Name: Un Ex-ovo Embrión de cultivo apropiado para aplicaciones de imagen y sistema de Microcirugía (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Aprenda a cultivar embriones de pollo ex-ovo para estudios de embriogénesis con acceso óptico completo. Este método permite microinyecciones, microcirugía y transporte estéril en biología del desarrollo aviar.

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1. Ex-ovo Cultura Protocolo: <ol><li> Incubar huevos de gallina fertilizados <ol class="lroman"><li> Fecundados los huevos de gallina se puede almacenar a 13 ° C hasta 5 días antes de la incubación sin iniciar el desarrollo. Un enfriador de vino tinto puede mantener esta temperatura. </li><li> Incubar los huevos lado romo en un 60% de humedad constante incubadora con la oscilación continua a 37,5 ° C durante 72 horas. </li></ol></li><li> Preparar hamacas (Figura 1a) <ol class="lroman"><li> Llene ¾ de 9 oz vasos de plástico con agua estéril tibia. Un habitual 9 oz taza tiene un diámetro máximo de 8 cm. Hemos encontrado que este tamaño era el más adecuado para su aplicación a largo tiempo en la cultura que aquí se presenta. </li><li> Cortar unos 20 cm de film transparente. Ponga circunferencialmente en la parte superior de la copa mediante la colocación de una banda elástica alrededor. Plástico debe ser esparcida en la superficie del agua. Corte el exceso de plástico alrededor de la banda. Encontramos film transparente, para ser más adecuado para esta aplicación ya que evita la adherencia de la yema de huevo, lo que resulta en la división de la yema durante el transporte. </li><li> Limpie el plástico con Kimwipes (Kimberly-Clark, Inc.) humedecido con etanol al 70%. </li></ol></li><li> Eliminar los huevos de la incubadora después de 72 horas de incubación. </li><li> Esterilizar los huevos limpiando la superficie con etanol al 70% Kimwipes mojada. </li><li> Poner los huevos en horizontal durante 1-2 minutos para el posicionamiento adecuado del embrión (Figura 1b). Un cartón de huevos se pueden utilizar para poner los huevos en posición horizontal. Los embriones se gire a la cima después de 1-2 minutos. </li><li> La transferencia de embriones en hamacas asépticamente en una campana de flujo laminar. <ol class="lroman"><li> El uso de un borde afilado (como el borde de un cubo de metal o un vaso de vidrio), toque suavemente el huevo hasta que haya una pequeña abolladura en la parte inferior del huevo (Figura 1c). Recuerde, el embrión se coloca en el haz. </li><li> Pon los pulgares en los lados opuestos de la abolladura y tire las cáscaras aparte horizontalmente (Figura 1d). </li><li> Coloque la yema de huevo con embrión, así como la albúmina en la hamaca (Figura 1). Albúmina proporcionará un ambiente de amortiguación alrededor de la yema de absorber las crisis inducidas por el sistema en movimiento, así como proporciona la nutrición al embrión para las prácticas de la cultura de largo. Agua por debajo de la hamaca se asegurará de que el embrión se quedará paralelo al suelo durante el transporte y servir como un conductor de calor durante la exposición, si un calentador de circulación del agua se utiliza. </li><li> El embrión ya se debe colocar en la parte superior si la transferencia se realiza correctamente. Si no, utilice un enfoque, objeto estéril (es decir, la punta roma de tijeras curvas cerradas) y acariciar direccionalmente la yema de tal manera que el embrión se gira a la cima. </li><li> Coloque un diámetro de 10 cm placa de Petri en la parte superior de la copa para sellar el embrión. </li></ol></li><li> Lugar en la Copa cultura en el conjunto de la incubadora a 37,5 ° C. Si una incubadora portátil se utiliza, la colocación de 1 a 2 sept tazas oz con agua destilada mantiene la humedad en el ~ 60% (Figura 1f). </li><li> Si los embriones más allá del día de cultivo embrionario 7 de la cáscara de huevo trituradas piezas deben ser esparcidas alrededor de la periferia del embrión como fuente de calcio para el desarrollo óseo y la maduración. </li></ol> Equipo auxiliar para los fuera de la incubadora de imagen / manipulación: Un baño de agua circulante fue construido en casa para mantener las temperaturas de incubación, mientras que la manipulación de imágenes o (Figura 3). Un baño de agua que puede caber la taza está conectada mediante un tubo de tamaño apropiado para un depósito de agua. Un calentador de resistencia calienta el agua en el embalse que se regula manualmente mediante la temperatura del agua. Una bomba de agua hace circular el agua. Representación pictórica muestra la facilidad de imágenes a través de ultrasongraphy / microscopía florescent (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Preparación de la hamaca y la transferencia de embriones de pollo para hamacas. <img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Los resultados representativos -. Diferentes embriones de pollo etapa crecido a través de la cultura técnica de ex ovo embriones de HH 17 en adelante se pueden cultivar a través de esta técnica. <img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Imágenes esquemáticas y representante del sistema de circulación de agua que se utiliza en conjunción con el sistema de cultivo ex-ovo para mantener los embriones a la temperatura ideal de desarrollo. 2. Las solicitudes seleccionadas: I. La microinyección Este cultivo de embriones es adecuado para aplicaciones donde las soluciones de microinyección que ser inyectado a la vasculatura de contraste de imagen basado en (es decir, la microscopía fluorescente, micro-topografía computarizada, etc) (Figura 4). A continuación se muestra el protocolo de microinyección: <ol><li> Preparar la inyección Apparatus <ol class="lroman"><li> Moda sacó 0,75 tubos de vidrio ID capilar en microagujas punta biselada con un microforge. Tamaño de la punta requerida depende de la vena blanco diámetro / caudal deseado. </li><li> Conecte la jeringa al tubo de 0.03 pulgadas de silicona ID. </li><li> Cargar el tubo con la solución a inyectar y conectar la microaguja de la tubería. </li><li> Coloque la microaguja en el micromanipulador y una jeringa para soporte de jeringa o bomba de jeringa. </li></ol></li><li> Añadir agua destilada en el vaso así lograr que el embrión. Hemos experimentado que para la penetración adecuada de la aguja en un vaso sanguíneo (es decir, buques vitelina), la penetración horizontal, es necesario. Esto requiere que el embrión para estar en el mismo plano que los bordes de la copa. <ol class="lroman"><li> Saque la cinta de goma de plástico debajo de la celebración de la del embrión. </li><li> Levantar un lado del plástico suave y añadir un poco de agua estéril a la taza. </li><li> Asegure la banda de goma en el plástico nuevo. </li></ol></li><li> Se inyecta la solución a un buque de embriones. En nuestra experiencia, cuando la solución se inyecta en un vaso vitelino, microagujas necesario ª tamaño aproximadamente 1 / 10 del diámetro del vaso para mantener la perfusión eficaz sin causar sangrado. <ol class="lroman"><li> Bomba de la solución a la microaguja garantizar la no formación de burbujas de aire. </li><li> Alinee la punta de la microaguja en el recipiente seleccionado. Para los buques vitelina, la selección de un área tenedor dará área máxima de penetrar en el buque. </li><li> Empuje la aguja hacia el buque. El primer buque se retraerá. Una vez que la aguja penetra, iniciar la perfusión. El color de la sangre que fluye debe cambiar con la perfusión. Si el cambio de color no se ve, la aguja puede haber penetrado de la embarcación. En ese caso, poco a poco retraer el microagujas y al mismo tiempo de bombeo de la solución hasta que el cambio de color en el vaso se ve. Una vez que la perfusión se ha completado, retire la microaguja de la embarcación. </li></ol></li></ol><img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4: La microinyección de un tinte fluorescente en la vasculatura de un embrión de pollo ex ovo cultivadas. II. Procedimiento microquirúrgico - Ligadura auricular izquierda Esta configuración de la cultura ex-ovo es ideal para realizar aplicaciones quirúrgicas de embriones de pollo, ya que proporciona un acceso completo al embrión. A continuación se muestra el protocolo de una técnica de ejemplo, la ligadura de la izquierda auricular (LAL) (Figura 5). El procedimiento se realiza aproximadamente 24 horas en el período de cultivo (HH24): <ol><li> Prepare encima de la cabeza nudos ~ 0,5 mm de diámetro con sutura de nylon 10-0 quirúrgica. </li><li> Con unas pinzas finas, localmente eliminar las membranas coriónica y alantoideo sobre el embrión y levantar el embrión de la parte posterior para rotar verticalmente de manera que el lado izquierdo del embrión es visible. </li><li> Con unas pinzas finas, eliminar el pericardio en la aurícula izquierda. </li><li> Alinear el nudo en la aurícula izquierda y apretarlo. El nudo debe estar vinculada con el fin de prohibir el ~ 75% del flujo de sangre original en el lado izquierdo. Cortar los bordes del nudo con micro tijeras y retire con cuidado y deseche el exceso de sutura. </li><li> Gire el embrión de regreso a su orientación original (a la derecha en la parte superior). </li><li> Sham controles supondrá el mismo procedimiento, pero sólo la sutura se pasa a través y no atados. El tratamiento eficaz LAL (75 constricción%) se confirmó a las 24 horas posteriores a la cirugía, y los embriones descalificado será excluido. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2154/2154fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5:. Un control y un auricular izquierda embrión de pollo liga Flecha muestra la aurícula izquierda, que es aproximadamente el 75% más pequeño en el embrión de liga.

<ol><li>Zamir, E. A., Czirok, A., Cui, C., Little, C. D., Rongish, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesodermal+cell+displacements+during+avian+gastrulation+are+due+to+both+individual+cell-autonomous+and+convective+tissue+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mesodermal cell displacements during avian gastrulation are due to both individual cell-autonomous and convective tissue movements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19806-19811 (1980).</li>
<li>Ehrman, L. A., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+regulation+in+the+heart+forming+region+of+avian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Lack of regulation in the heart forming region of avian embryos.</a> Dev Biol. 207, 163-175 (1999).</li>
<li>Clark, E. B., Hu, N., Rosenquist, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+conotruncal+constriction+on+aortic-mitral+valve+continuity+in+the+stage+18%2C+21+and+24+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Effect of conotruncal constriction on aortic-mitral valve continuity in the stage 18, 21 and 24 chick embryo.</a> Am J Cardiol. 53, 324-327 (1984).</li>
<li>deAlmeida, A., McQuinn, T., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+ventricular+preload+is+compensated+by+myocyte+proliferation+in+normal+and+hypoplastic+fetal+chick+left+ventricle%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Increased ventricular preload is compensated by myocyte proliferation in normal and hypoplastic fetal chick left ventricle.</a> Circ Res. 100, 1363-1370 (2007).</li>
<li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Methods. 24, 43-48 (2001).</li>
<li>Butcher, J. T., McQuinn, T. C., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+in+early+embryonic+atrioventricular+valvular+function+correspond+with+changes+in+cushion+biomechanics+that+are+predictable+by+tissue+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition.</a> Circ Res. 100, 1503-1511 (2007).</li>
<li>McQuinn, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+ultrasonographic+imaging+of+avian+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">High-frequency ultrasonographic imaging of avian cardiovascular development.</a> Dev. Dyn. 236, 3503-3513 (2007).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+procedure+for+the+long-term+cultivation+of+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev Biol. 41, 391-394 (1974).</li>
</ol>

Acceso óptico y la experimentación en embriones de aves es un reto debido a las limitaciones de la cáscara del huevo. Ventanas limita de manera significativa el número de acceso para métodos de inyección y de microcirugía 8 microvasos. Como resultado de ello sólo embriones pueden ser manipulados y la observación continua no es posible. Los primeros ex-ovo culturas utilizando placas de Petri eran de uso limitado debido al control inadecuado de la tensión superficial sobre el embrión impedido la cultur...

<table><tbody><tr><td>Huevos fértiles de gallina Leghorn blanca</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modelo GB1, incubadoras Avery Inc., Hugo CO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papel plástico Saran Wrap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Corporación Kimberly-Clark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ligas de hule</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agua estéril tibia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vaso plástico de 9 oz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 100 mm de diámetro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aire térmico 1602N</td><td>GQF Manufacturing</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dextrano conjugado con fluoresceína (2 MDa, 1 % p/v en solución salina tamponada con fosfato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfórceps</td><td>Glassworx, Inc., St. Louis MO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos capilares de vidrio (0,75 mm de diámetro interno)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Modelo M3301L</td><td></td></tr><tr><td>Microscopía de fluorescencia</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Z20</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas finas de 55 grados</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutura quirúrgica de nylon 10-0</td><td>Ethicon Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo</td><td>VWR International</td><td></td><td>1 mm de diámetro externo</td></tr><tr><td>Jeringa de 3 mL</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de 200 &amp;mu;L y puntas para pipeta</td><td>VWR International</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un ex-ovo</empollo> embrión de cultivo apropiado para aplicaciones de imagen y sistema de microcirugía

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Entender las relaciones entre factores genéticos y microambientales que impulsan el desarrollo embrionario normal y malformaciones es fundamental para el descubrimiento de nuevas estrategias terapéuticas. Los avances en tecnología de imagen han permitido a la investigación cuantitativa de la organización y la maduración de la estructura corporal, pero la morfogénesis embrionaria en una etapa posterior es menos clara. Embriones de pollo es un animal vertebrado atractivo sistema de modelo para esta aplicación debido a su facilidad de la cultura y la manipulación quirúrgica. Principios de los embriones pueden ser cultivadas por un corto tiempo en los anillos de papel de filtro, que permite el acceso completo óptico de patrones celulares y 1,2 destino estudios. El estudio de procesos avanzados de desarrollo tales como la morfogénesis cardíaca se realiza tradicionalmente a través de una ventana de la cáscara del huevo 3-5, pero esta técnica limita el acceso óptico debido a tamaño de la ventana. Anteriormente hemos desarrollado un método simple para la cultura embriones enteros ex ovo en el hexagonal pesar barcos de hasta 10 días, lo que permitió imágenes de alta resolución a través de la ecografía 6,7. Estos cultivos fueron difíciles de transportar, lo que limita los tipos de herramientas de imágenes disponibles para los experimentos en vivo. Presentamos aquí una mejora de caparazón sistema de cultivo con un costo-efectivo, cámara ambiental portátil. Los huevos estaban rotas en una hamaca, creada por una membrana de poliuretano (film transparente) fijado circunferencialmente a una taza de plástico llena parcialmente con agua estéril. Las dimensiones de la circunferencia y la profundidad de la hamaca fueron fundamentales para mantener la tensión de la superficie, mientras que la mecánica de la hamaca y el agua por debajo ayudado a amortiguar las vibraciones inducidas por el transporte. Un tamaño pequeño baño de agua circulante también fue desarrollado para permitir un control continuo de la temperatura durante la experimentación. Se demuestra la capacidad de cultivar los embriones de esta manera por lo menos 14 días sin defectos o retraso morfogénica y emplear este sistema en varias de microcirugía y aplicaciones de imágenes.

En este artículo se presenta una metodología sencilla para que a largo plazo<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Cultivo de embriones de aves. Esta técnica es ideal para la experimentación longitudinal que requiere la plena accesibilidad ópticos y / o transporte de estériles en embriones de aves.

Un Ex-ovo</emPollo> Embrión de cultivo apropiado para aplicaciones de imagen y sistema de Microcirugía

Comprender las relaciones entre los factores genéticos y microambientales que impulsan el desarrollo embrionario normal y malformado es fundamental para...

En el sistema de cultivo embrionario de pollo *ex ovo*, la preparación de cultivos embrionarios de pollo en cáscara permite investigar la embriogénesis. El procedimiento comienza con la obtención e incubación de huevos de pollo fertilizados a 37,5 grados Celsius durante 72 horas. Se preparan hamacas para sostener las yemas de huevo con los embriones en desarrollo.A continuación, las yemas de huevo pueden transferirse a hamacas, y la embriogénesis continúa fuera del cascarón. Esta técnica puede aplicarse para microinyección en el sistema vascular, ecografía y microcirugía, y los resultados pueden mostrar cómo se desarrollan los embriones en condiciones normales y alteradas. Hola, me llamo Akshay Shaker y soy estudiante de maestría en el laboratorio de bioingeniería del desarrollo cardiovascular dirigido por Jonathan Butcher en el Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Cornell.Y la principal ventaja de nuestra técnica frente a métodos anteriores, como el cultivo de huevos in ovo, es que proporciona un acceso óptico completo al embrión, así como facilidad de transporte sin daños. Hola, me llamo Char Hin. Soy investigador posdoctoral en el Laboratorio de Bioingeniería del Desarrollo Cardiovascular, Laboratorio de Jonathan Chu, del Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Cornell.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, como cómo se desarrollan las malformaciones cardíacas durante la embriogénesis. Antes de comenzar este procedimiento, esterilice todos los materiales frotándolos con etanol al 70%. Para iniciar el procedimiento, llene tres cuartas partes de un vaso plástico de nueve onzas con agua estéril tibia.Repita el procedimiento para tantas tazas como sean necesarias. Una taza estándar de nueve onzas tiene un diámetro superior de ocho centímetros, que es el tamaño más adecuado para la aplicación de cultivo prolongado presentada aquí. A continuación, corte un trozo de papel film de 20 centímetros de largo.Cubra la parte superior del vaso plástico de nueve onzas lleno con agua tibia estéril con un trozo de película plástica adhesiva, y use una banda elástica para mantener la envoltura plástica en su lugar. La película plástica adhesiva es la más adecuada para esta aplicación, ya que evita que la yema se pegue, lo cual podría provocar la ruptura de la yema. Durante el transporte, el plástico debe extenderse de manera que toque la parte superior del agua.Corte el plástico sobrante alrededor de la banda y limpie el plástico. Con toallitas Kim empapadas en etanol al 70%, los hamacas ya están listas para sostener a los embriones. Los huevos de gallina fertilizados pueden almacenarse a 13 grados Celsius hasta cinco días antes de la incubación.Sin activar el desarrollo, un enfriador de vino tinto puede mantener esta temperatura para tener los huevos listos para el cultivo. Active el desarrollo del embrión incubando los huevos en un sitio elevado en un incubador con humedad constante del 60 % con agitación continua a 37,5 grados Celsius durante 72 horas. Cuando los huevos estén listos, retírelos del incubador.Sterilice los huevos limpiándolos con toallitas Kim impregnadas con etanol al 70 %. Coloque los huevos horizontalmente de lado sobre una huevera durante uno o dos minutos para lograr una adecuada posición del embrión. Trabaje con un máximo de seis huevos a la vez, ya que intentar romper más de seis huevos simultáneamente resulta difícil.Puede provocar que la temperatura de salida permanezca demasiado tiempo, lo cual puede afectar la viabilidad. Al final de uno a dos minutos, el embrión ha deslizado hasta la parte superior del huevo. Para transferir cada embrión a una hamaca, trabaje asépticamente en una cabina de flujo laminar.Primero, rompa suavemente la parte inferior del huevo utilizando un borde afilado, como el borde de un cubo de metal o un vaso de precipitados de vidrio. Recuerde que el embrión se encuentra en el lado superior. Separe suavemente las dos mitades del cascarón tirando hacia los lados con los dos pulgares.Luego coloque el embrión, la yema y el albúmino sobre la hamaca. El albúmino proporciona un entorno amortiguado alrededor de la yema, absorbiendo los impactos causados por el movimiento del sistema. El albúmino también proporciona nutrición al embrión durante el largo período de cultivo.Si la transferencia del embrión se realiza correctamente, el embrión ya debería estar posicionado en la parte superior. Si el embrión se encuentra en la parte inferior, utilice tijeras pequeñas de curva cerrada u otro instrumento romo similar para frotar la yema de modo que gire sobre sí misma y el embrión pase a la parte superior. Si se cultivan embriones más allá del día siete embrionario, distribuya trozos de cáscara de huevo triturados alrededor del perímetro del embrión como fuente de calcio para el desarrollo y la maduración ósea.Una vez completada la transferencia del embrión, coloque una placa de Petri de 10 centímetros de diámetro encima del vaso para sellar el embrión. Coloque la hamaca en la incubadora ajustada a 37,5 grados Celsius. Si se utiliza una incubadora portátil, coloque también en la incubadora uno o dos vasos de nueve onzas llenos de agua.Con el fin de mantener la humedad aproximadamente en un 60 %, los embriones continúan desarrollándose y pueden utilizarse para microinyección en aplicaciones de microcirugía. Este cultivo de embriones es adecuado para aplicaciones de microinyección en las que se necesiten inyectar soluciones en la vasculatura. Primero, prepare el aparato de inyección comenzando con las agujas, utilizando una técnica de microforja, estire tubos capilares de vidrio para formar micropipetas con punta biselada.El tamaño de la punta depende del caudal deseado. Conecte la jeringa con microaguja a un tubo de silicona con un diámetro interno de 0,03 pulgadas. Llene el tubo de la jeringa con una solución que se va a inyectar y conecte la microaguja de la jeringa al tubo.Coloque la microaguja en el micromanipulador y la jeringa en el soporte para jeringas o en la bomba de infusión. Una vez que el conjunto de inyección esté listo, recupere los embriones. Se requiere una penetración horizontal de la aguja para una entrada adecuada de la aguja en un vaso sanguíneo, como un vaso vital.Por lo tanto, el embrión debe estar al mismo nivel que los bordes del vaso que lo contiene. Para elevar el embrión, retire la banda elástica que sostiene la envoltura de plástico que lo soporta. Levante suavemente un lado del plástico y agregue un poco de agua al vaso sin mover demasiado el embrión.Luego coloque la banda de goma sobre el plástico nuevamente. Ahora que el embrión está elevado, se puede inyectar la solución en un vaso embrionario. Tenga en cuenta que al inyectar en un vaso vital, el tamaño de la micropipeta debe ser aproximadamente un décimo del diámetro del vaso.Para mantener una perfusión eficiente sin causar hemorragia, primero bombee la solución dentro de la microaguja de modo que no quede aire atrapado en su interior. A continuación, alinee la punta de la microaguja con un vaso seleccionado para vasos vitales. Elegir un área proporciona la superficie máxima para dirigirse al vaso.Una vez definida el área de inyección, inserte la aguja hacia el vaso. Primero, el vaso se retrae. Una vez que la aguja penetra y comienza la perfusión, el color de la sangre en movimiento cambia con la perfusión.Si no se observa el cambio de color, es posible que la aguja haya atravesado el vaso. En ese caso, retire lentamente la micropipeta mientras bombea simultáneamente la solución hasta que se observe un cambio de color en el vaso. Cuando la perfusión esté completa, retire suavemente la micropipeta del vaso. Este cultivo de embrión también es adecuado para aplicaciones de microcirugía, como la ligadura auricular izquierda, que se realiza en el cuarto día de incubación.Primero, prepare los nudos que se utilizarán con un diámetro de 0,5 milímetros a partir del hilo de sutura quirúrgica de nylon 10-0. Con pinzas finas, retire las membranas coriónica y amniótica del embrión. Levante el embrión desde la parte posterior y gírelo verticalmente de modo que el lado izquierdo del embrión quede ahora en la parte superior y sea accesible.A continuación, retire el pericardio sobre la aurícula izquierda. Coloque el nudo sobre la aurícula izquierda y apriételo sosteniéndolo y tirando de los extremos con pinzas. El nudo debe atarse de manera que impida aproximadamente el 75 % del flujo sanguíneo original hacia el lado izquierdo. Corte los extremos del nudo con tijeras microquirúrgicas y retire con cuidado y deseche el exceso de sutura.Finalmente, gire el embrión de vuelta a su orientación original con el lado derecho en la parte superior. Aquí se muestran embriones en diferentes estadios cultivados ex ovo como se acaba de demostrar; un calentador de circulación de agua puede mantener las condiciones ambientales durante períodos prolongados, lo cual podría ser necesario durante aplicaciones de microcirugía y adquisición de imágenes.Los embriones de pollo cultivados X ovo son adecuados para microinyección. En este experimento, se inyectó un colorante fluorescente en la vasculatura de un embrión de pollo cultivado X ovo. Los embriones de pollo cultivados X ovo son adecuados para microcirugía.En este experimento, se realizó una ligadura auricular izquierda en un embrión de pollo cultivado ex ovo. Una vez dominada la técnica, el cultivo ex ovo de embriones de pollo puede realizarse en aproximadamente cinco minutos por embrión. Tras ver este video, se deberá tener una buena comprensión de cómo crear cultivos de embriones de pollo XO adecuados para aplicaciones de microcirugía y de obtención de imágenes, así como en aquellos casos en los que sea necesario transportar los cultivos.

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Investigación

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Biología

Este video muestra la nueva cultura, un método por el cual los embriones de pollo se cultivan fuera del huevo hasta por 24 horas. Este método le permite a uno para estudiar el desarrollo temprano (línea primitiva a 14 som.), Un período que corresponde a E7-9 en el ratón. Las aplicaciones de esta técnica incluyen la electroporación, la hibridación in situ e inmunohistoquímica.

Método para la Cultura de primeros embriones del polluelo ex vivo (Nueva Cultura)

La chica membrana corioalantoidea (CAM) es un entorno único, apoyo la cultura, naturalmente, inmunodeficientes para estudiar la angiogénesis y la tumorigénesis. Este artículo video demuestra las diferentes etapas de...

Pollo Ex ovo Cultura y Ex ovo CAM Ensayo: cómo funciona realmente

Este video muestra el cultivo ex vivo y la obtención de imágenes de cortes oculomotores de embriones de ratón transgénicos. Los embriones están aislados e incrustados en agarosa. Utilizando un vibrátomo se obtienen rodajas que contienen los núcleos oculomotores y los ojos. Las rodajas se mantienen en cultivo y se obtienen imágenes con un microscopio de fluorescencia.

Cultivo e imagen ex vivo de cortes oculomotores de embriones de ratón transgénicos

Cultivos de cortes de facilitar la manipulación del gen por el desarrollo del embrión y las perturbaciones farmacológicos. Sin embargo, las condiciones de cultivo deben garantizar que el desarrollo normal puede proceder en el entorno reducido de la rebanada. Se ilustra un protocolo que facilita el desarrollo normal de la médula espinal para continuar durante al menos 24 h.

Embriones de pollo de la Médula Espinal Slice Cultura Protocolo

La mitosis progenitoras neurales es un parámetro crítico de la neurogénesis. Gran parte de nuestra comprensión de la mitosis progenitoras neurales se basa en el análisis de tejido fijado. Formación de imágenes en vivo en rodajas de cerebro de embriones es una técnica versátil para evaluar la mitosis con alta resolución temporal y espacial en un entorno controlado.

Imágenes en vivo de la mitosis en el desarrollo de la corteza de embriones de ratón

Ver y acceder al embrión de pollo durante el desarrollo puede ser un desafío. Hemos desarrollado un método ex ovo que es simple, rentable y se puede usar fácilmente en un aula o en un entorno de investigación. Este método proporciona acceso al embrión en etapas tardías del desarrollo embrionario (HH 40).

Optimizado Ex-ovo El cultivo de embriones del polluelo a etapas avanzadas de desarrollo

Aquí, presentamos una nueva técnica para cultivar embriones de pollo ex ovo para imágenes de lapso de tiempo utilizando luz transmitida y microscopía de fluorescencia. El sándwich de papel de filtro sumergido es una variante de la técnica de portador de papel de filtrobien establecida 1 que permite el cultivo de embriones de pollo completamente sumergidos en un medio de cultivo líquido.

Un filtro de papel sumergido Sandwich para el largo plazo Ex Ovo Time-lapse de pollo temprano embriones

Este protocolo describe tres métodos sobre cómo obtener y utilizar embriones de pollo de 5 a 8 días de edad y su membrana corioalantoidea (CAM) como modelo in vivo para estudiar imágenes de ultrasonido con contraste y administración de fármacos mediada por microburbujas.

La preparación de embriones de pollo ex ovo y vasos de membrana corioalantoicos como modelo in vivo para imágenes de ultrasonido con contraste y estudios de administración de fármacos mediados por microburbujas

El objetivo general de este artículo es describir cómo realizar la inyección intracelular ovo de materiales exógenos en embriones de pollo. Este enfoque es muy útil para estudiar la biología del desarrollo de los embriones de pollo.

En Ovo Inyección intravascular en embriones de pollo

Este protocolo se desarrolló para monitorizar longitudinalmente las propiedades mecánicas del tejido de la placa neural durante la neurulación del embrión de pollo. Se basa en la integración de un microscopio Brillouin y un sistema de incubación en el escenario, lo que permite obtener imágenes mecánicas en vivo del tejido de la placa neural en embriones de pollo cultivados ex ovo .

Monitorización de la evolución mecánica del tejido durante el cierre del tubo neural de un embrión de pollo

Aprenda a cultivar embriones de pollo ex-ovo para estudios de embriogénesis con acceso óptico completo. Este método permite microinyecciones, microcirugía y transporte estéril en biología del desarrollo aviar.

Un Ex-ovo Embrión de cultivo apropiado para aplicaciones de imagen y sistema de Microcirugía

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