Name: Imágenes de interacciones proteína-proteína In vivo /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Aprende a evaluar interacciones proteína-proteína en células endoteliales mediante ensayo de proximidad basado en FRET. Este método permite visualizar dinámicas de receptores durante la angiogénesis con microscopía confocal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deseamos agradecer a la Dra. Scott Henderson en busca de ayuda con la microscopía confocal. Esta investigación fue financiada por becas de los Institutos Nacionales de Salud 1RO1CA127501 de WAB, así como la financiación del proyecto piloto del Centro de Cáncer de Massey y la Facultad de Medicina (UCV) de Microscopía WAB se llevó a cabo en la UCV-Dept. de Neurobiología y Anatomía Servicio de Microscopía, apoyada, en parte, con fondos del Centro de NIHNINDS núcleo conceder 5P30NS047463.

El protocolo consta de tres pasos principales. La primera clonación, los pasos de su gen de interés en un vector de expresión de mamíferos amino-terminal de las versiones de monómero de la PPC y / o YFP sólo se discutirán brevemente. Los pasos segundo y tercero, la transfección de ADN vector en EA.hy926 las células endoteliales, y la imagen confocal con FRET, se describen con más detalle a continuación. 1. La construcción de los receptores PPC y YFP quiméricos Receptores de interés debe ser clonado amino-terminal de monómero versiones mejoradas de la PPC y YFP. Determinación de FRET es empírica y depende fundamentalmente de la longitud del enlazador entre la transmembrana que abarca la región y el inicio de la fluoróforo 1. Por lo tanto, diferentes longitudes de enlazador debe ser explorado para cada par de receptores de nuevo bajo investigación. <ol><li> En la R pcDNA3.1 Hygro o neo vector R que contiene monómero C-o YFP (este vector se puede obtener de nuestro laboratorio), el clon de su receptor de interés en los sitios NheI / EcoRI. * Nota: Si es necesario, NheI es compatible varias enzimas incluyendo otros SpeI y XbaI. </li><li> Transforme su reacción de ligación en una adecuada línea de células endA1 Reca competente (nosotros usamos Mach1). Colonias de detectar la presencia de Insert seguida de la secuenciación del ADN para verificar la ausencia de las mutaciones. </li><li> Tras la obtención de la conformación de la clonación molecular éxito, preparar la transfección de grado vector de ADN en agua esterilizada o TE utilizando Qiagen, o kits similares, el ADN. Evaluar la concentración y la pureza utilizando espectrometría UV. Los rendimientos típicos de ADN debe estar en el rango de 100-200 mg, que es habitualmente diluida a una solución de trabajo de 1 mg / mL. </li></ol> 2. La transfección de células EA.hy 926 <ol><li> Dividir EA.hy 926 células 4, que se cultiva en total-DMEM (DMEM +10% de suero fetal bovino + pen. / Strep.) En MatTek cubreobjetos (N º 0) 35 mm platos con 2 ml de medio. Usted puede obtener de forma conservadora ~ 15 platos (~ 90% confluentes al día siguiente) de un plato de 15 cm confluente. Preparar un plato para evaluar la expresión de cada receptor individual, así como un plato para cada par de los receptores. </li><li> Permitir que las células se incuban durante la noche en el 5% atmósfera de CO 2 a 37 ° C. Al día siguiente, las culturas deben ser confluentes ~ 70-90%. </li><li> En el día de la transfección, preparar los complejos nucleolipid mediante la mezcla de 2 g de ADN de los receptores de vectores quiméricos (2 l) con 8 L de Fugene6 en 200 l de pre-calentado OptiMEM. Para los pares de receptores, transfectar con 1 g de cada receptor, para un total de 2 mg (ver también más adelante). </li><li> Mezclar suavemente por inversión. </li><li> Continuar a incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. </li><li> Durante el período de incubación, preparar las células para la transfección. Aspirar fuera de los medios de comunicación fresca y lave cada plato suave y brevemente con PBS caliente antes de la adición de 2 ml precalentado completa-DMEM sin antibióticos (DMEM + FBS). Es importante evitar la presencia de penicilina y estreptomicina, ya que son mucho más tóxicos para las células durante el tratamiento con Fugene6. </li><li> Añadir la caída complejo sabio a las células e incubar durante otros 20 a 24 horas a 37 ° C en un 5% de CO2 la atmósfera. </li><li> Después de 24 horas, con cuidado aspirar los medios de comunicación de las células y pipeta nueva completa-DMEM con antibióticos. Después de la transfección, la viabilidad celular se mantienen relativamente altos, es decir, poco o nada de las células flotantes deben ser observados. </li><li> La expresión de genes es por lo general después de un máximo adicional de 48-60 horas después de la transfección. Sin embargo, la imagen suele ser factible en tan corto como 24 horas. Experimentos de tiempo de los cursos de la expresión génica óptima debe ser realizada. </li></ol> 3. Imagen confocal y análisis de FRET En vivo de imágenes de células se realiza en una Leica TCS-SP2 microscopio láser confocal de barrido AOBS equipada con diodo azul (405 nm), argón (458, 476, 488, 514 nm). verde HeNe (543 nm), naranja HeNe (594 nm) y rojo HeNe (633 nm), un HCX PI Apo 63x/1.3 na glicerina lente objetivo de inmersión, una motorizada XY etapa (Märzhäuser), y un control del medio ambiente ( temperatura, humedad y CO 2) incubadora (PECON). Controles experimentales son fundamentales para eliminar fluoróforo diafonía entre los canales de emisión, así como para evaluar los problemas de expresión y no específicos multimerización fluoróforo. Como tal, transfecciones único fluoróforo se utilizan para la creación de cada sesión de imagen. FRET controles negativos (no interactúan con los receptores conocidos) tendrá que llevarse a cabo, con el fin de determinar el fondo, temen que se produce debido a la sobre-expresión. <ol><li> Para eliminar la diafonía entre los canales de emisión de la PPC y YFP, coloque el control de la expresión política pesquera común en la incubadora etapa. Con luz blanca, ajustar la placa Z-para centrarse ena las células. </li><li> Establecer la configuración de SP ventana para la detección de emisión de 465-505 nm para PPC y YFP a 525-600 nm. </li><li> Durante la supervisión de los dos canales de emisión, excitar la PPC a 458 nm. Utilizando el AOTF, ajustar la potencia de láser para eliminar el sangrado apreciable sobre la PPC en el canal de emisión de YFP. Guardar esta configuración. </li><li> Realizar el mismo control para YFP crosstalk (usando el control de la expresión YFP) en el canal de la PPC mediante el ajuste de la potencia de excitación a 514 nm de las células que expresan sólo YFP. Guardar esta configuración. </li><li> Celdas contiguas a cabo co-expresando PPC y YFP en la incubadora etapa. Uso de la secuencia de configuración para el software de Leica confocal, localizar las células que expresan niveles similares de la PPC y YFP con la localización de la membrana apropiada. </li><li> Utilizando el software Leica aceptor foto-blanqueamiento del programa, establecer la configuración de donante y el receptor de la PPC guardados y las configuraciones YFP, respetable. </li><li> Zoom de las células, resalte un ROI (región de interés) en el que la foto-destrucción de YFP se va a producir en la membrana celular y comenzar el programa. </li><li> Para la foto-destrucción del aceptante, ajustar el AOTF al 100% a 514 nm y permitir que el blanqueamiento con láser para continuar hasta el 70% de la emisión YFP se ha agotado. Para acelerar la decoloración, rendimiento de la inversión son por lo general elegido en el eje de la trama láser (eje X). </li><li> En la foto-blanqueamiento, vigilar el movimiento celular y rechazar las mediciones obtenidas con el movimiento apreciable en el plano XY, ya que estas medidas pueden reportar falsos FRET eficiencia. </li><li> Imágenes pre-y post-cloro-se registran para el donante (PPC) y aceptor (YFP) y FRET eficiencia se calcula como: FRET Ef = (D post-D pre) / D después de todos los mensajes D&gt; D donde D pre pre y D no está en la intensidad de los donantes antes y después de photobleaching respectivamente. </li><li> El software JMP (SAS) se utiliza para determinar el grado de variabilidad experimental. </li></ol> 4. Resultados representante Eficiencia de transfección son por lo general entre 30 a 40%. A pesar de los resultados anteriores por otros, no hemos visto que la transfección y la expresión de un vector a favor de la otra. De hecho, es frecuente observar la expresión exclusiva de un fluoróforo quimera o la otra. FRET eficiencia típica varían entre los sistemas de receptor. Para que el sistema receptor Tie, valores típicos son 20-28% de las células epiteliales y 19-23% en las células endoteliales. Para los controles negativos, las eficiencias típicas están por debajo de 2.3%. El grado de variabilidad se reducirá considerablemente con la experiencia. <img src="/files/ftp_upload/2149/2149fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Imágenes representativas de las células transfectadas EA.hy 926. A la imagen) DIC de monocapa celular EA.hy 926. B) Imagen de fluorescencia de células se muestra en (A). C) Superposición de (A) y (B) que demuestra la eficiencia ~ 20-30% de transfección. <img src="/files/ftp_upload/2149/2149fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Aceptor representante foto-blanqueamiento análisis de FRET se produce entre PPC y YFP en una celda de EA.hy926. El PPC de emisión del canal (paneles superiores) y YFP emisión de canales (dos paneles inferiores) se efectuará por separado antes y después de photobleaching aceptor. Photobleaching experimentos se limitaron a, y FRET valores calculados de la región dentro de la caja verde. FRET eficiencia se muestra como un rango absoluto de alta (rojo-1.0) a baja (púrpura-0.0) en una plantilla ampliada de un PPC / YFP fusión de imágenes con fines de orientación únicamente.

<ol><li>Kim, M., Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+transmembrane+signaling+by+cytoplasmic+domain+separation+in+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bidirectional transmembrane signaling by cytoplasmic domain separation in integrins.</a> Science. 301, 1720-1725 (2003).</li>
<li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+lipidmodified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Partitioning of lipidmodified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296, 913-916 (2002).</li>
<li>Seegar, T. C. M., Eller, B., Tzvetkova-Robev, D., Kolev, M., Henderson, S. C., Nikolov, D. B., Barton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tie1-Tie2+interactions+mediate+functional+differences+between+angiopoietin+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Tie1-Tie2 interactions mediate functional differences between angiopoietin ligands.</a> Molecular Cell. 37 (5), 643-655 (2010).</li>
<li>Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+cell+line+expressing+human+factor+VIII-related+antigen+established+by+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (12), 3734-3737 (1983).</li>
</ol>

Hay varios pasos que son críticos para el éxito. El más destacado entre ellos es el nivel relativo de expresión entre los dos receptores quiméricos. Para evitar este problema, uno puede hacer que las líneas celulares estables que expresan tanto las proteínas de interés, o identificar proporciones óptimas de vector de ADN para permitir la expresión equivalente. Del mismo modo, debido a la falta de uniformidad de la transfección a través de una antena, los niveles de proteína rara vez será equivalente entre las células. Por lo tanto, se debe prestar atención para distinguir &quot;alto&quot; expresores de &quot;baja&quot;. Los que los niveles &quot;promedio&quot; de visualización de proteínas por lo general el rendimiento fiable y reproducible FRET eficiencia. Uno de los métodos nuestro laboratorio ha llevado a cabo para aliviar este problema es el uso de adenovirus y los virus lenti-a la expresión génica &quot;, incluso&quot;. Además, un método alternativo para la foto-receptor de blanqueo para la determinación de la eficiencia de FRET es la emisión sensibilizada. Aunque, a pesar del potencial de la emisión de sensibilización para controlar las células individuales en tiempo real, hemos encontrado aceptor foto-blanqueamiento a ser más sensibles y más confiable. Por último, utilizando FRET para controlar las interacciones de proteínas puede ser difícil, y requiere de una cuidadosa selección de las longitudes enlazador para los receptores unidos a la membrana. Además, la adición de C / YFP a menudo una gran influencia en los niveles de expresión de la proteína y los resultados de la agregación en el retículo endoplasmático y el aparato de Golgi. Sin embargo, para las interacciones transitorias o inestable, FRET es la metodología ideal para utilizar.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960-069</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino fetal</td><td>Hyclone</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>FUGENE 6</td><td>Roche Group</td><td>11814443001</td><td></td></tr><tr><td>Placas con cubreobjetos</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G014C</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1(+)</td><td>Invitrogen</td><td>V790&amp;#8208;20</td><td></td></tr><tr><td>Células competentes Mach 1</td><td>Invitrogen</td><td>C862003</td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes de interacciones proteína-proteína in vivo</em

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Interacciones proteína-proteína son un sello distintivo de todos los procesos celulares esenciales. Sin embargo, muchas de estas interacciones son transitorios, o débil energía, la prevención de su identificación y el análisis a través de tradicionales métodos bioquímicos, como co-inmunoprecipitación. En este sentido, las proteínas fluorescentes genéticamente codificable (GFP, RFP, etc) y sus asociados se superponen espectro de fluorescencia han revolucionado nuestra capacidad de monitorear las interacciones débiles en vivo con la transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) 1-3. Aquí, le detallamos el uso de un ensayo de proximidad FRET para el monitoreo del receptor de los receptores de las interacciones en la superficie de las células endoteliales.

Este protocolo describe cómo la imagen de interacciones proteína-proteína mediante un ensayo basado en la proximidad FRET.

Imágenes de interacciones proteína-proteína In vivo</em

Las interacciones proteína-proteína son una característica distintiva de todos los procesos celulares esenciales. Sin embargo, muchas de estas interacciones son transitorias o energéticamente débiles, ...

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar la presencia de interacciones entre proteínas en la superficie celular. Esto se logra clonando dos receptores de interés, cada uno en el extremo amino terminal de dos fluoróforos que tienen espectros de emisión superpuestos, como segundo paso. Los dos vectores se transfectan simultáneamente en células endoteliales para lograr la expresión de los receptores.En este momento, los fluoróforos ayudan a evaluar el grado general de expresión, así como la localización del receptor. A continuación, se establecen los parámetros de imagen mediante una transfección individual como control en el microscopio confocal. Las células transfectadas individualmente se seleccionan según sus niveles relativos de expresión y localización del receptor.Posteriormente, se realizan imágenes de regiones dentro de estas células para evaluar el grado de resultados de FRET, que muestran interacciones de tie uno y tie dos en la superficie de la célula endotelial basadas en FRET y microscopía confocal. Hola, soy Tom Seger del laboratorio del Dr. William Barton del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad Estatal de Virginia.Hoy les mostraremos un procedimiento para evaluar interacciones entre proteínas en células endoteliales mediante microscopía confocal basada en FRET. En nuestro laboratorio, utilizamos esto para estudiar interacciones entre receptores durante la angiogénesis. Así que comencemos.Para obtener imágenes de interacciones entre proteínas mediante un ensayo de proximidad basado en FRET, comience clonando sus receptores de interés en los sitios NHE I y EcoR I del vector pcd, que contiene CFP o YFP monomérico, con resistencia a la hidro o neomicina. La determinación de FRET es empírica y depende críticamente de la longitud del enlazador entre la región transmembrana y el inicio del fluoróforo. Por lo tanto, deben explorarse varios enlazadores de distinta longitud para cada nuevo par de receptores bajo estudio. Transforme y amplifique los vectores según el protocolo adjunto.Luego prepare ADN de calidad para transfección, transforme y amplifique los vectores según el protocolo adjunto. A continuación, prepare ADN de calidad para transfección y dilúyalo a una concentración de trabajo de un microgramo por microlitro para preparar las células para la transfección bajo una campana de cultivo celular. Divida las células EAHY 92 6 crecidas en DMEM completo en placas de 35 milímetros con cubreobjetos, utilizando dos mililitros de medio. Prepare una placa para evaluar la expresión de cada receptor individual, así como una placa para cada par de receptores.Deje que las células incuben al día siguiente en una atmósfera con más del 95 % de dióxido de carbono a 37 grados Celsius. El cultivo debe tener una confluencia del 70 al 90 % el día de la transfección. Prepare complejos nucleolípidos mezclando dos microgramos del ADN del vector del receptor quimérico con ocho microlitros de Fuji N HD en 200 microlitros de Opti-MEM precalentado; para pares de receptores, transfecte con un microgramo de cada receptor, para un total de dos microgramos, mezclando suavemente por inversión e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.Durante el período de incubación, prepare las células para la transfección aspirando el medio fresco y lavando cada placa suave y brevemente con PBS tibio antes de añadir dos mililitros de DMEM completo precalentado sin antibióticos. Es importante evitar la presencia de penicilina y estreptomicina, ya que son considerablemente más tóxicas para las células durante el tratamiento con el gen FU HD. Añada el complejo gota a gota a las células e incube durante 20 a 24 horas adicionales. Después de 24 horas, aspire cuidadosamente el medio de las células y añada con pipeta DMEM completo fresco con antibióticos tras la transfección.La viabilidad celular debe mantenerse relativamente alta. Se deben observar pocas o ninguna célula flotante. Para realizar imágenes de células vivas, utilizamos un microscopio confocal de barrido láser A-T-C-S-P two A OBS equipado con láseres de argón azul y de helio-neón verdes, naranjas y rojos, un objetivo H-C-X-P-I-A-O 63 x 1.3 NA de inmersión en glicerina, una platina motorizada XY y un incubador de platina controlado en temperatura, humedad y dióxido de carbono.Los controles experimentales son cruciales para eliminar la interferencia entre canales de emisión de fluorocromos, así como para evaluar problemas de expresión y la fluoración no específica. Por ello, se utilizan transfecciones con un solo fluorocromo para configurar cada sesión de imagen, con el fin de eliminar la interferencia entre los canales de emisión de CFP y YFP. Coloque el control de expresión de CFP en el incubador del microscopio utilizando luz blanca.Ajuste la placa Z para enfocar las células. Establezca la ventana SP para la detección de emisión de CFP entre 465 y 505 nm y para YFP entre 525 y 600 nanómetros, mientras monitorea ambos canales de emisión excitando el CFP a 458 nanómetros. Utilizando el A OTF, ajuste la potencia del láser para eliminar el paso apreciable de CFP al canal de emisión de YFP.Guarde esta configuración. Realice el mismo control para la interferencia de YFP en el canal CFP ajustando la potencia de excitación a 514 nanómetros. Las células que expresan solo YFP, guarde esta configuración.A continuación, coloque las células coexpresando CFP y YFP en el incubador del microscopio. Utilizando la configuración de secuencia del software confocal LICO, localice células que expresen niveles similares de CFP y YFP con una correcta localización en la membrana mediante el software LICO, excepto un programa de aceptación de fotoblanqueo.Configure los ajustes del donador y del aceptor según sus ajustes guardados de CFP y YFP, respectivamente. Acérquese al célula, resalte una región de interés o ROI en la que se producirá la destrucción fotoquímica de YFP en la membrana celular e inicie el programa para la destrucción fotográfica del aceptor. Ajuste el A OTF al 100 % de 514 nanómetros y permita que el blanqueo con láser continúe hasta que se haya agotado el 70 % de la emisión de YFP.Para acelerar el blanqueo, las ROI suelen seleccionarse en el eje de barrido del láser durante el fotoblanqueo. Supervise el movimiento celular y rechace las mediciones obtenidas con un movimiento apreciable en el plano XY. Dado que estas mediciones pueden reportar eficiencias de FRET falsas, se registran imágenes antes y después del blanqueo tanto para el donador como para el aceptor, y la eficiencia de FRET se calcula como eficiencia de FRET igual a (DLO_posterior_menos_parental_abierto) dividido por D_post para todos los D_post mayores que D_pre, donde D_pre y D_post son las intensidades del donador antes y después del fotoblanqueo, respectivamente.Se utiliza JMP para determinar el grado de variabilidad experimental. Los receptores individuales deben fusionarse tanto con CFP como con YFP, utilizando longitudes variables de secuencia juxtamembrana. Para identificar el par óptimo de receptores compañeros de FRET, las eficiencias de transfección suelen estar entre el 30 y el 40 %, a pesar de hallazgos previos realizados por otros autores.No hemos observado que la transfección y expresión de un vector favorezca la del otro. De hecho, con frecuencia observamos la expresión exclusiva de una flora, ya sea el espejo KY o el otro. Estas imágenes representativas muestran un análisis de fotoblanqueo del aceptor de la transferencia de resonancia de energía de fluorescencia (FRET) que ocurre entre CFP y YFP en una célula EAHY 926.Los canales de emisión de CFP y YFP se monitorearon por separado antes y después del blanqueo fotográfico, y los cálculos se limitaron a la región. Dentro del cuadro rojo, la eficiencia de FRET se muestra como un rango absoluto desde un valor alto coloreado en rojo (1,0) hasta un valor bajo coloreado en morado (cero), sobre una superposición ampliada de la imagen fusionada A-C-F-P-Y-F-P únicamente con fines de orientación para el sistema del receptor T. Los valores típicos de eficiencia de FRET son del 20 al 28 % para células epiteliales y del 19 al 23 % para células endoteliales, como se muestra aquí.Una vez dominada, esta técnica normalmente tarda de tres a cuatro días si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la longitud del enlazador entre la proteína diana y la proteína fluorescente de fusión, así como sus niveles de expresión y movimiento celular, afectan directamente la medición de FRET tras su procedimiento. Además, se pueden realizar ensayos bioquímicos sobre la activación de señales con el fin de obtener información sobre las vías de transducción de señales tras su desarrollo.Esta técnica proporciona un ensayo en el cual se pueden estudiar interacciones proteína-proteína que son débiles o transitorias. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo realizar sus propios ensayos de proximidad basados en FRET en células vivas. Y no olvide que, al trabajar con células en cultivo de tejidos, siempre se deben seguir las precauciones de seguridad adecuadas.Así que gracias por vernos y mucha suerte con sus futuros experimentos de fret.

imaging-protein-protein-interactions-in-vivo

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video muestra los experimentos con el posterior análisis de las interacciones proteína-proteína mediante el uso de micro-modelado de superficies. El enfoque ofrece la posibilidad de detectar las interacciones de proteínas en las células vivas y combina una alta capacidad de rendimiento con la posibilidad de extraer información cuantitativa.

En vivo-La detección de interacciones proteína-proteína en la Micro-patrón superficies

Mediante el empleo de un espectro resuelto de dos fotones sistema de imágenes de microscopía, a nivel de píxel de mapas de transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) se obtienen eficiencias de las células que expresan receptores de membrana, la hipótesis de que forma oligomérica homo-complejos. Mapas de la FRET eficiencia, son capaces de estimar la información sobre el complejo estequiométrico oligómero en estudio.

En la cuantificación in vivo de interacciones de proteínas G del receptor acoplado con espectralmente resuelve de dos fotones de Microscopía

Pruebas de interacción proteína-proteína es indispensable para la disección de la funcionalidad de las proteínas. Aquí, presentamos...

De proteínas de membrana de superposición de ensayo: Un protocolo de prueba de interacción entre las proteínas soluble e insoluble In vitro</em

Formación de complejos de proteínas in vivo puede ser visualizado por complementación de fluorescencia bimolecular. Parejas de interacción se fusionan a partes complementarias de etiquetas fluorescentes y expresados ​​transitoriamente en hojas de tabaco, lo que resulta en una señal fluorescente reconstituido en una estrecha proximidad de las dos proteínas.

Interacciones proteína-proteína se visualizó por fluorescencia Bimolecular Complementación en protoplastos de tabaco y hojas

Las interacciones proteína-proteína pueden ocurrir tanto en el núcleo como en el citoplasma de una célula. Para investigar estas interacciones, se aplica la coinmunoprecipitación tradicional y el ensayo moderno de ligadura de proximidad. En este estudio, comparamos estos dos métodos para visualizar la distribución de las interacciones NF90-RBM3 en el núcleo y el citoplasma.

La visualización de la interacción proteína-proteína en las fracciones nucleares y citoplasmáticas de Co-inmunoprecipitación y<em&gt; In Situ</em&gt; Ligadura ensayo de proximidad

Este manuscrito describe un procedimiento experimental fácil y rápido para la determinación de las interacciones proteína-proteína basadas en la medición de la actividad de luciferasa.

Complementación de luciferase imagen ensayo en hojas de Nicotiana benthamiana para determinar transitoriamente proteínas interacción dinámica

Aquí, presentamos un protocolo para una técnica de digestión en la membrana para la preparación de muestras para espectrometría de masas. Esta técnica facilita el análisis conveniente de las interacciones proteína-proteína.

Evaluación de interacciones proteínas-proteínas utilizando una técnica de digestión en la membrana

La inmunoprecipitación por multiplex (QMI) cuantitativa utiliza citometría de flujo para la detección sensible de diferencias en la abundancia de interacciones proteínas y proteínas dirigidas entre dos muestras. QMI se puede realizar utilizando una pequeña cantidad de biomaterial, no requiere etiquetas genéticamente diseñadas y se puede adaptar para cualquier red de interacción de proteínas previamente definida.

Cuantificación de la dinámica de la red de interacción de proteínas mediante coinmunoprecipitación multiplexada

La necesidad de nuevos enfoques para estudiar los sitios de contacto de membrana (MCS) ha crecido debido al creciente interés en el estudio de estas estructuras celulares y sus componentes. Aquí, presentamos un protocolo que integra tecnologías de microscopía previamente disponibles para identificar y cuantificar complejos de proteínas intra-orgánulos e inter-orgánulos que residen en los SQM.

Visualización y cuantificación de las interacciones endógenas de proteínas intraorgánulas en los sitios de contacto ER-mitocondrias mediante ensayos de ligadura de proximidad

El protocolo presenta un método para la unión covalente in vivo de biotina a proteínas basado en su proximidad a una biotina ligasa fusionada con una proteína de interés. Esta modificación permite un enriquecimiento selectivo de las proteínas utilizando perlas de estreptavidina según sea necesario en los estudios de interacción de proteínas.

In vivo Biotinilación de proximidad para estudios de interacción de proteínas en Paramecium tetraurelia

Aprende a evaluar interacciones proteína-proteína en células endoteliales mediante ensayo de proximidad basado en FRET. Este método permite visualizar dinámicas de receptores durante la angiogénesis con microscopía confocal.

Imágenes de interacciones proteína-proteína In vivo

Explorar más videos