El análisis directo de las células individuales mediante espectrometría de masas a presión atmosférica

El objetivo general del siguiente experimento es expulsar el contenido de una sola célula viva e ionizar las biomoléculas liberadas para su análisis por un espectrómetro de masas a presión atmosférica. Esto se logra seleccionando una sola célula a través de un microscopio de larga distancia y ablando la célula seleccionada mediante un pulso láser de 2.94 micrometros de longitud de onda entregado a través de una fibra óptica afilada. La ablación de una sola célula resultará en la formación de un penacho microscópico de partículas neutras para ionizar el penacho de ablación.

Es interceptado por un electro spray. Las gotas cargadas del aerosol se fusionan con las partículas del penacho de ablación originado en la célula. Las gotas resultantes están sembradas con las moléculas de la célula y producen los iones relacionados.

Se obtienen resultados que muestran un espectro de masas de una sola célula. El espectro contiene numerosos picos relacionados con los metabolitos y lípidos de la célula. Hola, soy el Dr. Bin Drester del Laboratorio Verese en el Departamento de Química de la Universidad George Washington.

Hoy les mostraremos el procedimiento para el análisis directo de células vivas individuales mediante espectrometría de masas a presión atmosférica. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar metabolitos y lípidos de células únicas de plantas y animales. Así que empecemos.

La ablación láser para ablación láser, ionización por electro spray, espectrometría de masas, o MS perezoso, se produce mediante un pulso láser de cinco nanosegundos a una longitud de onda de 2.94 micrometros. Óptico ajustable. Un oscilador paramétrico óptico impulsado por un láser de neodimio YAG se utiliza para la ablación en este estudio.

Para comenzar, monte el extremo grabado de una fibra óptica en un manipulador micrométrico y acérquelo a la superficie de la célula. Para una deposición eficiente de energía, sostenga el extremo no grabado de una fibra óptica con un manguito de fibra desnuda para la alineación óptica. El manguito de fibra está montado en un traductor de cinco ejes.

Acople la energía del láser en la fibra enfocando el haz con un lente plano convexo de calcio, fluoruro o zinc selenuro recubierto de antirreflejo en su extremo no grabado. Utilice espejos de oro protegidos para dirigir el haz láser de medio infrarrojo hacia el lente de enfoque. Para mantener la distancia entre la punta afilada de la fibra y la superficie celular, utilice un microscopio de video de larga distancia montado en un ángulo de 15 a 30 grados medido desde la superficie. Este sistema también consiste en un objetivo corregido infinito de cinco veces equipado con una cámara CCD para monitoreo y captura de imágenes.

Un segundo microscopio de video se monta en ángulo recto a la superficie de la muestra para visualizar las células desde la parte superior y seleccionarlas para su análisis. Este sistema proporciona retroalimentación visual para alinear la punta de la fibra sobre la célula seleccionada para la ablación y el análisis. Consiste en un optica de zoom de precisión de siete veces con un objetivo corregido infinito de distancia de trabajo larga de diez veces y una cámara CCD.

El sistema de electro spray se construyó utilizando una unión metálica con perfluoro conductivo, accesorios férreos de elastómero, tubos, puerto de aguja de manga, así como tubos de sílice FU. El emisor recomendado es de acero inoxidable y tiene una punta cónica con un diámetro de 50 micrometros. Prepare una solución de metanol al 50% con 0.1% de ácido acético para el electro spray. Bombee la solución a una velocidad de 200 a 300 nanolitaros por minuto mediante una bomba de jeringa.

Utilizando una jeringa de 500 microlitros, se aplicará un alto voltaje entre 2,803,000 voltios a la unión metálica mediante una fuente de alimentación regulada. Para generar un electro spray constante, asegúrese de que todas las conexiones eléctricas estén aseguradas y protegidas con blindaje, debidamente conectado a tierra, ya que el contacto directo con alta tensión expuesta puede provocar descargas eléctricas. Obtenga la muestra de tejido o célula viva de una fuente apropiada y manténgala según se recomienda antes del análisis.

Los bulbos de allium seper para esta demostración fueron comprados en una tienda local para la preparación de muestras de bulbos de allium seper, corte longitudinalmente con un bisturí quirúrgico una sección de aproximadamente dos centímetros cuadrados de la escama de un bulbo de cebolla. Luego, retire una monocapa intacta del tejido epidérmico interno. Utilice la superficie húmeda de la epidermis para montar el tejido en un microscopio de vidrio prelimpio.Diapositiva.

Sostenga la diapositiva con un portaobjetos de propósito general, montado en una etapa de traslación de tres ejes para posicionamiento. Inmediatamente después de montar la muestra, adquiera los espectros de masa para evitar la degradación celular. Comience encendiendo el láser, el electro spray y el espectrómetro de masas.

Optimice la geometría de la fuente de iones perezosa ajustando la posición del punto de ablación y el emisor de electro spray entre sí y el orificio del espectrómetro de masas. Para lograr la máxima intensidad de iones, seleccione la célula de interés para su análisis utilizando el sistema de visualización de vista superior. Después de la selección, mueva la etapa de la muestra para traer la célula seleccionada directamente debajo de la punta afilada de la fibra óptica.

Con el microscopio de vista lateral, reajuste la distancia entre la punta y la superficie celular a aproximadamente 20 micrometros. Una vez en la posición correcta a través de pulsos láser en la célula seleccionada a través de la punta de fibra grabada. Esto resulta en la perforación de la pared celular y la expulsión del citoplasma en forma de partículas.

Después de la post ionización por el electro spray, los iones producidos son recogidos por el espectrómetro de masas y se registran los espectros de masa. Después de la solicitud de datos, ponga el láser, el electro spray y el espectrómetro de masas en modo de espera o apáguelos. Mantenga la muestra de tejido allium cper ablada para la observación opcional por microscopía óptica, la ablación exitosa de una sola célula da como resultado la ruptura de la pared celular y la recolección de un espectro de masa perezoso.

Aquí están los resultados del análisis MS perezoso de una sola célula epidérmica incrustada de un bulbo de allium SEPA que muestra una imagen de microscopía óptica representativa. Después de la muestra de una célula, la pared celular se perfora y el alcance de la perforación está limitado por los límites con las células vecinas. Las células adyacentes parecen estar intactas.

Aquí se muestra un espectro de masa perezoso representativo producido a partir de la célula. Se detectan una amplia variedad de iones del allium sea per célula y, en función de sus masas precisas, patrones de distribución isotópica y espectros de masa en tándem, los iones se asignan atentamente a metabolitos endógenos. Los iones detectados de una sola célula eran similares a los observados en el análisis del mismo tejido mediante MS perezoso convencional de múltiples células.

Acabamos de mostrar cómo analizar células vivas individuales mediante espectrometría de masas a presión atmosférica. Al realizar este procedimiento, es importante recordar usar gafas de protección para evitar la exposición accidental a láseres infrarrojos de clase cuatro. Eso es todo.

Gracias por ver y buena suerte con tus experimentos.