Transfección de células individuales en embriones de pollo
25 de septiembre de 2010
Usando la punta fina micropipetas se inyecta el plásmido de ADN en subdominios de somitas pollo o tubos neurales. La concentración del plásmido se ajusta a generar solo las células transfectadas. A continuación, permitir que las células se desarrollan en poblaciones clonales.
El objetivo general de este procedimiento es inyectar células individuales de somitas elegantes o tubos neurales con un plásmido que codifica una proteína fluorescente verde. Esto se logra tirando primero de pipetas de microinyección con un diámetro de apertura de punta adecuado. El segundo paso del procedimiento es preparar un stock de plásmidos para inyecciones.
El tercer paso del procedimiento es preparar los embriones para la inyección. El cuarto paso del procedimiento es cargar las micropipetas con ADN plasmídico. El paso final del procedimiento es inyectar los tejidos deseados.
En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el rango de derivados en el número de células producidas por progenitores marcados individuales en subdominios seleccionados de som y tubo neural a través de microscopía inmunofluorescente. Hola, soy Rael del laboratorio del profesor Heim en el Departamento de Neurobiología Médica de la Universidad Hebrea de Jerusalén. Hoy te mostraremos un procedimiento para inyectar células individuales de somitas de pollo y tubos neurales.
Utilizamos este procedimiento en el laboratorio para estudiar la segregación de líneas de células de ácaros y tubos neurales. Así que comencemos: para generar células individuales transfectadas en embriones de pollo, comience tirando de micropipetas. Tiramos de nuestras pipetas en un extractor de pipetas Naga PP 83 estándar con un ajuste de calor de 13,5.
El ajuste preciso debe calibrarse para lograr un diámetro de punta de pipeta de entre ocho y 10 micras. Utilizamos tubos de vidrio de silicato Boris con un diámetro exterior de un milímetro y un diámetro interior de 0,75 a 0,78 milímetros. También puede utilizar micropipetas disponibles en el mercado, a las que les falta un filamento de un milímetro de diámetro exterior y 0,75 milímetros de diámetro interior.
Las pipetas preparadas se almacenan en una placa de plástico con las puntas protegidas del contacto con el borde de la placa. Para preparar el ADN para la microinyección, el plásmido de interés se transfecta en DH cinco alfa e coli. Utilizando procedimientos estándar, al día siguiente, el plásmido se purifica utilizando un kit de preparación Maxi para inyecciones no clonales, utilizamos una concentración de ADN de un microgramo por microlitro.
Para los experimentos en los que se desean clones individuales, la concentración de plásmidos será mucho menor y será necesario ajustarla. Para P-C-A-G-G-F-P-A, una concentración de 0,05 a 0,1 microgramos por microlitro funciona bien. Una vez que se ha determinado la concentración óptima, recomendamos la dilución de todo el stock de plásmidos purificado en lugar de preparaciones individuales a una concentración predeterminada.
Este último podría introducir alguna variación en las tasas de éxito, probablemente debido a variaciones en la pureza y otros parámetros, como la proporción de plásmido supercoil para preparar huevos para la microinyección Los huevos de gallina que se han incubado mientras yacen sobre sus ejes largos hasta la etapa de desarrollo deseada se frotan con etanol al 70% y se dejan secar. A continuación, perfora el extremo puntiagudo del huevo con unas tijeras quirúrgicas. Con una jeringa de 10 mililitros y una aguja de calibre 19, extraiga dos mililitros de albúmina del huevo y selle los agujeros con parafina caliente antes de la inyección.
Use tijeras quirúrgicas para abrir una ventana en la parte superior de la cáscara del huevo para evitar que los desechos entren en el agujero. Coloca un pedazo de cinta adhesiva sobre la ventana y haz un agujero a través de ella. Para ayudar a visualizar el embrión, use un capilar tirado por fuego montado en un aspirador para inyectar una tinta no tóxica como pelican 17 debajo de la dermis maldita.
A continuación, acceda al embrión cortando y desviando las membranas vitales y/o amnióticas utilizando alfileres de insectos de 0,14 milímetros montados en un soporte de aguja para cargar el ADN en la pipeta Eloqua extraída y agregue una pequeña cantidad de polvo verde rápido usando el capilar. Extraiga una cantidad mínima de capilar montado en plásmido de diámetro adecuado en un aspirador. A continuación, insértelo en el extremo de la pipeta opuesto a la punta afilada y cargue el ADN lo más cerca posible del extremo afilado.
A continuación, conecte la pipeta a un inyector de presión de aire manual montado en un micromanipulador. Aplique una cantidad mínima de presión si es necesario para permitir que la solución de plásmido llegue a la punta de la pipeta. Manipule la pipeta en el medio líquido del huevo mientras aplica un poco de presión de aire para evitar la obstrucción de la punta de la pipeta.
Una vez que se perfora el dominio tisular relevante, el cambio de presión suele ser suficiente para liberar el plásmido con un verde rápido visible. Si esto no ocurre, aplique una ligera presión a la jeringa hasta que se expulse la mezcla verde rápida del plásmido. Repita este procedimiento a lo largo del eje del embrión después de la inyección, se puede agregar PBS.
Finalmente, selle la ventana con cinta adhesiva y devuelva los huevos a la incubadora. Evite la ventilación e incluya pequeños recipientes de agua en la incubadora para ayudar a mantener la humedad y aumentar los rendimientos. Si el sitio objetivo de la inyección fue lo suficientemente superficial como para ser fácilmente evidente, como dentro del tubo neural o ectodermo de los somitas dorsales, se puede medir la tasa de éxito del experimento realizando una observación de toda la montura utilizando un binocular fluorescente.
Este paso es particularmente útil para evaluar si se han etiquetado demasiadas o muy pocas células. Si se desea una incubación adicional, agregue antibióticos que contengan solución de PBS al huevo después de verlo y reemplace la cinta del techo. Además, se puede evaluar la tasa de éxito de la inyección mediante la sección en serie de los embriones y la realización de inmunohistoquímica.
Después de cuatro horas o más, los embriones posteriores a la inyección se fijan y procesan para el corte en parafina. A continuación, las secciones montadas en vidrio se finalizan y podría ser deseable la inmunotinción para la visualización del reportero, como la biotina estreptavidina. Finalmente, se escanean las secciones seriadas para detectar células marcadas en segmentos inyectados.
Si en los ensayos iniciales se obtienen varias células en lugar de una sola, el stock de plásmidos debe diluirse en el proceso repetido hasta que se logren resultados adecuados. Por lo general, llevamos a cabo una sola inyección de P-C-A-G-G-F-P por ácaro y nos dirigimos a seis a 12 segmentos por embrión. Bajo esta configuración, se puede detectar una señal clara mediante la observación de la montura completa, ocho horas después de la inyección en al menos un segmento de un embrión de cada 10.
En este ejemplo, se inyectó a un ácaro un plásmido que codifica GFP, y cinco horas más tarde se observa una sola célula fluorescente en una vista de montaje completo del embrión que se muestra aquí. Cuando se observa 24 horas después de la inyección en el ácaro central, se observa un clon de células fluorescentes en un embrión montado entero dos días después de la inyección clonal. El corte de este segmento revela la presencia de progenie clonal tanto en la dermis como en el músculo, lo que demuestra que los progenitores individuales generan ambos derivados.
En cuanto a los somitas, los progenitores neuroepiteliales individuales en el tubo neural dorsal también pueden ser empalados, como se ilustra en esta sección transversal, fotografiada cinco horas después de la inyección. El análisis de secciones seriadas reveló que el transfecto clonal se logró cuando la tasa de éxito fue de alrededor del 10%Esto significa que para lograr la clonalidad, la técnica es, por definición, altamente ineficiente. Por otro lado, en estas condiciones, se encontró que más del 93% de los eventos de marcaje positivos eran clonales.
Acabamos de mostrarte cómo inyectar células individuales de embriones de pollo al realizar este procedimiento. Es importante recordar que debe diluir una gran cantidad de plásmido de stock hasta una concentración ideal para infecciones de una sola célula y luego usarlo a lo largo de sus experimentos. Así que eso es todo.
Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.
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Resumen
Este artículo describe un método para inyectar ADN plasmídico en células individuales de somitas o tubos neurales de pollo utilizando micropipetas de punta fina. El objetivo es crear poblaciones clonales de células transfectadas que expresen la proteína verde fluorescente.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Ingeniería genética
Antecedentes
- Las técnicas de microinyección son esenciales para estudiar la función génica.
- Los embriones de pollo se utilizan comúnmente como organismo modelo.
- El ADN plasmídico puede usarse para expresar proteínas fluorescentes con fines de visualización.
- La transfección de célula única permite el análisis de poblaciones celulares clonales.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para inyectar ADN plasmídico en tejidos específicos.
- Generar células individualmente transfectadas para su posterior estudio.
- Facilitar la observación de la expresión génica en embriones vivos.
Métodos Utilizados
- Preparación de pipetas de microinyección con diámetros de punta adecuados.
- Preparación de soluciones stock de plásmidos para la inyección.
- Preparación de embriones de pollo para microinyección.
- Inyección de ADN plasmídico en somitas o tubos neurales.
Resultados principales
- Inyección exitosa de ADN plasmídico en tejidos diana.
- Generación de células transfectadas individuales que se desarrollan en poblaciones clonales.
- Visualización de la expresión génica mediante la proteína verde fluorescente.
- Establecimiento de un protocolo para estudios futuros sobre la función génica.
Conclusiones
- La técnica de microinyección es eficaz para la transfección de célula única.
- Este método puede aplicarse a diversos estudios en biología del desarrollo.
- La investigación futura puede basarse en estos hallazgos para explorar la función génica in vivo.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La transfección de células individuales en embriones de pollo permite el seguimiento preciso de linajes y la manipulación genética, lo que apoya la validación de dianas en las vías de desarrollo. Este método proporciona una reducción mecanicista de riesgos al vincular el comportamiento de los progenitores con los resultados fenotípicos, informando decisiones tempranas de descubrimiento. Su reproducibilidad y análisis cuantitativo clonal aumentan la confianza predictiva en los sistemas de modelos preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante el seguimiento de progenie clonal a partir de progenitores individuales en subdominios del somito y del tubo neural.
- Valor operativo: Apoya la reducción de riesgos biológicos mediante la visualización directa de tipos celulares derivados (por ejemplo, dermis y músculo) a partir de precursores marcados.
- Valor estratégico: Facilita la selección de carteras al comparar poblaciones clonales genéticamente modificadas con controles para la evaluación funcional de objetivos.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo posteriores mediante la transfección esporádica de células individuales en dominios tisulares definidos.
- Valor operativo: Asegura la estandarización y reproducibilidad del ensayo mediante una concentración controlada de plásmido (0,05–0,1 µg/µl para etiquetado clonal) y parámetros consistentes de microinyección.
- Valor estratégico: Mejora la preparación para cribados al permitir el seguimiento de linajes escalable y compatible con plataformas en múltiples segmentos de embriones (6–12 por embrión).
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Se alinea con sistemas relevantes para enfermedades al modelar la dinámica clonal en la embriogénesis de vertebrados, lo cual es relevante para la investigación de trastornos congénitos.
- Valor operativo: Garantiza la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante inmunohistoquímica y análisis de secciones seriadas de segmentos transfectados.
- Valor estratégico: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo al cuantificar las tasas de éxito clonal (~10 % de transfección, >93 % de clonalidad entre positivos) para orientar la escala experimental.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la prueba de hipótesis en biología inicial hasta la identificación de candidatos mediante análisis funcional clonal, y trabajos preclínicos mediante el seguimiento longitudinal del fenotipo.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis al permitir el seguimiento de linajes de progenitores individuales para elucidar la diversificación del destino en las líneas celulares del somito y del tubo neural.
- Selección: Permite la preparación de ensayos mediante la elaboración reproducible de micropipetas (diámetro de la punta de 8–10 µm) y protocolos estandarizados de carga de ADN.
- Análisis: Proporciona resultados cuantitativos mediante microscopía inmunofluorescente y escaneo de secciones para medir la expansión clonal y la contribución derivada a lo largo del tiempo.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al permitir la comparación de poblaciones clonales manipuladas con controles durante hasta tres días posteriores a la inyección.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una capacidad reutilizable en diversos estudios debido a los procedimientos estandarizados de preparación de embriones, calibración de pipetas y dilución de plásmidos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor Científico: Confianza predictiva en la validación de dianas, reducción de ambigüedad mecanicista en las relaciones de linaje.
- Valor Operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad de la transfección de células individuales a lo largo de puntos temporales del desarrollo.
- Valor Estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas mediante fenotipificación clonal temprana.
- Impacto en la Cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo, basadas en métricas cuantitativas de derivación clonal.
Consideraciones de Implementación
- Se requiere experiencia en el tirado de micropipetas y manejo de embriones para lograr diámetros de punta de 8–10 µm y una penetración tisular exitosa.
- Los equipos necesarios incluyen micro manipulador, inyector de presión de aire y microscopía de fluorescencia para el seguimiento clonal.
- La estandarización entre equipos requiere protocolos consistentes de dilución de plásmidos (por ejemplo, 0,05–0,1 µg/µl) y de estadios embrionarios para garantizar tasas de transfección reproducibles.
- Las consideraciones para la adaptación en diferentes sistemas modelo implican ajustar la presión de inyección y la concentración de ADN según la accesibilidad del tejido y la geometría embrionaria.
- Las limitaciones prácticas incluyen una baja eficiencia de transfección (~10 %), lo que requiere dilución del material inicial e inyecciones repetidas para alcanzar resolución a nivel de célula individual.
