El análisis directo de las células individuales mediante espectrometría de masas a presión atmosférica

El objetivo general del siguiente experimento consiste en expulsar el contenido de una sola célula viva e ionizar las biomoléculas liberadas para su análisis mediante un espectrómetro de masas a presión atmosférica. Esto se logra seleccionando una única célula mediante un microscopio de larga distancia y ablacionando la célula seleccionada con un pulso láser de longitud de onda de 2,94 micrómetros, entregado a través de una fibra óptica afilada. La ablación de una sola célula dará lugar a la formación de una pluma microscópica de material particulado neutro para ionizar la pluma de ablación.

Es interceptado por una electroaspersión. Las gotas cargadas de la aspersión se fusionan con las partículas del penacho de ablación originado a partir de la célula. Las gotas resultantes están sembradas con las moléculas de la célula y producen los iones correspondientes.

Se obtienen resultados que muestran un espectro de masas de una sola célula. El espectro contiene numerosos picos relacionados con los metabolitos y lípidos de la célula. Hola, soy el Dr. Bin Drester del Laboratorio Verese en el Departamento de Química de la Universidad George Washington.

Hoy les mostraremos el procedimiento para el análisis directo de células vivas individuales mediante espectrometría de masas a presión atmosférica. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar metabolitos y lípidos de células individuales de plantas y animales. Así que comencemos.

La ablación láser para ablación láser, ionización por electroaspersión, espectrometría de masas o MS perezosa se produce mediante un pulso láser de cinco nanosegundos a una longitud de onda de 2,94 micrómetros. Un oscilador óptico paramétrico sintonizable, impulsado por un láser de neodimio YAG, se utiliza para la ablación en este estudio.

Para comenzar, monte el extremo grabado de una fibra óptica en un micromanipulador y acérquelo a la superficie celular. Para una deposición eficiente de energía, sostenga el extremo no grabado de la fibra óptica mediante un portamuestras para fibra desnuda para alinearla ópticamente. El portamuestras para fibra está montado en un traductor de cinco ejes.

Acople la energía del láser a la fibra enfocando el haz mediante una lente plano-convexa de fluoruro de calcio o de seleniuro de zinc recubierta antirreflejante en su extremo no grabado; utilice espejos de oro protegidos para dirigir el haz de láser infrarrojo medio hacia la lente de enfoque. Para mantener la distancia entre la punta afilada de la fibra y la superficie celular, use un microscopio de video de larga distancia montado en un ángulo de 15 a 30 grados medido desde la superficie. Este sistema también consta de una lente objetiva corregida al infinito de cinco aumentos equipada con una cámara CCD para monitoreo y captura de imágenes.

Un segundo microscopio de vídeo está montado en ángulo recto respecto a la superficie de la muestra para visualizar las células desde arriba y seleccionarlas para su análisis. Este sistema proporciona retroalimentación visual para alinear la punta de la fibra sobre la célula seleccionada para ablación y análisis. Consiste en un objetivo de zoom de precisión siete veces con un objetivo de distancia de trabajo larga corregido para infinito de 10 aumentos y una cámara CCD.

El sistema de electroaspersión se construyó utilizando una unión metálica con perfluoro conductor, elastómero, accesorios ferales, tubos, puerto de aguja con manguito, así como tubo de sílice FU. El emisor recomendado está hecho de acero inoxidable y tiene una punta cónica con un diámetro de 50 micrómetros; prepare una solución de metanol al 50 % con ácido acético al 0,1 %. Introduzca la solución a una velocidad de 200 a 300 nanolitros por minuto mediante una bomba de jeringa.

Utilizando una jeringa de 500 microlitros, se aplicará un alto voltaje entre 2, 803, 000 voltios a la unión metálica mediante una fuente de alimentación regulada. Para generar un electroensayo estable, asegúrese de que todas las conexiones eléctricas estén seguras y protegidas con el blindaje, conectadas adecuadamente a tierra, ya que el contacto directo con alto voltaje expuesto puede provocar descargas eléctricas. Obtenga la muestra de tejido o células vivas de una fuente adecuada y manténgalas según las recomendaciones antes del análisis.

Los bulbos de cebolla para esta demostración se compraron en una tienda local para la preparación de la muestra de bulbo de cebolla. Corte longitudinalmente el bulbo con un escalpelo quirúrgico, tomando una sección de aproximadamente dos centímetros cuadrados del tejido escamoso de un bulbo de cebolla. Luego, desprenda una monocapa intacta del tejido epidermal interno. Utilice la superficie húmeda del epitelio para montar el tejido sobre un portaobjetos de vidrio previamente limpio.

Sostenga el portaobjetos mediante un soporte de placa de uso general, montado en una etapa de traslación de tres ejes para el posicionamiento. Inmediatamente después de montar la muestra, adquiera los espectros de masas para evitar la degradación celular. Comience encendiendo el láser, la fuente de electroaspersión y el espectrómetro de masas.

Optimice la geometría de la fuente de iones mediante el ajuste de la posición del punto de ablación y del emisor de electroaspersión entre sí y respecto a la abertura del espectrómetro de masas. Para lograr la máxima intensidad de iones, seleccione la célula de interés para el análisis utilizando el sistema de visualización en vista superior. Tras la selección, mueva la platina de la muestra para colocar la célula seleccionada directamente debajo de la punta afilada de la fibra óptica.

Utilizando el microscopio de vista lateral, ajuste nuevamente la distancia entre la punta y la superficie celular a aproximadamente 20 micrones. Una vez en la posición correcta, aplique pulsos láser en la célula seleccionada a través de la punta de fibra grabada. Esto provoca la perforación de la pared celular y la expulsión del citoplasma en forma de material particulado.

Tras la ionización posterior mediante el chorro electrostático, los iones producidos son recolectados por el espectrómetro de masas y se registran los espectros de masas. Después de la adquisición de datos, coloque el láser, el chorro electrostático y el espectrómetro de masas en modo de espera o apáguelos. Mantenga la muestra de tejido de *Allium cepa* ablacionada para una posible observación mediante microscopía óptica; la ablación exitosa de una sola célula resulta en la ruptura de la pared celular y la recolección de un espectro de masas débil.

A continuación se muestran los resultados del análisis MS perezoso de una única célula epidérmica incluida en un bulbo de Allium SEPA, que muestra una imagen representativa de microscopía óptica. Tras el muestreo de una célula, se perfora la pared celular y el grado de perforación queda limitado por los límites con las células vecinas. Las células adyacentes parecen estar intactas.

Aquí se muestra un espectro de masas lazy representativo obtenido a partir de la célula. Se detecta una amplia variedad de iones procedentes del allium sea por célula, y en función de sus masas exactas, los patrones de distribución de isótopos y los espectros de masas en tándem, los iones se asignan cuidadosamente a metabolitos endógenos. Los iones detectados a partir de una sola célula fueron similares a los observados en el análisis del mismo tejido mediante espectrometría de masas lazy convencional de múltiples células.

Acabamos de mostrarle cómo analizar células vitales individuales mediante espectrometría de masas a presión atmosférica. Al realizar este procedimiento, es importante recordar usar protección ocular para evitar exposiciones accidentales a láseres infrarrojos de clase cuatro. Eso es todo.

Gracias por ver el video y buena suerte con sus experimentos.