Name: Transfección de células individuales en embriones de pollo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-25T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Aprende a realizar transfección de células individuales en embriones de pollo mediante microinyección de ADN plasmídico. Este método permite generar poblaciones clonales expresando proteína verde fluorescente para estudiar función génica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Damos las gracias a Shlomi Krispin para la imagen del tubo neural. En particular, reconocemos Yuval Canela para iniciar la técnica de transfección de GFP. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Ciencias de Israel, Association Française contre les Miopatías, y Forschungsgemeinshaft Deutche, Centro de Investigación Cooperativa 488 a CK

1. Preparación de Micropipetas Sacamos nuestras pipetas en un estándar Narishige extractor pp-83 pipetas con un ajuste de calor de 13,5. La configuración precisa debe ser calibrado, con miras a un diámetro de punta de la pipeta de entre 8 y 10 micras. Usamos filamento que contienen los tubos de vidrio de borosilicato con un diámetro exterior de 1,0 mm y diámetro interior de 0,75-0,78 mm. Las pipetas, en consecuencia, almacenados en un plato de plástico con las puntas protegidas del contacto con los bordes del plato. 2. Preparación de ADN El plásmido de interés se transfecta en DH5a E. coli utilizando procedimientos estándar. Cultivos de una noche de las colonias solo se utilizan para purificar el plásmido con preparación maxi-kits (cualquier kit comercial debe hacer). Nosotros utilizamos una concentración del plásmido de 1,0 mg / l para los no clonal inyecciones. Las concentraciones más altas aumentan la obstrucción de las puntas de pipeta. Para aplicaciones clonal, las concentraciones de plásmido son mucho más bajos y se deben ajustar (ver más abajo). Para pCAGG-GFP, la concentración óptima producción clonal resultados se encontró que alrededor de 0,05-0,1 mg / l. Uno a 2 l de plásmido se utiliza normalmente por experimento, y una cantidad mínima de fast-verde en polvo (la adhesión a la punta de una pipeta seca, vidrio filoso) se añade a la plásmido antes de que el experimento comienza. El plásmido se centrifuga en una centrífuga de mesa durante 2 minutos a máxima velocidad. Este procedimiento parece reducir la obstrucción pipeta problemas. 3. La inyección de embriones 3.1 Preparación de los embriones Usamos la codorniz, así como huevos de gallina para preparaciones inyectables. Los huevos se incuban acostado sobre su eje longitudinal hasta la etapa de desarrollo deseado. Los huevos se limpiaron con etanol 70% y se deja secar. La punta del huevo se perfora con una tijera quirúrgica (esto es necesario sólo en huevos de gallina) y 1 ml (en codornices) o 2 ml (pollo) de albúmina se extrae del óvulo con una jeringa de 10 ml (19G aguja). Los agujeros se sellan con parafina caliente. Antes de la inyección actual, se abre una ventana en la parte superior de la cáscara de huevo con unas tijeras quirúrgicas. La colocación de cinta adhesiva sobre la cáscara y corte a través de ella puede ayudar a reducir los residuos de la cáscara. Tampón PBS que contiene antibióticos es una pipeta de inmediato en el óvulo. Para acceder a los embriones, la vitelina y / o membranas amnióticas se cortan y se desvía con 0,14 mm alfileres de insectos montados sobre un soporte de aguja. No es tóxico tinta (Pelican # 17) se inyecta debajo de la blastodermo para ayudar a visualizar el embrión, con un fuego tirado capilar montado en un aspirador. 3.2 Carga y montaje de micropipetas El extractor de micropipetas se puede cargar con el plásmido de fuego tirado por los capilares de diámetro adecuado, montado sobre un aspirador. Una mínima cantidad de plásmido se dibuja con el capilar y se cargan en la pipeta de lo contrario la apertura a la punta afilada, y acercándose a la punta desde el interior tanto como sea posible. La pipeta, en consecuencia, cargado en una presión de aire inyector manual montado en un micromanipulador. Presión mínima se aplica, si es necesario, a fin de permitir la solución de plásmido para llegar a la punta de la pipeta. 3.3 de inyección de plásmido La pipeta se manipula en el medio líquido del huevo mientras se aplica una presión de aire para evitar la obstrucción de la punta de la pipeta. El dominio del tejido relevante es traspasado. El cambio en la presión como la punta entra en el tejido es a menudo suficiente para liberar el plásmido con el verde rápido visible. Si este no es el caso, aplicar una ligera presión a la jeringa hasta que el verde plásmido / rápido son expulsados. Este proceso se puede repetir a lo largo del eje del embrión, por ejemplo, en somitas adyacentes oa lo largo de la extensión del tubo neural. Después de las inyecciones, PBS se puede añadir. La ventana está sellado con cinta adhesiva (parafina no es deseable, especialmente para los huevos de codorniz, que aumenta las tasas de muerte de embriones, probablemente mediante el bloqueo de intercambio de oxígeno a través de la cáscara). Los embriones tratados se devuelven a la incubadora. Evitar la ventilación y colocar pequeños recipientes con agua en la incubadora ya que ayudan a mantener los rendimientos y aumentar la humedad. 4. Ajuste de los parámetros de inyección y de seguimiento las tasas de éxito Asessing y calibración de los diferentes parámetros de la inyección es crítico para las aplicaciones destinadas a una sola célula de análisis. No todos los eventos de inyección llevará al etiquetado de éxito de una sola célula. Concentración de plásmido que es demasiado alto puede llevar a no clonal de etiquetado, mientras que el resultado concentraciones muy bajas en las tasas de fracaso. La concentración de la inyección del plásmido debe ser optimizado para inyecciones clonal. Se recomienda la dilución de la totalidad de acciones plásmido purificado en lugar de diluir preparaciones individuales a una concentración predeterminada. Este últimopodría introducir alguna variación de las tasas de éxito, probablemente debido a las variaciones en la pureza y otros parámetros tales como la proporción de plásmido superenrollado. 4.1 Evaluación de las tasas de éxito por toda la observación de montaje Evaluación inicial de los embriones inyectados pueden ser realizadas por todo el montaje de observación bajo un binocular fluorescentes. Seis a ocho horas después de la inyección son suficientes para evaluar las tasas de éxito con una construcción de buenas prácticas agrarias pCAGG mejorada. Esto es siempre que el sitio de destino es superficial suficiente para ser evidentes (por ejemplo, el somite dorsal, dorsal del tubo neural, etc ectodermo, ver Figura 1-C.). Este paso es especialmente útil para la evaluación de sus series experimentales exhiben ya sea células marcadas demasiados o, alternativamente, a falta de la presencia de células fluorescentes. Si se desea más de incubación, los antibióticos que contienen una solución de PBS, debe añadirse a la del huevo y después de ver la cinta de sellado debe ser reemplazado. 4.2 La evaluación de clonalidad mediante el análisis de serie de la sección El mejor medio para evaluar las tasas de éxito de las inyecciones es de serie-el corte embriones inyectados y el uso de inmunohistoquímica para visualizar las células marcadas. En estas condiciones, los tiempos de incubación puede ser tan corto como 4 horas después de la inyección. Los embriones son fijados y procesados ​​para la sección de parafina (o muestras criostáticas). Montado de vidrio secciones se de-paraffinized e inmuno-tinción para visualizar el reportero. Métodos de amplificación tales como biotina-estreptavidina que sería deseable. Finalmente, los cortes seriados se analizan para detectar células marcadas en los segmentos inyectados. Si después de varios ensayos iniciales en vez de células individuales se obtienen, las acciones plásmido debe ser diluido y el proceso se repite hasta que los resultados se logran adecuadas. De dos a 10 diluciones de la solución del plásmido puede ser necesario en los casos de las tasas de éxito son demasiado altos. Para cada plásmido se transfectadas, una calibración completa que asegura clonalidad se debe repetir. 5. Resultados representante Por lo general llevar a cabo una sola inyección de pCAGG-GFP por somite, mientras que 12.6 por dirigirse a segmentos de embriones 1 2. Bajo este contexto, una clara señal puede ser detectada por la observación todo el montaje 8 horas de la inyección, en al menos un segmento de un embrión de cada diez. En estas condiciones, el etiquetado se confirmó que se clonal (Figura 1 B, C). Cuando se utilizan altas concentraciones de ADN, la mayoría de los embriones pueden presentar al menos una inyección de éxito, aumentando la posibilidad de que varias celdas han sido transfectadas. Análisis de la sección de serie reveló que transfecciones clonal se alcanza cuando la tasa de éxito fue del 10%. Esto significa que a fin de lograr clonalidad, la técnica es por definición, altamente ineficiente. Por otro lado, en estas condiciones, más del 93% de los eventos etiquetado positivo se encontró que una clonal. <img src="/files/ftp_upload/2133/2133fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Inyecciones clonal de pCAGGS-GFP en células progenitoras neurales y esquelético. (AC) que muestra las secciones transversales de etiquetado de la dorsal del tubo neural (NT) (A), el dominio ventrolateral de la dermomiotoma (DM) (B), o una hoja de DM central (C) , 6 h después de la microinyección de pCAGGS-GFP con un solo progenitor. (D) Dos días después de la transfección de clones de la central de progenitores DM, solo genera derivados, tanto en la dermis (D), así como el músculo (M) (ver ref. 1 para más detalles).

<ol><li>Ben-Yair, R., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+analysis+of+the+avian+dermomyotome+sheet+reveals+the+existence+of+single+cells+with+both+dermal+and+muscle+progenitor+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Lineage analysis of the avian dermomyotome sheet reveals the existence of single cells with both dermal and muscle progenitor fates.</a> Development. 132, 689-701 (2005).</li>
<li>Ben-Yair, R., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+and+bone+morphogenetic+protein+differentially+act+on+dermomyotome+cells+to+generate+endothelium%2C+smooth%2C+and+striated+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Notch and bone morphogenetic protein differentially act on dermomyotome cells to generate endothelium, smooth, and striated muscle.</a> J Cell Biol. 180, 607-618 (2008).</li>
<li>Cinnamon, Y., Kahane, N., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+early+development+of+specific+hypaxial+muscles+from+the+ventrolateral+myotome.+%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Characterization of the early development of specific hypaxial muscles from the ventrolateral myotome. </a> Development. 126, 4305-4315 (1999).</li>
<li>Stark, D. A., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+green+fluorescent+protein+as+a+single-cell+marker+in+living+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable green fluorescent protein as a single-cell marker in living embryos.</a> Dev Dyn. 233, 983-992 (2005).</li>
<li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo--from+single+cells+to+the+entire+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70, 148-154 (2002).</li>
<li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li>
<li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li>
<li>Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+integration+and+conditional+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Dev Biol. 305, 616-624 (2007).</li>
</ol>

El método descrito anteriormente es una modificación de una técnica descrita anteriormente para la entrega de colorantes lipofílicos a los subconjuntos de células pequeñas o progenitores solo 3. Tiene tres ventajas principales sobre la técnica de electroporación estándar. En primer lugar, proporciona un medio para el etiquetado de los sitios de confianza discreto en los tejidos, lo que permite una resolución mucho mayor espacio que la electroporación (véase, por ejemplo, la figura 1B, C). En segundo lugar, pe...

<table><tbody><tr><td>Tubos para pipeta</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>Capilares</td><td>Drummond Scientific</td><td>2-000-100</td><td></td></tr><tr><td>Agujas para insectos</td><td>Watkins Doncaster</td><td>E6871</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Pen-Strep</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr></tbody></table>

transfección de células individuales en embriones de pollo

Single Cell Transfection in Chick Embryos

Un tema central en la biología del desarrollo es la diversificación de los linajes y la elucidación de los mecanismos subyacentes molecular. Esto implica un análisis exhaustivo de los destinos de las células individuales, en condiciones normales y experimentales. Con este fin, los métodos de transfección que se dirigen a los progenitores solo son un requisito previo. Se describe aquí un método técnicamente sencillo para la transfección de células individuales en los tejidos de pollo in ovo, lo que permite el rastreo fiable linaje, así como la manipulación genética. Dominios específicos de tejido son orientadas dentro de los somitas o del tubo neural, y el ADN se inyecta directamente en el epitelio de interés, lo que resulta en la transfección de células individuales esporádicos. Utilizando a los periodistas, poblaciones clonales en consecuencia, puede ser rastreado hasta por tres días, y el comportamiento de manipulados genéticamente poblaciones clonales se puede comparar con la de los controles. Este método tiene la ventaja de la accesibilidad del embrión de pollo, junto con nuevas herramientas para la manipulación genética. Comparar y discutir sus ventajas sobre el método de electroporación utilizadas, y las posibles aplicaciones y su uso en otros modelos in vivo también se proponen. Abogamos por el uso de este método como un complemento importante y se complementan para el linaje actual trazado y herramientas genéticas interferencia.

Usando la punta fina micropipetas se inyecta el plásmido de ADN en subdominios de somitas pollo o tubos neurales. La concentración del plásmido se ajusta a generar solo las células transfectadas. A continuación, permitir que las células se desarrollan en poblaciones clonales.

Transfección de células individuales en embriones de pollo

Un tema central en la biología del desarrollo es la diversificación de los linajes y la elucidación de los mecanismos moleculares subyacentes. Esto implica un...

El objetivo general de este procedimiento es inyectar células individuales de somitas o tubos neurales con un plásmido que codifica la proteína verde fluorescente. Esto se logra primero estirando pipetas de microinyección con un diámetro adecuado de abertura en la punta. El segundo paso del procedimiento consiste en preparar un stock de plásmido para las inyecciones.El tercer paso del procedimiento consiste en preparar los embriones para la inyección. El cuarto paso del procedimiento consiste en cargar las micropipetas con ADN plasmídico. El paso final del procedimiento consiste en inyectar los tejidos deseados.Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran el rango de derivados en cuanto al número de células producidas por progenitores individuales marcados en subdominios seleccionados del somito y del tubo neural mediante microscopía de inmunofluorescencia. Hola, soy Rael del Laboratorio de la Profesora Heim en el Departamento de Neurobiología Médica de la Universidad Hebrea de Jerusalén. Hoy les mostraremos un procedimiento para inyectar células individuales de los somitos y tubos neurales de pollo.Utilizamos este procedimiento en el laboratorio para estudiar la segregaci

single-cell-transfection-in-chick-embryos

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

De pollo en la electroporación in ovo es una técnica que permite la manipulación genética del embrión aviar. Las aplicaciones más comunes de esta técnica incluyen el análisis funcional de los genes y la posible potenciador de los elementos. Este video muestra la electroporación del tubo neural en embriones de pollo HH 10. Técnica de inyección y la adecuada manipulación de los huevos se discuten.

En Electroporations Ovo de embriones de pollo HH Etapa 10

En este trabajo se presenta un método para el trasplante de células madre humanas en varias regiones del sistema nervioso central del embrión de pollo. Esto proporciona...

Xenotrasplante de células madre humanas en el embrión de pollo

El objetivo general de este video es mostrar cómo llevar a cabo la inyección específica de retina...

En electroporación in ovo en la retina de embriones de pollo

Para evaluar la función y la regulación de los genes durante el desarrollo de las neuronas del cerebro medio dopaminérgico, se describe un método que consiste...

En electroporación in ovo en el mesencéfalo polluelo para estudiar la función génica en el desarrollo neuronal dopaminérgica

La expresión ectópica es una técnica para dilucidar el papel microRNAs en el desarrollo del cerebro. Sin embargo, la focalización en áreas específicas mediante electroporación in ovo es un reto. Aquí, se muestra una forma eficiente a las regiones del cerebro medio ventral y dorsal selectiva electroporar.

En Expression in ovo de microARN en ventral del polluelo Midbrain

Cultivos de células de la retina de embriones de pollo constituyen herramientas valiosas para el estudio de la biología de los fotorreceptores. Hemos desarrollado una técnica de transferencia de genes eficiente, basado en ex ovo plásmido electroporación de las retinas antes del cultivo. Esta técnica aumenta considerablemente la eficiencia de transfección a través de protocolos disponibles en la actualidad, lo que hace posible la manipulación genética para este sistema.

Transferencia génica eficaz en polluelo retinas para estudios de cultivo celular primario: Un Ex-ovo Enfoque electroporación

Describimos los métodos de etiquetado fluorescente tangencial migrar las células por electroporación y para Time-lapse de imágenes del movimiento celular marcada en una cultura de plano-montaje para visualizar migración celular comportamiento en El tectum óptico de chick en desarrollo .

Visualización de la migración celular tangencial en el Tectum óptico de Chick en desarrollo

Hemos desarrollado un nuevo enfoque de pérdida de función que implica la introducción e integración genómica de secuencias artificiales de micro-ARN en embriones de pollo mediante el uso de electroporación in ovo y el sistema de transposones Tol2. Esta técnica proporciona una metodología de eliminación de genes robusta y estable para estudios de la función de los genes durante el desarrollo.

Enfoque de pérdida de función en la retina embrionaria de pollo mediante el uso de la expresión transgénica mediada por transposones Tol2 de microARN artificiales

El objetivo general de este artículo es describir cómo realizar la inyección intracelular ovo de materiales exógenos en embriones de pollo. Este enfoque es muy útil para estudiar la biología del desarrollo de los embriones de pollo.

En Ovo Inyección intravascular en embriones de pollo

El pollito es un organismo modelo rentable, accesible y ampliamente disponible para una variedad de estudios. Aquí, se detalla una serie de protocolos para comprender los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo y la regeneración del oído interno aviar.

Métodos In Ovo y Ex Ovo para estudiar el desarrollo del oído interno aviar

Aprende a realizar transfección de células individuales en embriones de pollo mediante microinyección de ADN plasmídico. Este método permite generar poblaciones clonales expresando proteína verde fluorescente para estudiar función génica.

Transfección de células individuales en embriones de pollo

Explorar más videos