Name: Electroeluting fragmentos de ADN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Aprende a purificar fragmentos de ADN mediante electroelución con alta eficiencia de hasta el 80%. Este método económico permite recuperar muestras de diversos tamaños para clonación y secuenciación.

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El trabajo en laboratorio, el Dr. Bermúdez ha sido financiado por Conacyt (Grant # 82622). Damos las gracias a Gabriela Gutiérrez Sosa, Eliuth Reyes-Martínez y Ximena Rodríguez-Torres para grabar el vídeo del procedimiento electroleution.

<ol><li> Para la selección de fragmentos de ADN de interés para ser purificados, estos deben ser resueltos en geles de agarosa o acrilamida gel teñido con bromuro de etidio por electroforesis en buffer TBE 0.5X (Tris borato, EDTA) a 120 voltios durante 1 hora. Para ello, unos 700 ng de plásmido pProEx-GdMre11S (6000-pb) previamente digerido con NdeI y HindIII fue utilizada para liberar un fragmento de 900 pb (560 ng de plásmido y 84 ng del fragmento). </li><li> El tanque de electroeluter (Figura 1) debe ser llenado con TBE 0.5X distribuye por igual en cada lado de la meseta a mediados cuidando de no derramar en la meseta intermedia. </li><li> La banda seleccionada (o bandas) es cortada del gel, y se coloca en la cámara de muestras lo más cerca posible al canal V (una rebanada por pozo). Funcionamiento de amortiguación se debe agregar a cada grupo; lo suficiente para cubrir la porción de gel. </li><li> Cada canal V utilizados deben ser eliminados con una pipeta Pasteur para eliminar cualquier burbuja de aire atrapada. </li><li> De 100 ul de 10 M NH 4 acetato (para facilitar la visualización de una pequeña cantidad de azul de bromofenol se añade, justo lo suficiente para que el color) se añadió con suavidad dentro del canal V. </li><li> La tapa deberá estar cerrada con cuidado para evitar la resuspensión del colchón de sal. </li><li> Electroelución se inicia a 100 voltios durante 25 minutos. </li><li> Cuando se haya completado electrolution, 400 ul se retiran de V-canal, y se coloca en un tubo de microcentrífuga que se precipitó con 2 volúmenes de etanol frío y el glucógeno (recomendado para mejorar la recuperación de ADN) a 4 ° C durante 1 hora o toda la noche. </li><li> Centrifugar durante 20 minutos, retirar el sobrenadante y lavar con etanol al 70%. </li><li> Tubo seco y cuantificar el ADN a OD 260 nm. </li><li> La recuperación obtenida fue del 75% (63 ng recuperado 84 ng cuando fueron colocados en la V-canal). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2136/2136fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagrama Electroeluter. Anod un cátodo se indican en cada lado del tanque, el ADN contenido en gel en rodajas (ilustrado como un cuadrado negro) migrarán hacia el cátodo, debido a su carga negativa. Entonces será atrapado en el cojín de la sal (representado como un triángulo negro invertido), ubicado en la V-canal.

<ol><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 3 Volume Set (1989).</li>
</ol>

La duración de la ejecución dependerá en gran medida del tamaño de los fragmentos, por lo general de los fragmentos de hasta 20 kb 50 minutos a 1 hora es suficiente, mientras que para los pequeños fragmentos de luz UV monitoreo cada 10 minutos se requiere para evitar que el fragmento que pasar por el sal colchón y por lo tanto a la cámara de amortiguación anódica disminuye la recuperación. Es importante asegurarse de que cuando se establece el suministro de energía a 100 voltios, hay una mAmp actual por lo menos de 10. La banda de ADN se puede controlar mediante el uso de una lámpara UV-mano y detectar cuando este abandona el corte de gel. La sal de colchón también se puede hacer con 3 M de acetato de sodio. Este procedimiento permite la purificación de ADN o ARN fragmentos de diferentes tamaños con una buena recuperación (80%) para ser radiomarcados, digeridos por las enzimas de restricción, procesados ​​por enzimas modificando, etc

<table><tbody><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111L</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104L</td><td></td></tr><tr><td>acetato de NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>JT Baker</td><td>0596</td><td></td></tr><tr><td>agarosa</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>biotofotómetro</td><td>Eppendorf</td><td>6131 000 020</td><td></td></tr><tr><td>Electr&amp;#8211;luter</td><td>IBI</td><td>UEA CAT 46000</td><td></td></tr></tbody></table>

electroeluting fragmentos de adn

Electroeluting DNA Fragments

Purificada fragmentos de ADN se utilizan para diferentes propósitos en la biología molecular y pueden ser preparados por varios procedimientos. La mayoría de ellos requieren una electroforesis previa de los fragmentos de ADN a fin de separar la banda de interés. Entonces, esta banda se extirpa a cabo a partir de un gel de agarosa o de acrilamida y se purifica mediante el uso de cualquiera: unión y la elución de las partículas de vidrio o sílice, las membranas de DEAE-celulosa, &quot;aplastar y absorber el método&quot;, electroelución o muy a menudo costosos kits de purificación de comerciales. Por lo tanto, la selección de un método dependerá principalmente de lo que está disponible en el laboratorio. El procedimiento electroelución permite purificar el ADN muy limpio para ser utilizado en un gran número de aplicaciones (secuenciación, radiomarcado, la restricción enzimática, modificación enzimática, etc clonación). Este procedimiento consiste en la colocación de la banda de ADN que contienen rodajas de agarosa o de acrilamida en los pozos de la muestra de la electroeluter, vigente en ese momento la aplicación hará que el fragmento de ADN para salir de la agarosa y por lo tanto quedar atrapado en una sal de colchón para ser recuperada más tarde por la precipitación con etanol.

Este procedimiento permite la purificación de fragmentos de ADN con alto rendimiento.

Electroeluting fragmentos de ADN

Los fragmentos de ADN purificados se utilizan para diversos fines en biología molecular y pueden prepararse mediante diversos procedimientos. La mayoría de ellos requieren un...

Hola. Hoy les mostraremos cómo se realiza la electroelución con el fin de purificar fragmentos de ADN, como productos de digestión y de PCR. Para aplicaciones posteriores, como la clonación y la secuenciación, la electroelución puede ser uno de los métodos de elección. Basándose en la carga eléctrica negativa del ADN, se coloca una barrera impermeable dentro del campo eléctrico, lo que detiene los fragmentos e impide su migración adicional.Este método permite la purificación de una amplia variedad de tamaños de fragmentos de ADN procedentes de diferentes fuentes con una eficiencia relativamente alta de hasta el 80 %. Su bajo costo representa otra ventaja de la electroelución en comparación con otros métodos de purificación, como columnas, kits de resina, entre otros. Primero, la muestra de ADN se visualiza mediante electroforesis en gel de agarosa teñido con bromuro de etidio, con el fin de observar e identificar el fragmento deseado a purificar, y luego debe proseguirse con la electroforesis.Bajo fragmentos que están bien separados, se puede determinar con precisión los de tamaño inferior. Tras la electroforesis, el fragmento deseado se excava limpiamente del gel utilizando una cuchilla de afeitar nueva y teniendo cuidado de cortar la rebanada de gel lo más cerca posible de la banda de interés.Este procedimiento debe realizarse con la protección adecuada contra la luz UV y utilizando guantes. Después de llenar el electro-luter con el tampón de electroforesis adecuado y tener cuidado de verterlo sobre la superficie de la plataforma central, se coloca el trozo de gel dentro de una de las ruedas lo más cerca posible del canal en V. No debe haber burbujas dentro del canal en V.Esto puede evitarse lavando el canal con tampón para eliminar cualquier aire atrapado. Luego, se agregan cuidadosamente 100 microlitros de la barrera de alta salinidad al canal V desde el sitio próximo al pocillo. La cámara se cierra y los electrodos se conectan a la fuente de alimentación para iniciar la electroforesis a 100-120 voltios.El intervalo de tiempo dependerá del tamaño del fragmento en el caso de fragmentos grandes de hasta 20 kpb. Debería ser suficiente un tiempo de 50 minutos a una hora, y los fragmentos pequeños deben vigilarse cada 10 minutos con luz UV para evitar una mayor elución a través de la solución salina y hacia la cadena final de tampón. En este caso, digerimos 560 nanogramos de plásmido con las enzimas ND uno y entry para liberar un fragmento de 900 pares de bases, equivalente a 84 nanogramos de una muestra.Por consiguiente, tras colocar el trozo de gel dentro del pocillo, se realiza la electroelución durante 25 minutos a 100 voltios. Una vez finalizada la electroelución y que los fragmentos de ADN queden atrapados en la almohadilla sur dentro del canal en V, se recuperan 400 microlitros de solución desde el canal, desde el extremo distal del receptáculo, y se colocan en un microtubo de 1,5 microlitros utilizando una punta fina acoplada a un micropipeteador. A continuación, se procede a la precipitación alcohólica añadiendo dos volúmenes de etanol absoluto frío y mezclando mediante vortex. Adicionalmente, pueden añadirse de dos a tres microlitros de glucógeno para mejorar el rendimiento de recuperación de ADN. Incubar los tubos clásicos a menos 20 grados Celsius durante una hora o, alternativamente, almacenar a esta temperatura durante la noche. Centrifugar a cuatro grados Celsius a velocidad máxima durante 25 minutos.Este sobrenadante cardíaco y lavado mediante la adición de un mililitro de etanol frío al 70 %. Centrifugar a cuatro grados Celsius a velocidad máxima durante cinco a 10 minutos, desechar el sobrenadante y dejar secar a temperatura ambiente con los tubos en posición invertida, resuspender en 10 a 15 microlitros de agua libre de nucleasas y proceder a determinar la concentración de la muestra. En este caso, la muestra purificada se resuspendió en 10 microlitros de agua y se cuantificó en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 260 nanómetros, mostrando una concentración de 6,3 nanogramos por microlitro, lo que representa una eficiencia del 75 %. Es posible que esté pensando que sería mejor invertir solo 10 minutos de su valioso tiempo con un kit.Sin embargo, a pesar del tiempo consumido en este proceso, usted podrá controlar muchas de las variables que le permitirán purificar una gama más amplia de muestras con diferentes tamaños y orígenes naturales. Como pudo haber observado en el presente caso, se observó una eficiencia del 75 %, igual o superior a la mayoría de los kits de purificación de ADN. Gracias por acompañarnos hoy.Esperamos que este protocolo haya sido útil para sus proyectos de investigación.

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