Gramicidina basado en ensayo de fluorescencia, para la determinación de moléculas pequeñas posibles para modificar las propiedades bicapa lipídica

El objetivo general de este procedimiento es medir los cambios inducidos por fármacos en las propiedades de la bicapa, tal como las detectan las proteínas que abarcan la bicapa. Esto se logra primero preparando vesículas unilaminares grandes cargadas con Fluor. El segundo paso del procedimiento consiste en dopar las vesículas con gramicidina.

El tercer paso del procedimiento consiste en añadir un agente extintor externo y medir la velocidad de extinción del fluoro interno. Cuatro. El paso final del procedimiento es cuantificar el cambio en la extinción de la fluorescencia por unidad de actividad gramin ajustando una función exponencial estirada a la curva temporal de fluorescencia. En última instancia, se pueden obtener resultados para evaluar si los archivos amfi pueden alterar las propiedades de la bicapa lipídica.

Hola, soy Ola Anderson. Hola, soy Helson. Hola, soy Richie Kapo.

Y soy Leah Sanford del laboratorio del Dr. Olaf Anderson en el Departamento de Fisiología y Biofísica del Weill Cornell Medical College. Hoy les mostraremos un procedimiento para medir cambios en las propiedades de la bicapa lipídica. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar los efectos de fármacos y moléculas pequeñas sobre las propiedades de la bicapa lipídica.

Entonces, comencemos. En el día uno de este procedimiento, retire el lípido del congelador y déjelo equilibrar a temperatura ambiente. Una vez equilibrado, agregue 0,6 mililitros de una solución de lípido en cloroformo al 25 miligramos por mililitro a un matraz redondo de 25 mililitros. Luego, seque la solución bajo gas nitrógeno mientras gira continuamente el matraz hasta que todo el cloroformo haya evaporado.

Y una fina película blanca de lípido recubre la mitad inferior del matraz; seque el lípido adicionalmente en un desecador bajo vacío durante la noche. Prepare una solución de 100 milimolar de nitrato de sodio, 25 milimolar de A NTS y 10 milimolar de HEPs a pH siete. Al ajustar el pH de esta solución, evite cualquier solución que contenga cloruro.

Dado que el amortiguador de talio forma un complejo insoluble con el cloruro en el día dos, rehidrate los lípidos en 1,67. Un mililitro de esta solución electrolítica para obtener una suspensión de lípidos de 10 milimolares. Una vez que se haya alcanzado la concentración correcta, cúbralo con película de parafina y vortexe la suspensión completamente, proteja la muestra de la luz con papel de aluminio y déjela envejecer a temperatura ambiente durante la noche.

El tercer día, someta la mezcla a sonicación durante un minuto en un sonicador de baja potencia. Luego, congele y descongele la muestra durante cinco minutos en hielo seco, seguido de cinco minutos en agua tibia; repita este ciclo de congelación y descongelación de cuatro a cinco veces. Extruya la suspensión lipídica utilizando un extrusor mini Avanti.

Configure el miniextrusor con un filtro de policarbonato de 0,1 micrómetros y soportes para filtros, y extruya la suspensión de ida y vuelta 21 veces hasta que una suspensión casi translúcida quede en la jeringa opuesta, obteniendo así una suspensión de vesículas grandes unilamelares (LUV). Elimine los ANTS externos pasando la suspensión extruida por una columna de desalación PD-10 que haya sido equilibrada con tampón de sodio. Añada 1,5 mililitros de la suspensión de LUV más un mililitro de tampón de sodio a la columna.

Una vez que la solución se haya incorporado completamente en la columna, eluya los liposomas con tres mililitros de tampón de sodio y recoja el eluido. La solución stock resultante de LUV rellenos con A NTS debe contener aproximadamente de cuatro a cinco milimolares de lípido y presentarse translúcida. De color blanco lechoso.

Proteja la solución de la luz con papel de aluminio y almacénela a 13 grados Celsius durante 24 horas antes de su uso; vortexee completamente. La solución stock de LUV rellena con A NTS. Dado que los UUV tienen una densidad mayor a un gramo por mililitro y/o sedimentan.

Luego, diluya la solución stock de LUV llenas con A NTS en una proporción de uno a 20 con tampón de sodio. Incube tres cuartas partes de los liposomas con 260 nanogramos de abidin en DMSO. Añada el mismo volumen de DMSO sin gramin al cuarto restante.

Para mantener constante la concentración de disolvente en todas las muestras, permita que la gramina se equilibre entre las monocapas interna y externa de las vesículas lipídicas durante 24 horas a 13 grados Celsius. Aquí, se utiliza un espectrofluorímetro de flujo detenido Photophysics SX.18.MV con control de temperatura para medir la velocidad de apagado de la fluorescencia. Para comenzar, encienda los instrumentos una hora antes para permitir el calentamiento del equipo.

La rendija con reproductores para la excitación debe ser de uno a uno y se debe utilizar un filtro paso alto de 55 nanómetros para registrar la emisión mediante el software Pro Data SX. Primero, configure las condiciones de grabación; ajuste las longitudes de onda de excitación del monocromador a 352 nanómetros. Utilice la configuración de retención de presión.

Establezca el tiempo en un segundo y los puntos en 5 000. Ajuste el número de repeticiones a nueve para las corridas de tampón y a 13 para las corridas de agente apagador. Monitoree la temperatura en el perfil de unidad del software Essex.

El volumen de impulso debe ajustarse a 120 microlitros, lo que mezcla 60 microlitros de cada jeringa. Esto proporciona un tiempo muerto de aproximadamente 1,2 milisegundos. Ajuste el voltaje alto o la ganancia del detector de fluorescencia a unos 420 voltios.

El objetivo es obtener una lectura de fluorescencia de aproximadamente ocho. Equilibre durante 10 minutos a 25 grados Celsius en la oscuridad las UUV cargadas con A NTS previamente preparadas. Una vez equilibrado, vortexee la muestra y luego introdúzcala en la jeringa izquierda. En la jeringa derecha, coloque tampón de sodio o talio. Agente de apagado.

Elimine cualquier burbuja de aire moviendo los émbolos hacia adelante y hacia atrás. Ambos émbolos deben cargarse por igual. Antes de cerrar las válvulas para la primera muestra, registre la fluorescencia con tampón de sodio.

Repita cuatro veces y ajuste la ganancia según sea necesario. Luego repita cinco veces más para las muestras restantes. Registre nueve repeticiones con tampón de sodio.

Sustituya el tampón de sodio por el inhibidor de talio y registre 13 repeticiones. Enjuague con agua y continúe con los controles de la siguiente muestra. Incluya muestras sin gramin y con disolvente, sin gramin y con la concentración máxima del compuesto.

Y con ambos gramin y disolvente siguiendo el ensayo de fluorescencia, lea los datos en el software MATLAB para su análisis. Para cada muestra, lea todas las repeticiones del tampón y del agente apagador; las primeras cuatro repeticiones estarán contaminadas por lo que anteriormente se encontraba en el tubo. En este caso, la señal proviene de la mezcla de la muestra de tampón de sodio con agua del lavado previo.

Los repeticiones de la cinco a la nueve representan la señal proveniente únicamente de la muestra. Por lo tanto, siempre excluimos las primeras cuatro repeticiones en cada caso. Para evitar cualquier artefacto de mezclado, revise manualmente las trazas y elimine cualquier repetición defectuosa, como la traza roja que contiene picos o desviaciones debidas a artefactos de mezclado o a la presencia de burbujas.

Luego, normalice las repeticiones del agente apagador al valor inicial promedio de las repeticiones del tampón para cada muestra en cada condición experimental, combine los promedios de todas las muestras en un gráfico; las muestras de visualización sin gramina deben ser similares y mostrar casi ninguna atenuación de fluorescencia. Hay una reducción lenta en la señal fluorescente debido a la entrada lenta del ion talio en las vesículas para muestras con gramisidina. Si el curso temporal de la fluorescencia se altera visiblemente por el compuesto, entonces el compuesto altera las propiedades de la bicapa lipídica en la concentración ensayada; a continuación, ajuste una exponencial estirada a los primeros dos hasta 100 milisegundos de las curvas normalizadas de atenuación de fluorescencia.

Para los ensayos individuales, calcule la velocidad a los dos milisegundos. Luego, calcule los promedios y las desviaciones estándar para una muestra dada a partir de los ensayos individuales. El efecto de la capsaicina, denotado aquí como cap, se observó en el curso temporal del apagado fluorescente en ausencia o presencia de gramin, denotado como ga; la señal fluorescente normalizada se muestra aquí durante un segundo. Los puntos grises representan los resultados de todos los ensayos, mientras que las líneas rojas corresponden a los promedios.

Se muestra los primeros 100 milisegundos de la señal fluorescente normalizada. Los puntos grises son los resultados de una repetición individual para cada condición. Las líneas rojas son ajustes exponenciales estirados a esas repeticiones.

La línea azul atenuada indica la marca de dos milisegundos. El momento en el que se determina la velocidad de apagado. El cambio relativo en la velocidad de apagado se determina normalizando los datos con respecto a la muestra control con gramin y sin modificador.

Cuando la capsaicina se absorbe en la bicapa lipídica, altera las propiedades de la bicapa. El cambio hacia una bicapa más blanda se reflejará como un desplazamiento hacia el lado gram en el equilibrio entre monómero y dímero, favoreciendo al dímero conductor. Acabamos de mostrarle un procedimiento para medir los efectos perturbadores de una molécula pequeña sobre la bicapa.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar utilizar los controles adecuados para cada experimento, empleando el mismo lote de vesículas. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.