a 20 con tampón de sodio incuban tres cuartas partes de los liposomas con 260 nanogramos de abidina en DMSO. Agregue el mismo volumen de DMSO sin gramín al cuarto restante.

Para mantener constante la concentración de disolvente en todas las muestras, deje que la gramina se equilibre entre las monocapas interna y externa de las vesículas lipídicas durante 24 horas a 13 grados centígrados. Aquí, se utiliza un espectrofluorímetro de flujo detenido SX punto 20 de fotofísica aplicada con control de temperatura para medir la tasa de extinción de la fluorescencia. Para comenzar, encienda los instrumentos con una hora de anticipación para permitir el calentamiento del instrumento.

La ranura con los relatores para la excitación debe ser de una barra y se debe usar un filtro de paso alto de 4 55 nanómetros para registrar la emisión utilizando el software pro data SX. Configure primero las condiciones de grabación, establezca las longitudes de onda de excitación del monocromador en 3 52 nanómetros. Utilice el ajuste de retención de presión.

Establezca el tiempo en un segundo y los puntos en 5.000. Ajuste el número de repeticiones a nueve para las ejecuciones de búfer y a 13 para las ejecuciones de extinción. Supervise la temperatura en el perfil de la unidad de verificación del software Essex.

El volumen de la unidad debe establecerse en 120 microlitros, lo que mezcla 60 microlitros de cada jeringa. Esto da un tiempo muerto de aproximadamente 1,2 milisegundos. Ajuste el alto voltaje o la ganancia en el detector de fluorescencia a aproximadamente 420 voltios.

El objetivo es obtener una lectura de fluorescencia de aproximadamente ocho en equilibrio de los UUV cargados con A NTS previamente preparados durante 10 minutos a 25 grados Celsius en la oscuridad. Una vez equilibrada la muestra, cárguela en la jeringa izquierda. En la jeringa correcta, cargue tampón de sodio o talio. Extintor.

Elimine las burbujas de aire empujando las jeringas hacia adelante y hacia atrás. Ambas jeringas deben cargarse por igual. Antes de cerrar las válvulas para la primera muestra, registre la fluorescencia con tampón de sodio.

Repita cuatro veces y ajuste la ganancia según sea necesario. A continuación, repita cinco veces más para las muestras restantes. Registre nueve repeticiones con tampón de sodio.

Reemplace el tampón de sodio con el extintor de talio y registre 13 repeticiones. Enjuague con agua y continúe con los siguientes controles de muestra. Incluir muestras sin gramina y con disolvente, sin gramina y la concentración máxima de compuesto.

Y con la gramina y el disolvente después del ensayo de fluorescencia, lea los datos en el software de MATLAB para su análisis. Por cada muestra leída en todas las repeticiones del tampón y del extintor, las primeras cuatro repeticiones estarán contaminadas por lo que había previamente en el tubo. En este caso, la señal proviene de la mezcla de la muestra de tampón de sodio con agua del lavado anterior.

Las repeticiones del cinco al nueve representan la señal de la muestra solamente. Por lo tanto, siempre excluimos las primeras cuatro repeticiones en cada caso. Para evitar cualquier artefacto de mezcla, revise manualmente los rastros y elimine las repeticiones incorrectas, como el trazo rojo que contiene picos o desviaciones debidos a artefactos de mezcla o burbujas.

A continuación, normalice las repeticiones del extinguidor al valor inicial promedio de las repeticiones del tampón para cada muestra para cada condición experimental, combine los promedios de todas las muestras en un gráfico de visualización, las muestras sin gramina deben ser todas similares y casi no mostrar extinción de fluorescencia. Hay una reducción lenta de la señal fluorescente debido a la lentitud del ion talio en las vesículas para las muestras con gram sidin. Si el curso del tiempo fluorescente es visiblemente alterado por el compuesto, entonces el compuesto altera las propiedades de la bicapa lipídica a la concentración probada a continuación en una exponencial estirada a los primeros dos a 100 milisegundos de las curvas de extinción de fluorescencia normalizadas.

Para las repeticiones individuales y calcule la velocidad a dos milisegundos. A continuación, calcule los promedios y las desviaciones estándar para una muestra dada de la muestra individual Repite el efecto de la capsaicina denotado aquí como cap se observó en el curso del tiempo de enfriamiento fluorescente en ausencia o presencia de gramina denotada como ga, la señal fluorescente normalizada se muestra durante un segundo aquí. Los puntos grises representan los resultados de todas las repeticiones, mientras que las líneas rojas son los promedios.

Se muestran los primeros 100 milisegundos de la señal fluorescente normalizada. Los puntos grises son el resultado de una sola repetición para cada condición. Las líneas rojas son ajustes exponenciales estirados a esas repeticiones.

La línea azul sofocada denota la marca de dos milisegundos. El tiempo en el que se determina la velocidad de enfriamiento. El cambio relativo en la velocidad de enfriamiento se determina normalizando los datos a la muestra de control con gramina y sin modificador.

Cuando la capsaicina se absorbe a la bicapa lipídica, altera las propiedades de la bicapa. El cambio hacia la bicapa más blanda se reflejará como un cambio en el lado de gramos en el equilibrio del monodímero a favor del dímero conductor. Acabamos de mostrarte un procedimiento para medir los efectos perturbadores de la bicapa de una molécula pequeña.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar que debe utilizar los controles adecuados para cada experimento utilizando el mismo lote de vesículas. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.