Electroeluting fragmentos de ADN

Hi.Today le mostraremos cómo se realiza la electrolución para purificar fragmentos de ADN, como los productos de digestión y PCR. Para otros fines, como la clonación y la secuenciación, la electrolución puede ser uno de los métodos de elección. Sobre la base de la carga eléctrica negativa del ADN, se coloca una barrera celular alta dentro del campo eléctrico, dejando caer los fragmentos e impidiendo su posterior migración.

Este método permite la purificación de una amplia gama de tamaños de fragmentos de ADN de diferentes fuentes con una eficiencia relativamente alta de hasta el 80% de su bajo costo. Representan otra ventaja de la electro lución en comparación con otros métodos de purificación como columnas, kits de resina, entre otros. La muestra de ADN se visualiza primero mediante una electroforesis en gel Aris teñida con bromuro de tedio con el fin de visualizar e identificar el fragmento que se desea purificar, se debe proceder a la electroforesis.

Los fragmentos inferiores están bien separados, el tamaño insuficiente se puede determinar con precisión. Después de la electroforesis. El fragmento deseado se extrae cuidadosamente del gel con una cuchilla de afeitar nueva y teniendo cuidado de girar la rebanada de gel lo más cerca posible de la banda de interés.

Este procedimiento debe realizarse con la protección adecuada contra la luz ultravioleta y con guantes. Después de llenar el electrolutero con el tampón de combustión adecuado y tener cuidado de derramarlo sobre la superficie de la meseta media, la rodaja de gel se coloca dentro de una de las ruedas lo más cerca posible del canal V. No debe haber burbujas dentro del canal vch.

Esto se puede evitar enjuagando el canal con un tampón para eliminar el aire atrapado. Luego, se agregan cuidadosamente 100 microlitros de la alta barrera salina al canal V desde el sitio proximal al pozo. La cámara está cerrada y los electrodos conectados a la fuente de alimentación para comenzar la electro lución a 100 a 120 voltios.

El lapso de tiempo dependerá del tamaño del fragmento para fragmentos grandes de hasta 20 kbs. De 50 minutos a una hora debería ser suficiente y los fragmentos pequeños deben monitorearse cada 10 minutos con luz ultravioleta para evitar más elion a través de la solución salina y en la cadena tampón adulta final. En este caso, digerimos 560 nanogramos de plásmido con las enzimas ND one y entrada para liberar una base de 900 por fragmento, lo que equivale a 84 nanogramos de una muestra.

En consecuencia, después de colocar la rodaja de gel dentro del pocillo, la electrolución continuará durante 25 minutos a 100 voltios. Una vez que se completa la electro solución y los fragmentos de ADN quedan atrapados en el cojín sur dentro del canal V, se recuperan 400 microlitros de solución del canal, del lado distal del receptáculo y se colocan en un micro tubo de 1,5 microlitros utilizando una punta fina unida a un micro pozo, se procede a la precipitación de alcohol mediante la adición de dos volúmenes de etanol absoluto frío y se mezclan por vórtice. Además, se pueden agregar de dos a tres microlitros de glucógeno para mejorar el rendimiento de los tubos clásicos de recuperación de ADN a menos 20 grados centígrados durante una hora o, alternativamente, almacene a esta temperatura durante la noche la centrífuga a cuatro grados centígrados a máxima velocidad durante 25 minutos.

Este cardio sobrenadante y lavar mediante la adición de un mililitro de centrífuga fría, de etanol al 70% a cuatro grados centígrados a máxima velocidad durante cinco a 10 minutos, desechar el sobrenadante y dejar secar a temperatura ambiente con los tubos en posición invertida, las grasas gastadas en 10 a 15 microlitros de agua libre del núcleo y proceder a determinar la concentración de la muestra. En este caso, la muestra purificada se resuspendió en 10 microlitros de agua y se cuantificó en un espectrofotómetro a 260 nanómetros de longitud de onda mostrando una concentración de 6,3 nanogramos por microlitro, lo que representa una eficiencia del 75%. Es posible que pienses que sería mejor invertir solo 10 minutos de tu precioso tiempo con un kit.

Sin embargo, a pesar del tiempo consumido en este proceso, podrá controlar muchas de las variables que le permitirán purificar una gama más amplia de muestras que tienen en cuenta los tamaños y las fuentes de la naturaleza. Como se pudo haber visto en el presente caso, se observó una eficiencia del 75% igual o mejor que la mayoría de los kits de purificación de ADN. Gracias por acompañarnos hoy.

Esperamos que este protocolo te haya resultado útil para tus proyectos de investigación.