Imágenes de interacciones proteína-proteína In vivo

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar la presencia de interacciones entre proteínas en la superficie celular. Esto se logra clonando dos receptores de interés, cada uno en el extremo amino terminal de dos fluoróforos que tienen espectros de emisión superpuestos, como segundo paso. Los dos vectores se transfectan simultáneamente en células endoteliales para lograr la expresión de los receptores.

En este momento, los fluoróforos ayudan a evaluar el grado general de expresión, así como la localización del receptor. A continuación, se establecen los parámetros de imagen mediante una transfección individual como control en el microscopio confocal. Las células transfectadas individualmente se seleccionan según sus niveles relativos de expresión y localización del receptor.

Posteriormente, se realizan imágenes de regiones dentro de estas células para evaluar el grado de resultados de FRET, que muestran interacciones de tie uno y tie dos en la superficie de la célula endotelial basadas en FRET y microscopía confocal. Hola, soy Tom Seger del laboratorio del Dr. William Barton del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad Estatal de Virginia.

Hoy les mostraremos un procedimiento para evaluar interacciones entre proteínas en células endoteliales mediante microscopía confocal basada en FRET. En nuestro laboratorio, utilizamos esto para estudiar interacciones entre receptores durante la angiogénesis. Así que comencemos.

Para obtener imágenes de interacciones entre proteínas mediante un ensayo de proximidad basado en FRET, comience clonando sus receptores de interés en los sitios NHE I y EcoR I del vector pcd, que contiene CFP o YFP monomérico, con resistencia a la hidro o neomicina. La determinación de FRET es empírica y depende críticamente de la longitud del enlazador entre la región transmembrana y el inicio del fluoróforo. Por lo tanto, deben explorarse varios enlazadores de distinta longitud para cada nuevo par de receptores bajo estudio. Transforme y amplifique los vectores según el protocolo adjunto.

Luego prepare ADN de calidad para transfección, transforme y amplifique los vectores según el protocolo adjunto. A continuación, prepare ADN de calidad para transfección y dilúyalo a una concentración de trabajo de un microgramo por microlitro para preparar las células para la transfección bajo una campana de cultivo celular. Divida las células EAHY 92 6 crecidas en DMEM completo en placas de 35 milímetros con cubreobjetos, utilizando dos mililitros de medio. Prepare una placa para evaluar la expresión de cada receptor individual, así como una placa para cada par de receptores.

Deje que las células incuben al día siguiente en una atmósfera con más del 95 % de dióxido de carbono a 37 grados Celsius. El cultivo debe tener una confluencia del 70 al 90 % el día de la transfección. Prepare complejos nucleolípidos mezclando dos microgramos del ADN del vector del receptor quimérico con ocho microlitros de Fuji N HD en 200 microlitros de Opti-MEM precalentado; para pares de receptores, transfecte con un microgramo de cada receptor, para un total de dos microgramos, mezclando suavemente por inversión e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Durante el período de incubación, prepare las células para la transfección aspirando el medio fresco y lavando cada placa suave y brevemente con PBS tibio antes de añadir dos mililitros de DMEM completo precalentado sin antibióticos. Es importante evitar la presencia de penicilina y estreptomicina, ya que son considerablemente más tóxicas para las células durante el tratamiento con el gen FU HD. Añada el complejo gota a gota a las células e incube durante 20 a 24 horas adicionales. Después de 24 horas, aspire cuidadosamente el medio de las células y añada con pipeta DMEM completo fresco con antibióticos tras la transfección.

La viabilidad celular debe mantenerse relativamente alta. Se deben observar pocas o ninguna célula flotante. Para realizar imágenes de células vivas, utilizamos un microscopio confocal de barrido láser A-T-C-S-P two A OBS equipado con láseres de argón azul y de helio-neón verdes, naranjas y rojos, un objetivo H-C-X-P-I-A-O 63 x 1.3 NA de inmersión en glicerina, una platina motorizada XY y un incubador de platina controlado en temperatura, humedad y dióxido de carbono.

Los controles experimentales son cruciales para eliminar la interferencia entre canales de emisión de fluorocromos, así como para evaluar problemas de expresión y la fluoración no específica. Por ello, se utilizan transfecciones con un solo fluorocromo para configurar cada sesión de imagen, con el fin de eliminar la interferencia entre los canales de emisión de CFP y YFP. Coloque el control de expresión de CFP en el incubador del microscopio utilizando luz blanca.

Ajuste la placa Z para enfocar las células. Establezca la ventana SP para la detección de emisión de CFP entre 465 y 505 nm y para YFP entre 525 y 600 nanómetros, mientras monitorea ambos canales de emisión excitando el CFP a 458 nanómetros. Utilizando el A OTF, ajuste la potencia del láser para eliminar el paso apreciable de CFP al canal de emisión de YFP.

Guarde esta configuración. Realice el mismo control para la interferencia de YFP en el canal CFP ajustando la potencia de excitación a 514 nanómetros. Las células que expresan solo YFP, guarde esta configuración.

A continuación, coloque las células coexpresando CFP y YFP en el incubador del microscopio. Utilizando la configuración de secuencia del software confocal LICO, localice células que expresen niveles similares de CFP y YFP con una correcta localización en la membrana mediante el software LICO, excepto un programa de aceptación de fotoblanqueo.

Configure los ajustes del donador y del aceptor según sus ajustes guardados de CFP y YFP, respectivamente. Acérquese al célula, resalte una región de interés o ROI en la que se producirá la destrucción fotoquímica de YFP en la membrana celular e inicie el programa para la destrucción fotográfica del aceptor. Ajuste el A OTF al 100 % de 514 nanómetros y permita que el blanqueo con láser continúe hasta que se haya agotado el 70 % de la emisión de YFP.

Para acelerar el blanqueo, las ROI suelen seleccionarse en el eje de barrido del láser durante el fotoblanqueo. Supervise el movimiento celular y rechace las mediciones obtenidas con un movimiento apreciable en el plano XY. Dado que estas mediciones pueden reportar eficiencias de FRET falsas, se registran imágenes antes y después del blanqueo tanto para el donador como para el aceptor, y la eficiencia de FRET se calcula como eficiencia de FRET igual a (DLO_posterior_menos_parental_abierto) dividido por D_post para todos los D_post mayores que D_pre, donde D_pre y D_post son las intensidades del donador antes y después del fotoblanqueo, respectivamente.

Se utiliza JMP para determinar el grado de variabilidad experimental. Los receptores individuales deben fusionarse tanto con CFP como con YFP, utilizando longitudes variables de secuencia juxtamembrana. Para identificar el par óptimo de receptores compañeros de FRET, las eficiencias de transfección suelen estar entre el 30 y el 40 %, a pesar de hallazgos previos realizados por otros autores.

No hemos observado que la transfección y expresión de un vector favorezca la del otro. De hecho, con frecuencia observamos la expresión exclusiva de una flora, ya sea el espejo KY o el otro. Estas imágenes representativas muestran un análisis de fotoblanqueo del aceptor de la transferencia de resonancia de energía de fluorescencia (FRET) que ocurre entre CFP y YFP en una célula EAHY 926.

Los canales de emisión de CFP y YFP se monitorearon por separado antes y después del blanqueo fotográfico, y los cálculos se limitaron a la región. Dentro del cuadro rojo, la eficiencia de FRET se muestra como un rango absoluto desde un valor alto coloreado en rojo (1,0) hasta un valor bajo coloreado en morado (cero), sobre una superposición ampliada de la imagen fusionada A-C-F-P-Y-F-P únicamente con fines de orientación para el sistema del receptor T. Los valores típicos de eficiencia de FRET son del 20 al 28 % para células epiteliales y del 19 al 23 % para células endoteliales, como se muestra aquí.

Una vez dominada, esta técnica normalmente tarda de tres a cuatro días si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la longitud del enlazador entre la proteína diana y la proteína fluorescente de fusión, así como sus niveles de expresión y movimiento celular, afectan directamente la medición de FRET tras su procedimiento. Además, se pueden realizar ensayos bioquímicos sobre la activación de señales con el fin de obtener información sobre las vías de transducción de señales tras su desarrollo.

Esta técnica proporciona un ensayo en el cual se pueden estudiar interacciones proteína-proteína que son débiles o transitorias. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo realizar sus propios ensayos de proximidad basados en FRET en células vivas. Y no olvide que, al trabajar con células en cultivo de tejidos, siempre se deben seguir las precauciones de seguridad adecuadas.

Así que gracias por vernos y mucha suerte con sus futuros experimentos de fret.