Electroeluting fragmentos de ADN

Hola. Hoy les mostraremos cómo se realiza la electroelución con el fin de purificar fragmentos de ADN, como productos de digestión y de PCR. Para aplicaciones posteriores, como la clonación y la secuenciación, la electroelución puede ser uno de los métodos de elección. Basándose en la carga eléctrica negativa del ADN, se coloca una barrera impermeable dentro del campo eléctrico, lo que detiene los fragmentos e impide su migración adicional.

Este método permite la purificación de una amplia variedad de tamaños de fragmentos de ADN procedentes de diferentes fuentes con una eficiencia relativamente alta de hasta el 80 %. Su bajo costo representa otra ventaja de la electroelución en comparación con otros métodos de purificación, como columnas, kits de resina, entre otros. Primero, la muestra de ADN se visualiza mediante electroforesis en gel de agarosa teñido con bromuro de etidio, con el fin de observar e identificar el fragmento deseado a purificar, y luego debe proseguirse con la electroforesis.

Bajo fragmentos que están bien separados, se puede determinar con precisión los de tamaño inferior. Tras la electroforesis, el fragmento deseado se excava limpiamente del gel utilizando una cuchilla de afeitar nueva y teniendo cuidado de cortar la rebanada de gel lo más cerca posible de la banda de interés.

Este procedimiento debe realizarse con la protección adecuada contra la luz UV y utilizando guantes. Después de llenar el electro-luter con el tampón de electroforesis adecuado y tener cuidado de verterlo sobre la superficie de la plataforma central, se coloca el trozo de gel dentro de una de las ruedas lo más cerca posible del canal en V. No debe haber burbujas dentro del canal en V.

Esto puede evitarse lavando el canal con tampón para eliminar cualquier aire atrapado. Luego, se agregan cuidadosamente 100 microlitros de la barrera de alta salinidad al canal V desde el sitio próximo al pocillo. La cámara se cierra y los electrodos se conectan a la fuente de alimentación para iniciar la electroforesis a 100-120 voltios.

El intervalo de tiempo dependerá del tamaño del fragmento en el caso de fragmentos grandes de hasta 20 kpb. Debería ser suficiente un tiempo de 50 minutos a una hora, y los fragmentos pequeños deben vigilarse cada 10 minutos con luz UV para evitar una mayor elución a través de la solución salina y hacia la cadena final de tampón. En este caso, digerimos 560 nanogramos de plásmido con las enzimas ND uno y entry para liberar un fragmento de 900 pares de bases, equivalente a 84 nanogramos de una muestra.

Por consiguiente, tras colocar el trozo de gel dentro del pocillo, se realiza la electroelución durante 25 minutos a 100 voltios. Una vez finalizada la electroelución y que los fragmentos de ADN queden atrapados en la almohadilla sur dentro del canal en V, se recuperan 400 microlitros de solución desde el canal, desde el extremo distal del receptáculo, y se colocan en un microtubo de 1,5 microlitros utilizando una punta fina acoplada a un micropipeteador. A continuación, se procede a la precipitación alcohólica añadiendo dos volúmenes de etanol absoluto frío y mezclando mediante vortex. Adicionalmente, pueden añadirse de dos a tres microlitros de glucógeno para mejorar el rendimiento de recuperación de ADN. Incubar los tubos clásicos a menos 20 grados Celsius durante una hora o, alternativamente, almacenar a esta temperatura durante la noche. Centrifugar a cuatro grados Celsius a velocidad máxima durante 25 minutos.

Este sobrenadante cardíaco y lavado mediante la adición de un mililitro de etanol frío al 70 %. Centrifugar a cuatro grados Celsius a velocidad máxima durante cinco a 10 minutos, desechar el sobrenadante y dejar secar a temperatura ambiente con los tubos en posición invertida, resuspender en 10 a 15 microlitros de agua libre de nucleasas y proceder a determinar la concentración de la muestra. En este caso, la muestra purificada se resuspendió en 10 microlitros de agua y se cuantificó en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 260 nanómetros, mostrando una concentración de 6,3 nanogramos por microlitro, lo que representa una eficiencia del 75 %. Es posible que esté pensando que sería mejor invertir solo 10 minutos de su valioso tiempo con un kit.

Sin embargo, a pesar del tiempo consumido en este proceso, usted podrá controlar muchas de las variables que le permitirán purificar una gama más amplia de muestras con diferentes tamaños y orígenes naturales. Como pudo haber observado en el presente caso, se observó una eficiencia del 75 %, igual o superior a la mayoría de los kits de purificación de ADN. Gracias por acompañarnos hoy.

Esperamos que este protocolo haya sido útil para sus proyectos de investigación.